Đề tài so sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng aspegillus niger và chủng bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài

Chính vì vậy nhằm mục đích cải thiện cấu trúc trái cây trong sữa chua, góp phần đa dạng hóa các sản phẩm sữa chua hiện có trên thị trường thì việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng en

MỤC LỤC Danh mục các bảng trang

Danh mục các hình

Danh mục chữ viết tắt

Mở đầu

Mục tiêu đề tài

Nhiệm vụ

Ý nghĩa thực tế và các vấn đề liên quan

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ENZIM PECTINAZA 1

1.1.1 Giới thiệu chung 1

1.1.2 Phương pháp thu nhận enzim pectinaza 2

1.1.2.1 Thu nhận chế phẩm enzim từ canh trường bề sâu 2

1.1.3 Nguồn tổng hợp enzim 4

1.1.3.1 Nguồn gốc từ thực vật 4

1.1.3.2 Nguồn vi sinh vật 5

1.1.4 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước 9

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT PECTIN 10

1.2.1. Khái quát chung về Pectin 10

1.2.1.1 Các chỉ số đặc trưng 12

1.2.1.2 Cơ chế tạo gel của pectin 12

1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cơ chế tạo gel 16

1.3 ỨNG DỤNG CỦA ENZIM TRONG SẢN XUẤT SỮA CHUA TRÁI CÂY 18

1.3.1 Giới thiệu về sản phẩm sữa chua trái cây 18

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 20

2.1.1 Thời gian 20

2.1.2 Địa điểm 20

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 THIẾT BỊ VÀ DUNG CỤ 20

2.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 20

2.4.1 Môi trường hoạt hóa 20

2.4.1.1 Môi trường hoạt hóa vi khuẩn B subtilis 20

2.4.1.2 Môi trường hoạt hóa nấm mốc A niger 20

2.4.2 Môi trường tổng hợp pectinaza 21

2.4.2.1 Môi trường tổng hợp pectinaza từ vi khuẩn B subtilis 21

2.4.2.2 Môi trường tổng hợp pectinaza từ nấm mốc A niger 21

2.5 NỘI DUNG 21

2.6 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 21

2.6.1 Phương pháp vi sinh 21

2.6.1.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn B subtils từ gói Bio Subty I-II 21

2.6.1.2 Hoạt hóa chủng nấm mốc A niger từ ống giống gốc 22

2.6.1.3 Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp của hai chủng B subtilis và A.niger 23

2.6.1.4 Phương pháp hàm lượng chất cảm ứng (pectin) tới khả năng sinh enzim pectinaza 23

2.6.1.5 Phương pháp so sánh hoạt lực enzim pectinaza của chủng A niger và B subtilis 24

2.6.1.6 Phương pháp tổng hợp pectinaza 25

2.6.2 Phương pháp hóa sinh 26

2.6.2.1 Phương pháp đo hoạt độ của enzim pectinaza 26

2.6.3 Phương pháp khảo sát các điều kiện tiền xử lý thích hợp cho hoạt động của enzimpectinaza để cải thiện cấu trúc của xoài 26

2.6.4. Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm 27

2.6.5 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ xoài cho vào dịch sữa 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ HOẠT HÓA CHỦNG B SUBTILIS VÀ CHỦNG A NIGER 31

3.1.1 Hoạt hóa chủng B subtilis 31

3.1.2 Hoạt hóa chủng A niger 33

3.2 KHẢO SÁT SỰ TỔNG HỢP ENZIM PECTINAZA TỪ HAI CHỦNG B SUBTILIS VÀ A NIGER 34

3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng chất cảm ứng tới khả năng sinh enzim pectinaza 34

3.2.2 Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp của hai chủng B subtilis và A.niger 35

3.3 KẾT QUẢ SINH TỔNG HỢP ENZIM PECTINAZA 38

3.4 KẾT QUẢ XỬ LÝ XOÀI BẰNG ENZIM PECTINAZA VÀ MUỐI CaCl2 39

3.5 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ XOÀI BỔ SUNG VÀO DỊCH SỮA 42

