3.1. Vi khuẩn tự do :
Khả năng kết bông củaZ. mobilis :
Đứng về mặt công nghiệp, khả năng kết bông của vi sinh vật là một đặc tính rất hữu ích, giúp ta dễ dàng tách tế bào và tái sử dụng tế bào trong khi vẫn đạt được nồng độ sinh khối và hiệu suất sinh tổng hợp ethanol cao.
Đặc tính này còn giúp tế bào vi khuẩn Z. mobilis kháng cự với các tác nhân kìm hãm như acid acetic và với các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH… So với bông tụ của nấm men, bông tụ củaZ. mobilis có thể chịu được điều kiện pH cao hơn (pH 6).
Các polyme nhân tạo như polyarcylamide, polyethylenimine và chitosan hoặc các đại phân tử ngoại bào như polysaccharide và protein được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn có thể kết bông.
Z. mobilis còn có thể sản xuất ra polysaccharide (như levan, cellulose).
Những chủngZ. mobilis này có hiệu suất chuyển hóa glucose và fructose cao (gần 96%) và năng suất ethanol đạt cực đại ở độ pha loãng 0.9 – 1.8h-1. Mật độ tế bào trong thiết bị cao giúp vi khuẩn đạt được hiệu suất sinh tổng hợp ethanol cao. Ngoài ra, những chủng này còn có thể chịu được độ pha loãng cao gấp vài lần và thể hiện năng suất sản xuất cao hơn các chủng cha mẹ.
Hình 23 : Hình ảnhZymomonas mobilis ở trạng thái đơn lẻ và kết bông 3.1.1. Lên men gián đoạn
Lên men gián đoạn : là quá trình lên men không bổ sung bất kỳ chất gì vào hệ thống sau khi đã cấy giống vào bồn phản ứng ngoại trừ dung dịch acid hoặc kiềm để chỉnh pH hoặc sục không khí vào nếu là lên men hiếu khí. Chúng tôi không tìm thấy tài liệu về việc ứng dụng lên men ethanol với Z. mobilis bằng phương pháp lên men gián đoạn.
3.1.2. Lên men liên tục
Lên men liên tục là quá trình lên men mà môi trường dinh dưỡng mới được thêm vào liên tục và sản phẩm được tháo ra liên tục với cùng vận tốc nhằm đảm bảo dung tích làm việc không đổi của hệ thống.
Dòng chất dinh dưỡng nhập liệu vào bồn lên men thường gồm các cơ chất hữa cơ, còn dòng sản phẩm tháo ra khỏi bồn lên men thường gồm sinh khối và pha
một phần sinh khối bị tách ra khỏi pha lỏng trong bồn lên men thì dòng ra chứa lượng sinh khối hoặc pha lỏng nhiều hay ít sẽ phụ thuộc vào vị trí tháo liệu.
Quá trình lên men có thể tiến hành có kết hợp hoặc không kết hợp với sự tái sử dụng tế bào. Lên men liên tục có tái sử dụng tế bào có nghĩa là tách những tế bào nấm men hoặc vi khuẩn từ dòng ra của sản phẩm sau đó cho chúng trở lại vào bồn lên men nhằm giảm thiểu sự tổn thất của tế bào.
Việc tái sử dụng tế bào sẽ giúp gia tăng năng suất của hệ thống nhờ có mật độ tế bào ở trạng thái ổn định hơn. Dòng sản phẩm tháo ra khỏi thiết bị vừa chứa ethanol vừa chứa tế bào. Việc tách riêng tế bào và pha lỏng có chứa ethanol được thực hiện bằng phương pháp vi lọc hoặc ly tâm, sau đó tế bào được hồi lưu trở lại bồn lên men. Kết quả là làm giảm nồng độ sinh khối trong bồn lên men và nồng độ chất khô trong tế bào, từ đó dẫn đến ethanol được thu hồi dễ dàng hơn.
Những chủng Z. mobilis thích hợp cho quá trình : ATCC 10988, ATCC 29191, ATCC 31821, ATCC 31823, NRRL B-14023 [CP 4], NRRL B-14022 [CP 3]. Ngoài ra, một số chủng có thể kết bông như : ATCC 35001 [ATCC 29191], ATCC 35000 [NRRL B-14023], ATCC 31822 [ATCC 31821] và NRRL B-12526 [ATCC 10988].
Vận tốc dòng nhập liệu phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của thiết bị, nồng độ sinh khối và tốc độ hấp thu cơ chất. Nồng độ tế bào trong bồn lên men phụ thuộc vào các yếu tố như: độ pha loãng, nồng độ cơ chất, tốc độ sinh trưởng cực đại và hiệu suất sinh trưởng. Nồng độ ethanol cần đưa lên giá trị cực đại trong thiết bị nhằm giảm chi phí thu hồi ethanol.
