2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
2.3.Aûnh hưởng của các môi trường khác nhau
Môi trường tổng hợp bao gồm : sucrose, dịch chiết nấm men, ammonium sulphate, potassium dihydrogen ortho photphat và magnessium photphat. Hình 14 và bảng 15 dưới đây cho thấy các thông số của quá trình lên men của 4 chủngZ. mobilis ở các điều kiện tối ưu trong môi trường tổng hợp. Chủng NRRLΒ 4286 và IFO 13756 thể hiện hiệu suất lên men thấp trong 12 giờ đầu nhưng sau đó lại cao hơn so với các chủng khác (ATCC 10988 và ATCC 12526).
Nhưng IFO 13756 nhanh chóng lên men sau 12 giờ và kết thúc sau 48 giờ rồi sau đó nồng độ ethanol giảm dần. Điều này được giải thích là do sự oxy hóa
ethanol thành acid acetic (Belaich và Senez, 1965; Swings và De Ley, 1977). Trong 4 chủng thuộc loàiZ. mobilis NRRLΒ 4286 thể hiện hiệu quả lên men cao nhất trong môi trường tổng hợp. Sức sản xuất ethanol riêng của chủng này đạt cực đại và đạt cực tiểu với chủng ATCC 10988.
Hình 17 : Lên men ethanol trên môi trường tổng hợp với chủngZ. mobilis
2.3.2. Môi trường nước mía :
Môi trường nước mía cũng được chuẩn bị như môi trường tổng hợp với nồng độ đường khử trong nước mía khoảng 18% (w/v). Hình 15 và bảng 15 thể hiện các thông số của quá trình lên men của 4 chủngZ. mobilis trên môi trường nước mía. Chủng NRRL Β 4286 lên men tốt trong môi trường tổng hợp nhưng lại lên men kém hơn trong môi trường nước mía so với các chủng khác. Chủng này thể hiện sự trì hoãn trong 12 giờ đầu, còn các chủng khác thì không có. Chủng ATCC 10988 lên men nhanh chóng và dừng hẳn sau 48 giờ, đạt hiệu suất 82–94% ethanol. Theo báo cáo của Lyness và Doelle (1981) thì hiệu suất ethanol được lên men với chủng
Z. mobilis đạt 60–88 % trong 20 -29 giờ. Với chủng ATCC quá trình lên men kéo dài 66 giờ đạt hiệu suất 10.3% ethanol.
Hình 18 : Lên men ethanol trên môi trường nước mía với chủngZ. mobilis
2.3.3. Môi trường mật rỉ :
Mật rỉ là một nguồn cơ chất công nghiệp có chứa sucrose và lượng muối đáng kể. Theo Rogers và cộng sự (1982), có khoảng 2% nguồn cacbon chuyển hóa thành sinh khối. Các thành phần ổn định chính của pH là các acid yếu và các acid amin hoạt động ở pH 3 và 5, hoặc các muối photphat có tác dụng như chất đệm chỉnh pH 6 và 7.Z. mobilis có thể chịu được giới hạn pH rộng từ 3.5 đến 7.5, tối
ưu là khoảng 5.0 – 7.0.
Điều kiện tốt nhất để sản xuất ethanol là nồng độ đường khử trong mật rỉ khoảng 200g/lít, 30oC, canh trường tĩnh và thời gian lên men là 48 giờ. Mật rỉ là một sản phẩm phụ của nền công nghiệp đi từ nguyên liệu trong nông nghiệp, thường được sử dụng trong các nhà máy rượu nhờ thành phần có chứa các đường lên men và đây là nguồn cacbon tốt cho trao đổi chất ở vi sinh vật. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol giảm ở nồng độ đường cao do có sự gia tăng áp suất thẩm thấu, mà đây là nhân tố quan trọng để hình thành các sản phẩm phụ như : sorbitol và levan.
Môi trường mật rỉ được chuẩn bị bằng cách pha loãng mật rỉ theo yêu cầu. Bảng14 thể hiện lên men ethanol với chủng Z. mobilis trên cơ chất mật rỉ với nồng độ đường ban ban đầu 10% (w/v). Các chủng ATCC 10988 (3.05% v/v) vàNRRL Β 4286 (3.29 % v/v) thể hiện sức sản xuất cực đại trong khi IFO 13756 thể hiện sức sản xuất cực tiểu (1.97 % v/v).