3.6 XÁC ĐỊNH TỶ LỆ XOÀI BỔ SUNG VÀO DỊCH SỮA 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

ST

T

Số

2 1.2 Phần trăm pectin trong các phần phế liệu của bưởi 11

7 2.5 Bảng điểm cơ sở về trạng thái của sữa chua xoài 29

8 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng vikhuẩn B subtilis. 31

9 3.2 Quá trình xử lý xoài với enzim pectinaza và muốiCaCl

11 3.3 Mô tả chất lượng cảm quan của sản phẩm phụ thuộc

tỷ lệ bổ sung xoài vào sữa chua 41

DANH MỤC HÌNH

6 1.6 Pectin trước khi bị thủy phân (a), pectin sau khi bị

thủy phân và tạo liên kết mạng với Ca2+ (b) 18

8 3.2 Hình ảnh ống giống của chủng B subtilis. 32

9 3.3 Nấm mốc A niger phát triển trên thạch đĩa

14 3.8 Enzim pectinaza được tổng hợp từ chủng A niger. 38

15 3.9 Tổng điểm đánh giá cảm quan xoài sau khi xữ lý. 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

stt Ký hiệu Tên đầy đủ

1 A niger Aspegillus niger

2 B subtilis Bacillus subtilis

MỞ ĐẦU

Ứng dụng enzim trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang làmột trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn Hiện nay, cácnước phát triển sử dụng các chế phẩm enzim để tạo ra những sản phẩm có năng suất,chất lượng cao với giá thành hạ Việt Nam là nước giàu tiềm năng về nguyên liệu, nhucầu các loại enzim phục vụ trong chế biến thực phẩm là rất lơn Tuy nhiên, ở Việt Namhoàn toàn không có xưởng sản xuất enzim, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại mộtkhối lượng rất lớn các chế phẩm enzim

Hiện nay, người ta khai thác enzim chủ yếu từ vi sinh vật và được ứng dụngnhiều trong đời sống, sản xuất Nguồn enzim từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạttính enzim cao, thời gian tổng hợp ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuấthoàn toàn theo quy mô công nghiệp

Pectinaza là nhóm enzim thủy phân pectin, enzim này có ứng dụng rộng rãitrong công nghiệp thực phẩm chỉ sau amylase và proteaza

Sữa chua là một sản phẩm lên men từ sữa rất được ưa chuộng hiện nay trên thếgiới cũng như ở Việt Nam, nó có hương vị thơm ngon, bổ dưỡng và quan trọng hơn cả

là nó mạng lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người Tuy nhiên trên thị trường hiện naysản phẩm sữa chua chưa phong phú và đa dạng về chủng loại

Chính vì vậy nhằm mục đích cải thiện cấu trúc trái cây trong sữa chua, góp phần

đa

dạng hóa các sản phẩm sữa chua hiện có trên thị trường thì việc thực hiện đề tài

“Nghiên cứu sử dụng enzim pectinaza từ chủng nấm mốc Aspergillus niger và chủng vi khuẩn B subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua trái cây” là điều cần

thiết

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài là lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp từ

hai chủng A.niger và B subtilis để tổng hợp tổng hợp enzim pectinaza và ổn định cấu

trúc của xoài trong sản phẩm sữa chua xoài

NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI

- Hoạt hóa thành công hai chủng A niger và B subtilis.

- Lựa chọn một trong hai chủng A niger và B subtilis cho quá trình tổng hợp

enzim pectinaza phục vụ cho quá trình nghiên cứu sản xuất sữa chua xoài

- Sinh tổng hợp enzim pectinaza từ chủng vi sinh vật được lựa chọn

- Xác định các điều kiện thích hợp cho khả năng ổn định cấu trúc của xoài trong sữa chua

- Xác định được lượng xoài thích hợp bổ sung sung vào trong sữa chua

- Sản xuất thành công sữa chua xoài dựa vào các điều kiện đã được nghiên cứu

Ý NGHĨA THỰC TIỂN VÀ CÁC VẤN ĐỀ CÓ LIÊN QUAN.