Điều kiện tiến hành :
Nhiệt độ lên men trong thiết bị khoảng 27 – 37oC.
Điều kiện kỵ khí phải được đảm bảo nghiêm ngặt. Nhờ khả năng kết bông, vi khuẩn sẽ nhanh chóng lắng xuống đáy thiết bị. Nhằm đuổi hết oxy trên bề mặt môi trường lên men và duy trì điều kiện kỵ khí ta có thể sục một dòng khí trơ vào thiết bị.
pH có thể giảm hoặc tăng trong quá trình lên men. Để hạn chế pH thay đổi cần bổ sung chất đệm vào môi trường hoặc chỉnh pH môi trường bằng dung dịch kiềm hoặc acid (vô cơ, hữu cơ). Tác nhân đệm hoặc chỉnh pH yêu cầu phải không độc và không gây ức chế vi khuẩn . Ví dụ dung dịch chỉnh pH có thể sử dụng như : KOH, NaOH hoặc HCl.
Đảm bảo các điều kiện khử trùng đầy đủ nhằm giúp vi sinh vật tồn tại và trao đổi chất. Có thể sử dụng các phương pháp khử trùng như : nhiệt hoặc vi lọc. Cần phải có sự chọn lọc kỹ càng chủng vi sinh vật và chế độ khử trùng thích hợp
dụng phương pháp lọc membrane đối với dòng lỏng có chứa vitamin và các phân tử phức tạp. Chế độ xử lý bằng nhiệt được xem là thích hợp nhất cho dòng cơ chất nhập liệu và có thể thực hiện bằng những ống dẫn hơi hoặc nước nóng trong các thiết bị lên men liên tục hoặc gián đoạn. Nhiệt độ phải đủ cao để tiêu diệt các vi sinh vật gây hại. Nước sử dụng cho chuẩn bị dung dịch cơ chất và môi trường lên men phải được tiệt trùng cẩn thận.
Thiết bị lên men :
Quá trình lên men được tiến hành trong các loại bình phản ứng như thiết bị chemostat, tháp lên men hoặc các bình phản ứng cố định tế bào. Thích hợp nhất là các bồn lên men liên tục có cánh khuấy. Môi trường lên men sẽ được khuấy trộn bằng cánh khuấy với tốc độ vừa đủ để phân phối và hoà trộn đều vi khuẩn vào môi trường, tránh khuấy quá mạnh sẽ làm phá vỡ các tế bào vi khuẩn hoặc làm ức chế sự trao đổi chất.
Sử dụng thiết bị lên men tầng sôi (Fluidized Bed Reactor)
FBR được sử dụng cho sản xuất ethanol liên tục đạt nồng độ ethanol 58 – 60g/l với năng suất sản xuất ethanol là 28g/l.h trong 30 ngày. Ethanol được sản xuất bằng cách lên men các hợp chất đường từ các sản phẩm công nghiệp hoặc vật liệu phế thải từ thực vật và cần phải quan tâm đến kinh tế và sự tiêu thụ năng lượng mà bất kỳ hệ thống nào được chọn. Trước đây nguời ta còn sử dụng thiết bị FBR trong sản xuất ethanol từ glucose bằng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn
Zymomonas mobilis .
Bảng 21 : Cân bằng vật chất cho 1 mẻ lên men trong 283 giờ
Hình 24: Kết bông của tế bào vi khuẩnZ. mobilis trong thiết bị lên men FBR
Hình 25 : Sơ đồ lên men
1- bơm nhập liệu,
2- dòng hơi tuần hoàn khép kín, 3- dòng ra và dòng vào của nước làm nguội
Hình 26 : Hệ thống bồn lên men
1 và 2: bơm nhu động 3 : ống dẫn sản phẩm ra 4: bộ phận trao đổi nhiệt
Hình 27 : Mô hình thiết bị lên men liên tục FBR có tái sử dụng tế bàoZ. mobilis
Hình 28 : Thiết bị lên men liên tục vớiZ. mobilis trên thực tế 3.1.3. Lên men bán liên tục
Với phương pháp này, tế bào sẽ kết bông và lắng xuống đáy thiết bị, ethanol được tháo ra và một dòng môi trường mới sẽ được cho vào thiết bị lên men một cách định kỳ. Sự tháo sản phẩm định kỳ được thực hiện nhờ lớp chất lỏng nổi trên bề mặt có chứa ethanol. Một số lượng tế bào sẽ được giữ lại trong thiết bị với
thể lắng xuống đáy thiết bị một cách nhanh chóng cho phép tháo dòng lỏng nổi trên bề mặt dễ dàng mà vẫn đảm bảo giữ được số lượng tế bào vi khuẩn đáng kể trong thiết bị. Quá trình được thực hiện nhanh chóng và giảm được chi phí cho thiết bị.