Bảng 14 : Lên men ethanol ở các nồng độ đường ban đầu khác nhau với cơ chất là mật rỉ với chủngZ. mobilis ATCC 10988
Bảng 14 cho thấy năng suất sản xuất ethanol đạt cực đại (3.35%, v/v) với nồng độ đường ban đầu 15% (w/v), lúc này sự hấp thu cơ chất đạt cực đại (42% w/v). Còn với nồng độ đường ban đầu của mật rỉ trên 15% (w/v) thì sự lên men ethanol giảm dần. Nhìn chung, với tất cả 4 chủng thuộc loàiZ. mobilis là ATCC 10988, ATCC 12526, NRRL B 4286 và IFO 13756, khả năng sản xuất ethanol từ mật rỉ của chúng rất kém so với các cơ chất khác. Điều này có thể giải thích là do nồng độ cao cuả các ion Mg2+và K+ có trong mật rỉ gây ức chế một phần quá trình lên men (Skotnicki và cộng sự, 1982).
Bảng 15 : Lên men ethanol với các loại môi trường khác nhau với chủngZ. mobilis
2.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose :
Môi trường phổ biến nhất được sử dụng trong việc kiểm tra khả năng lên men ethanol của Z. mobilis là môi trường glucose với dịch chiết nấm men, ammonium sulfate và magnesium sulfate (Karsch và cộng sự 1983, Struch và cộng sự 1991, Agrawal vàVeeramallu 1990, Oaxaca and Jones 1991, Falcao de Morais và cộng sự 1993, Nowak and Roszyk 1997, Rios và cộng sự 1991).
Người ta tiến hành so sánh sản lượng ethanol tạo thành bởi 2 chủng thuộc loàiZ. mobilis trên môi trường glucose với nồng độ glucose thay đổi từ 100 – 250
g glucose/ lít. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol dao động trong khoảng 91.8 – 96% so với hiệu suất lý thuyết và hàm lượng glucose sử dụng cao hơn ứng với cả 2 chủng ngay cả trong điều kiện nồng độ đường cao.Z. mobilis có hệ thống khuếch tán xúc tiến nên có khả năng cân bằng nhanh chóng nồng độ glucose nội bào và ngoại bào.
Bảng 16 : Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol và sử dụng glucose bởi 2 chủng thuộc loàiZ. mobilis trong lên men tĩnh
(30oC, thời gian lên men 48 giờ và 72 giờ cho nồng độ glucose là 250g/l)
Chủng Glucose (100g/l) Glucose (150g/l) Glucose (200g/l) Glucose (250g/l)
Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol (% lý thuyết ) % Glucose sử dụng 3881 93.8a 98.2 91.8a 98.5 93.6a 97.9a 95.9 91.2a 3883 94.3b 98.5 93.4b 98.6 94.2b 99.0b 96.0 98.2b
2.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu :
Để tìm ra pH tối ưu cho sự lên men ethanol với loàiZ. mobilis , pH ban đầu
của môi trường lên men được chỉnh ở những giá trị khác nhau và tiến hành quá trình lên men trong 72 giờ. Kết thúc quá trình này, các mẫu được thu lại và ước lượng nồng độ ethanol và nồng độ đường sót.
Bảng 17 cho thấy ảnh hưởng của pH ban đầu lên các thông số lên men của các chủngZ. mobilis khác nhau. Ta thấy hiệu quả lên men đạt cực đại ở pH 7 và
thấp nhất ở pH 4, chứng tỏ nếu gia tăng pH ban đầu thì sự hấp thu cơ chất và hiệu quả lên men cũng tăng. Do đó pH tối ưu cho sự lên men ethanol với chủng Z. mobilis được chọn là 7.
