2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
2.2.Aûnh hưởng của cơ chất
2.2.1. Cơ chất là đường hexose (glucose hoặc fructose) Trường hợp lên men riêng lẻ glucose hoặc fructose :
Chủng tái tổ hợpZymomonas mobilis CP4 (pZB5) được nuôi cấy trong môi
trường lên men gián đoạn và liên tục có sự điều chỉnh pH với cơ chất là glucose hoặc fructose được xem là nguồn cacbon cũng như là nguồn năng lượng chủ yếu.
Bảng 11 : Thông số của quá trình lên men với cơ chất glucose hoặc fructose
Thông số Glucose Fructose
Tốc độ hấp thu đường riêng cực đại (g
đường/g tế bào.giờ ) 8.5 2.1
Tốc độ sản xuất ethanol riêng cực đại (g
ethanol/g tế bào.giờ) 4.1 1.0
Hiệu suất sinh trưởng trung bình
(g sinh khối tế bào DCM/g đường) 0.055 0.034 Giá trị hiệu suất ATP (YATP)
(g sinh khối tế bào /mol ATP) 9.9 5.1
Trường hợp lên men đồng bộ hỗn hợp glucose và fructose :
Sự kìm hãm cạnh tranh enzyme fructokinase bởi glucose được cho là một cơ chế của việcZ. mobilis ưu tiên hấp thu glucose từ hỗn hợp glucose và fructose và tích lũy fructose khi sinh trưởng trên cơ chất là sucrose. Với cùng một nồng độ trong hỗn hợp glucose và fructose thì fructose đượcZ. mobilis hấp thu chậm hơn và sự kìm hãm enzyme fructokinase bởi glucose được diễn ra mãnh liệt trong tế bào vi khuẩn. Một điều thú vị là khi bổ sung glucose vào canh trường của chủngZ. mobilis CP4-M2, một chủng thiếu enzyme glucokinase, thì sự kìm hãm trên xảy ra hoàn toàn và ngay lập tức.
Ngoài ra khi thêm một chất tương tự glucose nhưng không tham gia trao đổi chất thì cũng có những ảnh hưởng kìm hãm lên sự trao đổi chất fructose giống như vậy. Điều này chứng tỏ rằng sự cạnh tranh chuyển hóa với fructose của glucose đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sử dụng cơ chất là glucose và fructose.
Bên cạnh đó, enzyme glucose-fructose oxidoreductase xúc tác phản ứng hình thành sorbitol từ fructose, đây là một chất giúpZ. mobilis chịu được áp suất thẩm thấu trong môi trường có nồng độ đường cao.
Hình 14 : Cơ chế tích lũy và chuyển hóa glucose và fructose ởZ. mobilis
2.2.2. Cơ chất là hỗn hợp glucose - xylose
Tốc độ sinh trưởng, sử dụng cơ chất riêng, cũng như sản lượng sinh khối và sản xuất ethanol trên cơ chất là xylose của chủng Zymomonas mobilis ZM4
(pZP5) tái tổ hợp thấp hơn trên cơ chất là glucose hoặc hỗn hợp glucose – xylose. Quan sát sự lên men điển hình của chủng ZM4 (pZB5) trên cơ chất là hỗn hợp glucose – xylose, ta thấyZ. mobilis hấp thu đường glucose trước, còn xylose thì được hấp thu sau với tốc độ chậm hơn và có sự trao đổi chất không đồng bộ sau khi glucose đã được sử dụng hết.
Tốc độ và hiệu suất trao đổi chất trên xylose giảm được giải thích là do nhiều nguyên nhân như :
Trao đổi chất thay đổi do duy trì chức năng liên quan đến plasmid. Tạo ra một số sản phẩm phụ như : xylitol, acetate, lactate, acetoin và
dihydroxyacetone.
Nhưng ngày nay, nhiều chủng Z. mobilis kỹ thuật có thể chuyển xylose
thành ethanol bằng cách kết hợp cách sử dụng 2 con đường trao đổi chất Entner- Doudoroff và pentose pathways nhờ việc cấy ghép hệ thống các enzyme xylose isomerase và xylulokinase trong việc tích lũy xylose và các enzyme transketolase và transaldolase trong cơ chế trao đổi chất pentose.