Một số chủng có thể kết bông như : ZM401 (ATCC 31822), CP4 (ATCC 31821), ZM481 (ATCC 31823)…
Ban đầu hỗn hợp trong thiết bị sẽ được khuấy đảo nhẹ nhàng nhờ cánh khuấy nhằm giúp phân bố đều tế bào vi khuẩn trong môi trường. Sau khi sự lên men bắt đầu, sự khuấy đảo này được hỗõ trợ bởi khí CO2 thoát ra. Sau khi kết thúc quá trình lên men, cánh khuấy được tắt, tiến hành tháo sản phẩm và bổ sung môi trường mới vào thiết bị. Dòng lỏng tháo ra có chứa ethanol sẽ được đem đi tinh sạch và chưng cất để thu hồi ethanol tinh khiết. Thể tích dòng lỏng có chứa ethanol nổi trên bề mặt có thể chiếm từ 60 – 90% thể tích của môi trường lên men. Môi trường sinh trưởng : 150 g/l glucose, 10 g/l dịch chiết nấm men (Oxoid), 1 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0.5 g/l MgSO4.7H2O.
Điều kiện môi trường : pH=5.0, T=30oC. Thể tích bồn lên men : 2lít
Khoảng 95 -99% tế bào vi khuẩn được giữ lại trong thiết bị sau khi tháo sản phẩm.
3.2. Vi khuẩn cố định :3.2.1. Lên men gián đoạn : 3.2.1. Lên men gián đoạn :
Chúng tôi không tìm thấy tài liệu về ứng dụng phương pháp này trong lên men ethanol bằngZ. mobilis.
3.2.2. Lên men liên tục – cố định tế bào vi khuẩnZ. mobilis trong cấu trúc ion gel:
Ion gel là một loại gel có cấu trúc mạng lưới được hình thành từ những liên kết ion. Chất mang thường sử dụng cho lên men ethanol với vi khuẩnZymomonas mobilis là gel alginate.
Tiến hành cố định tế bào trong gel alginate như sau:
•Hòa tan natri alginate vào nước cất, khuấy cho đến khi natri alginate tan hoàn toàn, thu được dung dịch có nồng độ natri alginate có thể từ 0,5-8% tùy thuộc vào độ nhớt của loại alginate sử dụng.
•Cho vào dung dịch trên một lượng tế bào vi khuẩn đã xác định trước và khuấy đều.
•Nhỏ dung dịch này vào dung dịch CaCl2 2%. Để quá trình tạo gel diễn ra ổn định, dung dịch CaCl phải được khuấy trộn liên tục. Gel được tạo thành ở nhiệt
độ phòng ngay khi dung dịch natri alginate được nhỏ vào dung dịch CaCl2. Khoảng cách để nhỏ thích hợp nhất là 10 cm. Để tạo hạt có kích cỡ từ 0,5- 2 mm, có thể dùng kim hoặc ống tiêm. Hạt tạo thành sẽ cứng từ 1-2 giờ. Sau đó hạt sẽ được rửa sạch bằng nước vô khuẩn trước khi cho vào môi trường lên men.
Nếu ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 trong thời gian dài thì có thể sẽ làm giảm hoạt tính sinh học của chúng.
Khi cần kiểm tra hiệu suất cố định tế bào trong gel cũng như tỉ lệ rửa trôi tế bào khỏi hạt alginate sau khi sử dụng, người ta thực hiện việc giải phóng tế bào ra khỏi hạt gel bằng cách khuấy trộn hạt gel với tác nhân thích hợp như EDTA hay hexametaphosphate Natri.
Một số thiết bị tạo hạt thường được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật hiện nay được giới thiệu sơ lược như sau:
Hình 29 : Một số thiết bị tạo hạt trong quy mô công nghiệp.
Thiết bị : FBR (Fluidized Bed Reactor)
Nhiệt độ 30oC được duy trì ổn định trong thiết bị bằng dòng nước làm nguội bên ngoài lớp vỏ áo. pH = 5 được chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.5M.
Hinh 30 : Mô hình thiết bị lên men liên tục FBR
Ưu điểm of phương pháp :
Các thao tác thực hiện cố định tế bào tương đối đơn giản.
Chất mang sử dụng để cố định tế bào trong ion gel là loại polymer sinh học phong phú, có khả năng phân huỷ sinh học, dễ tìm.