Bảng 17 : Aûnh hưởng của pH ban đầu lên sản xuất ethanol ứng với các chủngZ. mobilis khác nhau
2.6. Aûnh hưởng của ion Na+ và ion Cl-
Nhược điểm của tất cả các loàiZ. mobilis là khả năng kháng cự đối với các ion vô cơ (Rogers và cộng sự. 1984), các ion vô cơ này lại thường xuyên có trong các nguồn nguyên liệu công nghiệp như rỉ đường và các sản phẩm thủy phân của lignocellulose với nồng độ có thể gây kìm hãm (Binkley và Wolfrom 1953; Ranatunga và cộng sự. 2000).
Nhiều tác giả đã báo cáo rằng hiệu suất ethanol giảm khi có mặt của các muối Na và Ca (Bajpai và Margaritis 1984; Fein và cộng sự. 1984; Spangler và Emert 1986; Stevnsborg và Lawford 1986; Kirk và Doelle 1992; Sreekumar và Basappa 1992; Vigants và cộng sự. 1998). NaCl và KCl làm giảm tốc độ hấp thu cơ chất khi vi sinh vậtsinh trưởng trên glucose (Sreekumar và Basappa 1992; Park
và Baratti 1993) và làm tăng khả năng sinh tổng hợp sorbitol, fructo- oligosaccharide và levan khi lên men sucrose (Kirk và Doelle 1992; Vigants và cộng sự. 1998).
Roi gây cản trở sự lắng và gây khó khăn trong việc tái sử dụng tế bào trong các bồn lên men cổ truyền. Trong suốt quá trình sản xuất ethanol vớiZ. mobilis,
sự hình thành roi trong bồn lên men cố định tế bào gây nhiều khó khăn về điều khiển quá trình (Krug và Daugulis 1983; Daugulis và cộng sự. 1985). Cơ chế hình thành roi vẫn còn chưa được biết đến rõ ràng và nó được giải thích là do ảnh
hưởng bởi áp lực của các ion hoặc sự gia tăng mức photphat (Fein và cộng sự. 1984) và ion Ca2+ (Spangler và Emert 1986; Stevnsborg và Lawford 1986).
Trong khi NaCl là nguyên nhân chung gây kìm hãm sự lên men của Z. mobilis, còn những ảnh hưởng có liên quan của các ion Na+ và Cl- vẫn chưa được giải thích rõ ràng. Tóm lại, tham gia kìm hãm sự sinh trưởng, hấp thu glucose và sản xuất ethanol là do cả hai loại ion âm và ion dương, còn sự hình thành roi thì hầu như bị ảnh hưởng hoàn toàn bởi ion Cl-.
Với 0.175 mol/l NaCl trong các khoảng thời gian từ 0, 3, 6, 9, 16 và 24 giờ (a–f), 0.175 mol/l Cl-(như NH4Cl) (g) và 0.175 mol/l Na+ (như Na2SO4.10H2O) (h)
Hình 20 : Thay đổi kiểu hình theo thời gian củaZ. mobilis
Hình 19 : Ảnh hưởng của 0.175 mol/l NaCl, Na+ (như Na2SO4.10H2O) và Cl-
(như NH4Cl) lên sự tăng trưởng của
2.7. Aûnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 30oC.
Khi nhiệt độ tăng dần đến nhiệt độ tối ưu thì tốc độ hình thành sản phẩm cũng tăng. Với nồng độ cơ chất cao trong dịch lên men , khi nhiệt độ tăng thì tốc độ hấp thu cơ chất tăng.
Bảng 18 : Aûnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ sinh trưởng riêng cực đại ở
Z. mobilis ATCC 29191 trong nuôi cấy tĩnh ( môi trường chứa 2% glucose và pH 5.5)
Nhiệt độ (oC) max (giờ-1)
30 33 36 0.27 0.38 0.26
Nhiệt độ tăng ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào, tốc độ hấp thu cơ chất và hình thành sản phẩm.
Khi nhiệt độ của môi trường lên men tăng từ 30 – 36oC , ở nồng độ glucose không đổi trong hỗn hợp nhập liệu thì nồng độ sinh khối giảm và tốc độ hấp thu glucose tăng dần.