Hình 15 : Sự lên men của chủng tái tổ hợp ZM4 (pZB5) trên các cơ chất khác nhau
A : sử dụng xylose (60.5g/l) B : sử dụng glucose (64.8g/l) C : sử dụng hỗn hợp glucose (60g/l) và xylose (61.5g/l) ●- Xylose; - glucose; ■- ethanol; - sinh khối.
Hình 16 : Sự tạo thành ethanol, sinh khối và sản phẩm phụ của chủng tái tổ hợp ZM4 (pZB5) trên các cơ chất khác nhau
A : sử dụng xylose (27.5g/l)
B : sử dụng hỗn hợp glucose (26.8g/l) và xylose (32g/l) ●- Xylose;- glucose;■- ethanol; - sinh khối.
Bảng 12 : Thông số động học củaZ. mobilis ZM4 (pZB5) trên môi trường có chứa xylose, glucose hoặc hỗn hợp glucose-xylose
Nồng độ xylose (g/l) Nồng độ glucose (g/l) Nồng độ hỗn hợp glucose – xylose (g/l) Thông số
động học
27.8 40.3 60.5 27.5 64.8 26.8–32.0 60.0–61.5
b-Trao đổi chất glucose/ xylose
μmax (h−1)a 0.13 0.12 0.11 0.43 0.42 0.42 0.22 qmax,glucose (g/g/h) 9.34 10.63 9.10 8.60 qmax,xylose (g/g/h) 3.06 3.24 3.38 2.49 1.41 qmax,p (g/g/h) 1.39 1.37 1.40 4.48 5.11 4.73 4.62
Trao đổi chất xylose
qs (g/g/h) 3.01 2.13 qp (g/g/h) 1.36 0.91 Tổng hiệu suất Yx/s (g/g) 0.019 0.014 0.010 0.036 0.027 0.031 0.015 μmax (h−1)a 0.45 0.42 0.41 0.48 0.47 0.46 0.46 Chú thích :aμ
max(h−1), tốc độsinh trưởng riêng cực đại qs (g/g/h), lượng cơ chất hấp thu riêng qp (g/g/h), tốc độ sản xuất ethanol riêng Yx/s (g/g), hiệu suất sinh tổng hợp sinh khối Yp/s(g/g), hiệu suất sinh tổng hợp ethanol
b –Thông số động học cho pha sử dụng xylose sau khi glucose đã được sử dụng hết trong suốt quá trình đồng lên men hỗn hợp glucose – xylose.
Bảng 13 : Sự hình thành các sản phẩm phụ và phần trăm ATP mất đi của chủng
Z. mobilis ZM4 (pZB5) trên môi trường xylose, glucose hoặc hỗn hợp glucose – xylose. Nồng độ xylose (g/l) Nồng độ glucose (g/l) Nồng độ hỗn hợp glucose – xylose (g/l) Sản phẩm (g/l) 27.8 40.3 60.5 27.5 64.8 26.8– 32.0 60.0– 61.5 Ethanol 12.6 17.0 25.1 13.3 30.5 27.0 55.7 Xylitol 1.37 2.68 4.86 0 0 0.45 0.91 Dihydroxyacetone 0.68 1.34 2.10 0 0.14 0.25 0.88 Glycerol 0.36 0.80 1.26 0 0.10 0.14 0.45 Acid acetic 0.47 0.67 1.21 0.08 0.17 0.23 0.68 Acetoin 0.12 0.15 0.18 0.22 0.32 0.25 0.52 Acid lactic 0.017 0.016 0.022 0.008 0.014 0.022 0.035 Mức ATP cực đại lý thuyết (mmol)a 185.2 268.5 403.1 152.6 359.6 361.9 742.7 Mức ATP mất đi (mmol)b 32.0 64.8 106.4 0 5.3 11.6 35.3 % ATP mất 17.3 24.1 26.4 0 1.5 3.2 4.8
aNồng độ đường được chuyển thành đơn vị micromoles/lít bằng cách chia nồng độ xylose (g/l) cho 0.15 và chia nồng độ đường glucose (g/l) cho 0.18.
b Số ATP mất đi do sự hình thành các sản phẩm phụ được tính toán dựa trên nồng độ của dihydroxyacetone, glycerol và xylitol trong suốt quá trình lên men.