Pectinaza là nhóm enzyme thủy phân pectin Đây là nhóm enzyme được ứngdụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất rượu vang, nước giảikhát, sản xuất nước quả, mứt quả,…Ở Việt Nam, enzyme pectinase chủ yếu được nhậpngoại nên việc ứng dụng pectinase trong sản xuất chiếm một tỉ lệ không đáng kể.Enzyme pectinase rất phổ biến ở các loại cây có trái, vi sinh vật Xuất phát từ nguồn vi

sinh vật rẻ tiền, phổ biến và có nhiều giá trị sử dụng đặc biệt là chủng nấm mốc A niger và chủng vi khuẩn B subtilis thì việc sinh tổng hợp enzyme pectinaza sẽ đem lại

giá trị về kinh tế trong chế biến thực phẩm

Với sản phẩm sữa chua xoài được sản xuất dựa trên công nghệ enzim sẽ đem lại một sựmới lạ cho sản phẩm sữa chua trên thị trường, góp phần làm đa dạng sản phẩm làmtăng lợi ích về kinh tế

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ENZIM PECTINAZA

1.1.1 Giới thiệu chung

Enzim pectinaza là enzim xúc tác thủy phân các polymepectin Sự phân hủypectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzim này vì vậy có vaitrò quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả Việc kiểm soát các enzimnày trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối mã

để thao tác sự biểu hiện gen Enzim pectinaza cũng được ứng dụng nhiều trong quátrình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc kiểm soát hoạtđộng của enzim pectinaza có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm Enzimpectinaza có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng

Pectinaza: Xúc tác thủy phân của các nhóm methyleste Enzim thường tấn côngvào các nhóm este methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị este hóa,phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thànhcác axit pectinic hoặc axit pectic và methanol Pectinaza thu được từ các nguồn khácnhau có giá trị PH tối ưu khác nhau Nếu thu từ nguồn vi sinh vật thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu thu từ nguồn thực vật thì có PH tối ưu từ 5,0-5,8 Pectinaza từ nấm mốc cónhiệt độ tối ưu là 30-400C và bị vô hoạt ở 55-620C Pectinaza thường được hoạt hóa bởicác ion Ca2+ và Mg2+

Polygalacturonaza còn có tên gọi là poly-1,4-galacturoniglucanohydrolase xúc tác

sự phân cắt các mối liên kết α-1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly Dgalacturonide) galacturonohydrolaza, phân cắt từ các đầu không khử và endo-PG(endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolaza, tấn công ngẫu nhiên vào giữamạch cơ chất Polygalacturonaza ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yêu ở một số nấmmốc và vi khuẩn, Polygalacturonaza là một phức hệ enzim gồm có nhiều cấu tử vàthường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác

-Polymethylgalacturoaza tác dụng trên plygalacturonic axit đã được methoxyl hóa(tức là pectin) Enzim này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năngphân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glicosidaza-plymethyl

galacturonaza kiểu 1và exo-glucosidaza-polymethylgalacturonaza kiểu III.

-Polygalacturonaza, enzim tác dung trên pectic axit hoặc pectinic, cũng được chia

thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidaza-Polygalacturonaza kiểu IIvà

exo-glucosidaza-Polygalacturonaza kiểu IV Enzim endo-glucosidaza-polymethyl-glacturonaza kiểu I là

enzim polymethylgalacturonaza dịch hóa pectin có mức độ methyl hóa càng cao thì bịthủy phân bởi enzim này càng nhanh và càng có hiệu quả Trong dung dịch, khi có mặtcủa enzim Pectinaza thì hoạt độ của enzim này thường bị giảm Enzim này rất phổ biến

trong các vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc A niger, A awamori.

-Pectale lyaza (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị este hóa

Cả hai enzime exo-PEL (ply(1,4-α-D-galacturonide)lyaza)và PEL ( poly(1,4-α-D-galacturonic)lyaza)đều tồn tại Pectale và pectin có lượng methoxyl thấp

endo-là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzim này Nói chung, cả hai enzim này đều cókhoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động Pectalelyaza không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm các enzim visinh vật ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thựcvật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật

1.1.2 Phương pháp thu nhận enzim pectinaza

Hiện nay, người ta thu nhận enzim chủ yếu từ nguồn vi sinh vật Có hai phươngpháp thu nhận enzim pectinaza