Khi tăng nhiệt độ khoảng 2 – 3oC sẽ có nhiều glucose chuyển hóa thành ethanol hơn, hiệu suất chuyển hóa tăng từ 82% to 90%. Tuy nhiên, nhiệt độ cao quá mức sẽ có nhiều glucose thất thoát trong canh trường, hiệu suất chuyển hóa giảm còn 65%. Đặc biệt, ở 35oC, kiểu hình của tế bào vi khuẩn có nhiều thay đổi hơn dẫn đến mật độ tế bào giảm và khó khăn trong điều khiển quá trình.
2.8. Aûnh hưởng của môi trường kỵ khí
Zymomonas mobilis sinh thưởng hiếu khí với nồng độ glucose 20g/l (giới
hạn cacbon) trong thiết bị chemostat bị kìm hãm bởi sự gia tăng đồng thời hai yếu tố là hiệu suất sinh thưởng (Yx/s) và hiệu suất sinh trưởng cực đại (Yx/smax) và sự giảm đồng thời 2 yếu tố là tốc độ hấp thu cơ chất riêng (qs) và tốc độ hấp thu năng lượng dự trữ (me). Sự gia tăng về áp suất riêng phần của oxy cho thấy có sự chuyển tiếp thích nghi từ trạng thái kỵ khí sang hiếu khí xảy ra trong 4 trường hợp sau :
Kỵ khí : 0 mmHgO2
Oxy bị hạn chế : 7.6- 230 mmHgO2
Trung gian : 273 mmHgO2
Nồng độ sinh khối ổn định (Yx/s) và mức ATP nội bào gia tăng khi áp suất riêng phần của oxy tăng từ 7.6 đến 120 mm HgO2, cùng với sự giảm đồng thời thông số qs và tốc độ sản xuất acid riêng. Hoạt động của enzyme ATPase ở màng tế bào giảm dần khi tăng áp suất riêng phần của oxy và trở nên kém hoạt động nhất ở 273 mm HgO2, lúc đó áp suất riêng phần của oxy đạt cực đại mà vẫn duy trì được trạng thái ổn định.
Hoạt động của các enzyme glucokinase, glucose-6-photphat dehydrogenase, glyceraldehyde-3-photphat dehydrogenase, và alcohol dehydrogenase cũng giảm dần khi áp suất riêng phần của oxy tăng trên 15 mmHg, ngoại trừ enzyme pyruvate decarboxylase không bị tác động bởi điều kiện hiếu khí.
Sự kìm hãm sinh thưởng ở áp suất 290 mm HgO2 là đặc trưng cho sự giảm đáng kể hoạt động của enzyme pyruvate kinase và mức ATP tích lũy.
Kết luận : với nồng độ glucose thấp và điều kiện giới hạn oxy thì làm cho sản lượng sinh khối gia tăng, điều này phản ánh sự tái sử dụng lại gián tiếp ATP thì được ưa thích hơn là sự gia tăng năng lượng tạo ra cuối cùng.
2.9. Aûnh hưởng của Furfural :
Furfural là một chất độc kìm hãm sự sinh trưởng và khả năng sản xuất ethanol của chủngZymomonas mobilis CP4 (pZB5). Điều này đã được nghiên cứu
bằng cách lần lượt thêm 0.475 g/l và1.9 g/l furfural vào môi trường lên men. Sự kìm hãm của furfural thể hiện ở việc giảm 30% và 60% (w/v) trong sản xuất sinh khối và 19% và 76% trong sản xuất ethanol.
Thành phần phức tạp của các hợp chất lignocellulose trong chất xơ thực vật là vấn đề khó khăn trong việc chuyển hóa gỗ thành ethanol. Người ta thấy rằng việc nghiên cứu những ảnh hưởng của các sản phẩm từ quá trình thủy phân lên các thông số của quá trình lên men và từ đó có hướng giải quyết với những hợp chất độc hại.