2.2.3. Cơ chất là arabinose :
Chủng vi sinh vật có thể chuyển hóa nhanh và hiệu quả các đường D- xylose và L-arabinose, các đường này thường được tìm thấy trong hemicellulose tách ra từ nguyên liệu lignocellulose. Các chủng vi sinh vật kỹ thuật có thể sinh trưởng và sản xuất ethanol từ arabinose với hiệu suất 98% so với lý thuyết chứng tỏ rằng arabinose được chuyển hóa hầu như hoàn toàn. Sự lên men hiệu quả L- arabinose thành ethanol đạt được nhờ sự kết hợp con đường pentose photphat và Entner-Doudoroff. Nhìn chung, phản ứng tổng quát cho ta thấy 3 mol L-arabinose được chuyển hóa thành 5 mol ethanol :
Hiệu suất ethanol lý thuyết là 0.51 g ethanol/ g L-arabinose hoặc 1.67 mol ethanol/ mol L-arabinose. Do có ít cơ chất được sử dụng cho hình thành sinh khối, sản xuất ethanol từ việc lên men L-arabinose với loàiZ. mobilis kỹ thuật thì hiệu
quả hơn bất kỳ chủng vi sinh vật nào khác và cũng có giá trị tương đương với việc lên men từ D-xylose.
Mặc dù hiệu suất ethanol lý thuyết dựa trên lượng đường hấp thu là gần bằng nhau trên cả 2 môi trường hoặc chỉ có arabinose hoặc hỗn hợp glucose và arabinose nhưng arabinose vẫn không được hấp thu hoàn toàn, nguyên nhân có thể là do sự giảm pH trong quá trình lên men không chỉnh pH. Trong môi trường hỗn hợp glucose – arabinose, pH cuối cùng khoảng 4.6, còn trong môi trường chỉ có arabinose thì pH cuối cùng là 4.9. Nồng độ arabinose dư cao hơn trong môi trường hỗn hợp là do sự kìm hãm hấp thu arabinose của pH thấp. Có hơn 27g/lít ethanol được sản xuất ra trong môi trường có nồng độ glucose và arabinose ban đầu cao với pH = 5.25.
Như vậy trong hỗn hợp glucose và arabinose, arabinose được hấp thu với tốc độ chậm hơn nhiều so với glucose và chỉ có glucose là gần như cạn kiệt. ỞZ. mobilis, glucose được vận chuyển nhờ ái lực yếu, tốc độ cao, cơ chế khuếch tán
glucose xúc tiến (glucose-facilitated diffusion - Glf), không tiêu hao năng lượng. Cơ chế này có giới hạn cơ chất hẹp và bị kìm hãm cạnh tranh bởi một chất tương tự như D-xylose. Những nghiên cứu gần đây cho rằng đây là cơ chế khuếch tán chủ yếu, quan trọng cần cho sự vận chuyển glucose và fructose. Vì thế đây là lý do cho rằng L-arabinose cũng được vận chuyển bằng cơ chế này nhưng nó rất dễ bị ảnh hưởng bởi nồng độ glucose cao. Do bị kìm hãm cạnh tranh bởi glucose nên arabinose sẽ bị hấp thu chậm hơn, cho nên khi glucose cạn kiệt, arabinose sẽ được hấp thu nhanh chóng ngay sau đó.
2.3. Aûnh hưởng của các môi trường khác nhau2.3.1. Môi trường tổng hợp : 2.3.1. Môi trường tổng hợp :
Môi trường tổng hợp bao gồm : sucrose, dịch chiết nấm men, ammonium sulphate, potassium dihydrogen ortho photphat và magnessium photphat. Hình 14 và bảng 15 dưới đây cho thấy các thông số của quá trình lên men của 4 chủngZ. mobilis ở các điều kiện tối ưu trong môi trường tổng hợp. Chủng NRRLΒ 4286 và IFO 13756 thể hiện hiệu suất lên men thấp trong 12 giờ đầu nhưng sau đó lại cao hơn so với các chủng khác (ATCC 10988 và ATCC 12526).