Nhược điểm của phương pháp :
Bất lợi chính của việc sử dụng hạt gel Calcium – alginate là chúng rất dễ bị phá vỡ bởi những chất hoá học có khả năng càng hoá ion Ca2+.
Một nhược điểm khác của phương pháp cũng chính là chất mang sử dụng. Những loại chất mang polymer sinh học như alginate thường có độ bền cơ học và hoá học kém.
3.2.3. Lên men liên tục – cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non – covalent gel:
Một loại cấu trúc khác của hệ thống gel là non – covalent gel. Cấu trúc này có thể được hình thành từ loại liên kết thường gặp là liên kết hydro.
Phương pháp cố định này hoàn toàn tương tự với phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc covalent gel. Tuy nhiên mạng lưới trong cấu trúc gel cố định tế bào vi sinh vật trong phương pháp này không nhất thiết được hình thành từ những liên kết cộng hoá trị mà có thể do nhiều loại liên kết khác tạo ra.
Với phương pháp này, người ta thường cố định tế bào vi khuẩn trên chất mang là – carrageenan. Gel – carrageenan thể hiện hiệu quả phân huỷ sinh học thấp hơn gel alginate. Điều này có thể giải thích dựa trên cấu trúc lỗ xốp khác nhau của những chất mang này có thể gây những hạn chế đối với sự phát triển của
ammonia hơn. Ngoài ra, khi so sánh với gel alginate, gel – carrageenan có tỉ lệ tế bào bị rửa trôi vào môi trường khá nhiều.
Bảng 23: So sánh kết quả sản xuất ethanol của các hệ thống cố định Hệ thống
cố định Nồng độ đường(g/L) % đườngsử dụng Nồng độ ethanolcực đại (g/L.h)
Z. mobilis
Ca-alginate Glucose 150 75 44
Z. mobilis
- carrageenan Glucose 150 85 53
Z. mobilis
kết bông tế bào Glucose 100 - 120
Hình 31 : Hình dạng của các hạt gelκ-carrageenan cố định tế bào vi khuẩn
Zymomonas mobilis từ lúc ban đầu và qua nhiều giờ lên men
3.2.4. Lên men liên tục – cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc cryogel:
Cryogel là một cấu trúc gel polymer mới. Việc nghiên cứu và tạo ra những cấu trúc mới như cryogel góp phần làm kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật đa dạng hơn. Chất mang điển hình sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc cryogel là polyvinyl alcohol (PVA).
Quá trình hình thành polyvinyl alcohol – cryogel: dung dịch gồm 20% (theo khối lượng) polyvinyl alcohol (khối lượng phân tử trung bình 115.000) trong dung dịch H2SO4 50mM với dung dịch Fe(NH4)2(SO4)3 0.4mM và xylenol orange (FX). Lạnh đông dung dịch ở -20oC sau đó đưa về nhiệt độ phòng. Từ đó, ta thu được phân tử polyvinyl alcohol – cryogel. Một chu kỳ của quá trình xử lý lạnh đông bao
Tiến hành cố định tế bàoZ. mobilis trong polyvinyl alcohol – cryogel :
Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thích hợp, ta tiến hành ly tâm canh trường để thu nhận huyền phù sinh khối tế bào vi sinh vật. Lượng sinh khối tế bào thu được sẽ được trộn lẫn với dung dịch polyvinyl alcohol. Dung dịch polyvinyl alcohol được tạo thành khi đem polyvinyl alcohol hoà tan vào dung dịch nước với một nồng độ thích hợp (10% - 20%). Hỗn hợp của dung dịch polyvinyl alcohol và huyền phù tế bào sau khi trộn sẽ được đưa đi xử lý lạnh đông – rã đông. Sau khi rửa, các hạt polyvinyl alcohol – cryogel chứa tế bào vi sinh vật cố định đã sẵn sàng để đưa vào sử dụng. Đối với những tế bào được cố định trong loại gel có lỗ xốp lớn này, việc khuếch tán cơ chất vào tế bào hay việc thải những sản phẩm trao đổi chất từ tế bào ra môi trường sẽ được thực hiện dễ dàng hơn.
Ưu điểm của phương pháp:
Đầu tiên có thể thấy, đây là một phương pháp cố định tế bào có thao tác thực hiện tương đối đơn giản.
Quá trình polymer hoá tạo gel không sử dụng các tia bức xạ UV, một thành phần được xem là rất nguy hiểm đối với các tế bào sống. Hầu hết các tế bào có thể bảo tồn khả năng sống sót rất cao trên chất mang cryogel và duy trì hoạt tính trong một thời gian rất dài.
Hơn nữa, tế bào vi sinh vật không bị ức chế bởi không có sự can thiệp của