3 yếu tố tồn tại cần phải tiền xử lý là : quá trình nghiền xé, sự nổ hơi và thủy phân acid loãng. Nhìn chung, phần gỗ dư sẽ được xử lý ở khoảng nhiệt độ từ 200 – 220oC, thời gian nấu từ 3 – 5 phút với 2 - 3% SO2 (v/v). Còn ở điều kiện nhiệt độ 170oC thì nấu trong vòng 15 – 60 phút với 0.01-0.1% (v/v) của H2SO4
(Um cùng cộng sự, 2001). Các thành phần của hemicellulose được chuyển hóa thành pentose và những sản phẩm khác theo phương trình phản ứng sau :
Pentosan ---(H2O)-- pentose (xylose)---(- 3 H2O) furfural
Hình 21 : Phản ứng chuyển hóa fufural
Hydroxymethylfurfural (HMF) còn được sinh ra từ các loại đường 6 cacbon trong điều kiện nhiệt độ cao và môi trường acid. Trong suốt quá trình sinh trưởng củaZ. mobilis, qua quan sát dưới kính hiển vi, người ta thấy sự thay đổi kiểu hình
một phần bị kìm hãm bởi nồng độ của các aldehyde. Tế bào sau 6 giờ có xu hướng kéo dài ra hoặc hình thành những chuỗi ngắn hơn so với tế bào ban đầu, và sau 24 giờ nó phồng to ra và có dạng hình tròn (Zaldivar, 1999). Shahab và Hadi (1995) lại cho rằng furfural ban đầu phản ứng với cặp base nitơ trong chuỗi ADN dẫn đến sự phá vỡ thông qua sự khử purin và pyridin tự phát.
Tốc độ tiêu thụ cơ chất, Qs, được thể hiện ở bảng 19. Ethanol được hình thành sau 15 giờ. Tuy nhiên nồng độ ethanol cuối cùng bị giảm gần 19.04% và 76.19% nếu sử dụng 0.475 g/l và 1.9 g/l furfural theo thứ tự. Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy có bổ sung furfural và được ủ trong 38 giờ.
Bảng 19 : Các thông số lên men
Furfural (g/l) Qs Cơ chất (g /h) Qetoh Sản phẩm (g /h) Yxs Sinh khối tế bào/cơ chất (g/g) Yps Sản phẩm/ cơ chất (g/g) µ (h/r) 0 0.475 1.9 0.45 0.40 0.17 0.22 0.18 0.05 0.00271 0.00261 0.00226 0.5 0.45 0.3 0.089 0.063 0.024 Sự kìm hãm của furfural lên quá trình lên men giảm dần cùng với sự gia tăng nồng độ sinh khối tế bào (Boyer cùng cộng sự, 1992; Navarro, 1994). Tuy nhiên sự sản xuất sinh khối không bị kìm hãm hoàn toàn bởi nồng độ furfural 0.475 g/l và 1.9 g/l. Chất độc này ảnh hưởng đến pha log của sự sinh trưởng vi sinh vật. Tốc độ tăng trưởng riêng (µ) giảm 29% (w/v) và 73% (w/v) nếu sử dụng 0.475 g/l và 1.9 g/l furfural theo thứ tự.
2.10. Aûnh hưởng của thành phần nitơ, kali và photpho trong môi trường dinh dưỡng
Nồng độ sinh khối tạo ra thấp khi hàm lượng nitơ quá nhiều. Tốc độ hình thành sản phẩm trong điều kiện hàm lượng nitơ vừa đủ cao hơn trong điều kiện hàm lượng nitơ đạt quá mức.
Cần tăng hàm lượng nitơ trong môi trường lên men khi nồng độ glucose tăng. Tuy nhiên, sự giới hạn về hàm lượng nitơ trong môi trường lên men không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm.
Trong phương pháp lên men liên tục, khi tốc độ pha loãng tăng dần, khi gia tăng hàm lượng nitơ sẽ dẫn đến nồng độ sinh khối trong thiết bị lên men cũng gia tăng, nhưng lượng sinh khối tạo ra trong điều kiện trường nitơ giới hạn ít hơn so với trong điều kiện nitơ quá mức.
Hàm lượng nitơ vừa đủ cho quá trình lên men phụ thuộc vào tốc độ pha loãng và phải gia tăng tốc độ pha loãng thì mới đạt mục tiêu chuyển hóa hoàn