Nhưng IFO 13756 nhanh chóng lên men sau 12 giờ và kết thúc sau 48 giờ rồi sau đó nồng độ ethanol giảm dần. Điều này được giải thích là do sự oxy hóa
ethanol thành acid acetic (Belaich và Senez, 1965; Swings và De Ley, 1977). Trong 4 chủng thuộc loàiZ. mobilis NRRLΒ 4286 thể hiện hiệu quả lên men cao nhất trong môi trường tổng hợp. Sức sản xuất ethanol riêng của chủng này đạt cực đại và đạt cực tiểu với chủng ATCC 10988.
Hình 17 : Lên men ethanol trên môi trường tổng hợp với chủngZ. mobilis
2.3.2. Môi trường nước mía :
Môi trường nước mía cũng được chuẩn bị như môi trường tổng hợp với nồng độ đường khử trong nước mía khoảng 18% (w/v). Hình 15 và bảng 15 thể hiện các thông số của quá trình lên men của 4 chủngZ. mobilis trên môi trường nước mía. Chủng NRRL Β 4286 lên men tốt trong môi trường tổng hợp nhưng lại lên men kém hơn trong môi trường nước mía so với các chủng khác. Chủng này thể hiện sự trì hoãn trong 12 giờ đầu, còn các chủng khác thì không có. Chủng ATCC 10988 lên men nhanh chóng và dừng hẳn sau 48 giờ, đạt hiệu suất 82–94% ethanol. Theo báo cáo của Lyness và Doelle (1981) thì hiệu suất ethanol được lên men với chủng
Z. mobilis đạt 60–88 % trong 20 -29 giờ. Với chủng ATCC quá trình lên men kéo dài 66 giờ đạt hiệu suất 10.3% ethanol.
Hình 18 : Lên men ethanol trên môi trường nước mía với chủngZ. mobilis
2.3.3. Môi trường mật rỉ :
Mật rỉ là một nguồn cơ chất công nghiệp có chứa sucrose và lượng muối đáng kể. Theo Rogers và cộng sự (1982), có khoảng 2% nguồn cacbon chuyển hóa thành sinh khối. Các thành phần ổn định chính của pH là các acid yếu và các acid amin hoạt động ở pH 3 và 5, hoặc các muối photphat có tác dụng như chất đệm chỉnh pH 6 và 7.Z. mobilis có thể chịu được giới hạn pH rộng từ 3.5 đến 7.5, tối
ưu là khoảng 5.0 – 7.0.
Điều kiện tốt nhất để sản xuất ethanol là nồng độ đường khử trong mật rỉ khoảng 200g/lít, 30oC, canh trường tĩnh và thời gian lên men là 48 giờ. Mật rỉ là một sản phẩm phụ của nền công nghiệp đi từ nguyên liệu trong nông nghiệp, thường được sử dụng trong các nhà máy rượu nhờ thành phần có chứa các đường lên men và đây là nguồn cacbon tốt cho trao đổi chất ở vi sinh vật. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol giảm ở nồng độ đường cao do có sự gia tăng áp suất thẩm thấu, mà đây là nhân tố quan trọng để hình thành các sản phẩm phụ như : sorbitol và levan.
Môi trường mật rỉ được chuẩn bị bằng cách pha loãng mật rỉ theo yêu cầu. Bảng14 thể hiện lên men ethanol với chủng Z. mobilis trên cơ chất mật rỉ với nồng độ đường ban ban đầu 10% (w/v). Các chủng ATCC 10988 (3.05% v/v) vàNRRL Β 4286 (3.29 % v/v) thể hiện sức sản xuất cực đại trong khi IFO 13756 thể hiện sức sản xuất cực tiểu (1.97 % v/v).
Bảng 14 : Lên men ethanol ở các nồng độ đường ban đầu khác nhau với cơ chất là mật rỉ với chủngZ. mobilis ATCC 10988
Bảng 14 cho thấy năng suất sản xuất ethanol đạt cực đại (3.35%, v/v) với nồng độ đường ban đầu 15% (w/v), lúc này sự hấp thu cơ chất đạt cực đại (42% w/v). Còn với nồng độ đường ban đầu của mật rỉ trên 15% (w/v) thì sự lên men ethanol giảm dần. Nhìn chung, với tất cả 4 chủng thuộc loàiZ. mobilis là ATCC 10988, ATCC 12526, NRRL B 4286 và IFO 13756, khả năng sản xuất ethanol từ mật rỉ của chúng rất kém so với các cơ chất khác. Điều này có thể giải thích là do nồng độ cao cuả các ion Mg2+và K+ có trong mật rỉ gây ức chế một phần quá trình lên men (Skotnicki và cộng sự, 1982).
Bảng 15 : Lên men ethanol với các loại môi trường khác nhau với chủngZ. mobilis
2.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose :
Môi trường phổ biến nhất được sử dụng trong việc kiểm tra khả năng lên men ethanol của Z. mobilis là môi trường glucose với dịch chiết nấm men, ammonium sulfate và magnesium sulfate (Karsch và cộng sự 1983, Struch và cộng sự 1991, Agrawal vàVeeramallu 1990, Oaxaca and Jones 1991, Falcao de Morais và cộng sự 1993, Nowak and Roszyk 1997, Rios và cộng sự 1991).
Người ta tiến hành so sánh sản lượng ethanol tạo thành bởi 2 chủng thuộc loàiZ. mobilis trên môi trường glucose với nồng độ glucose thay đổi từ 100 – 250
g glucose/ lít. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol dao động trong khoảng 91.8 – 96% so với hiệu suất lý thuyết và hàm lượng glucose sử dụng cao hơn ứng với cả 2 chủng ngay cả trong điều kiện nồng độ đường cao.Z. mobilis có hệ thống khuếch tán xúc tiến nên có khả năng cân bằng nhanh chóng nồng độ glucose nội bào và ngoại bào.
Bảng 16 : Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol và sử dụng glucose bởi 2 chủng thuộc loàiZ. mobilis trong lên men tĩnh
(30oC, thời gian lên men 48 giờ và 72 giờ cho nồng độ glucose là 250g/l)
Chủng Glucose (100g/l) Glucose (150g/l) Glucose (200g/l) Glucose (250g/l)
Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng 3881 93.8a 98.2 91.8a 98.5 93.6a 97.9a 95.9 91.2a 3883 94.3b 98.5 93.4b 98.6 94.2b 99.0b 96.0 98.2b
2.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu :
Để tìm ra pH tối ưu cho sự lên men ethanol với loàiZ. mobilis , pH ban đầu
của môi trường lên men được chỉnh ở những giá trị khác nhau và tiến hành quá trình lên men trong 72 giờ. Kết thúc quá trình này, các mẫu được thu lại và ước lượng nồng độ ethanol và nồng độ đường sót.
Bảng 17 cho thấy ảnh hưởng của pH ban đầu lên các thông số lên men của các chủngZ. mobilis khác nhau. Ta thấy hiệu quả lên men đạt cực đại ở pH 7 và
thấp nhất ở pH 4, chứng tỏ nếu gia tăng pH ban đầu thì sự hấp thu cơ chất và hiệu quả lên men cũng tăng. Do đó pH tối ưu cho sự lên men ethanol với chủng Z. mobilis được chọn là 7.
Bảng 17 : Aûnh hưởng của pH ban đầu lên sản xuất ethanol ứng với các chủngZ. mobilis khác nhau
2.6. Aûnh hưởng của ion Na+ và ion Cl-
Nhược điểm của tất cả các loàiZ. mobilis là khả năng kháng cự đối với các ion vô cơ (Rogers và cộng sự. 1984), các ion vô cơ này lại thường xuyên có trong các nguồn nguyên liệu công nghiệp như rỉ đường và các sản phẩm thủy phân của lignocellulose với nồng độ có thể gây kìm hãm (Binkley và Wolfrom 1953; Ranatunga và cộng sự. 2000).
Nhiều tác giả đã báo cáo rằng hiệu suất ethanol giảm khi có mặt của các muối Na và Ca (Bajpai và Margaritis 1984; Fein và cộng sự. 1984; Spangler và Emert 1986; Stevnsborg và Lawford 1986; Kirk và Doelle 1992; Sreekumar và Basappa 1992; Vigants và cộng sự. 1998). NaCl và KCl làm giảm tốc độ hấp thu