1.1.2.1 Thu nhận chế phẩm enzim từ canh trường bề sâu

-Phương pháp hiếu khí: Sự tích tụ enzim trong môi trường được bắt đầu khi sựphát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị axit hoá mạnh và khilượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn pH của môi trường nuôi cấy thường đạt

từ 6-7,2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự

tích lũy enzim pectinaza pH = 4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzim pectinaza Khi pHdịch về phía axit, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khốikhông bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzim pectinaza bị kìm hãm Tuy nhiên, pH

của các trường nuôi cấu A niger và A awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2,

theo thứ tự Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ

2-10% Đối với A niger và A awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong

môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử Thời gian ủ sơ bộ thường

là 38-42h Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàmlượng các chất hoà tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8% Đểthu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chân không canhtrường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun.Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-1800C và đi ra đạt 60-

700C Thời gian lưu của chế phẩm enzim trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây

và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C Chế phẩm thu được cần phảiđược đóng gói kín để tránh hút ẩm Có thể thu chế phẩm pectinaza tinh khiết bằng cáchkết tủa enzim trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sulfat (50-80% trongmuối kết) Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinaza trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu Nếu kết tủa bằng muối ammoniumsulfat, cần tách muối ra khỏi enzim bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dungdịch đệm), sau đó sấy khô Khi độ bão hoà của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa đượcđoạn có hoạt độ pectinaza thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếukết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hoà 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11%nhưng lại có hoạt độ pectinaza cao

Phương pháp yếm khí môi trường: Dùng bã củ cải:2%; (NH4)2HPO4 0,75%

KH2PO4:0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5% Clostridium pectinopermentants

15 có khả năng tổng hợp pectinaza một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình

sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối Sự tích lũy enzim sẽ tối đatương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h PH ban đầu của môi trườngdinh dưỡng là 6,5-7,0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trườngchứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành

ở nhiệt độ 350C Cl Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinaza.Thành phần môi trường gồm có: Lactose:2%; pectin củ cải:1%; (NH4)2HPO4: 0,4%;

K2HPO4: 0,7%; KH2PO4:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO4: 0,025%; FeSO4: dạng vết; CaCO3:0,5%; dịch nấm men tự phân: 0,05%; ascorbic axit: 0,5% Có thể tiến hành thu chếphẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzim với dung môi hữu cơ hoặc vớimuối ammonium sulfat Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lílà: 6,5-6,8 Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzim trong kết tủađạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu Khi kết tủa bằng ammonium sulfat có độ bão hoàbằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinaza và pectintranseliminase; khi độbão hoà là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase vàexoPolygalacturonaza Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzimpectinazathường theo các bước cơ bản sau đây: - Khử muối bằng phương pháp lọc gel (BiogelP100) - Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel A), hay trao đổication (CM Biogel A) - Tách enzim pectinaza bằng alginate liên kết ngang - Tinh sạchbằng FPLC Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởngtĩnh điện và thay thế pectat liên kết ngang

1.1.3 Nguồn tổng hợp enzim

1.1.3.1 Nguồn gốc từ thực vật

Hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzim pectinaza Enzim này thường tồn tạidưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào Pectinaza ở thực vật nóichung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim loại ở nồng độthấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzim

Đặc điểm của pectinaza thực vật: Cà chua chứa ít nhất hai loại pectinaza, cảpectinaza I và pectinaza II đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín Khi bướcvào giai đoạn chín, nồng độ enzim pectinaza I giảm xuống, nhưng pectinaza II tích luỹdần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín Pectinaza II có khối lượngphân tử 23kD, pH tối ưu 7,6 Enzim này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 670C các ion

Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzim lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M,theo thứ tự

Pectinaza của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưutại pH gần 8 Polygalacturonic axit, sản phẩm hình thành do quá trình để methyl hoá, làmột chất ức chế cạnh tranh Trong thịt quả chuối có hai isoenzim pectinaza Cả hai cócùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau 8,8 và 9,3 Cácenzim này hoạt động ở pH tối đa là 7,5 Hoạt độ enzim tăng lên khi thêm vào dungdịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0 Các enzim này bị ức chếbởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucroza, glucoza,maltose và galactose

Pectinaza trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzimpectinaza I và pectinaza II

có khối lượng phân tử 36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0,theo thứ tự PH tối ưu của pectinaza I là 7,6, còn của pectinaza II là 8,0 Thịt quả cũngchứa hai isoenzim, một trong hai enzim này có tính bền nhiệt hơn, còn enzim kia thì ítmẫn cảm hơn khi bị tác động của proteaza Độ ổn định của enzim có thể liên quan đếnmức độ glycosyl hoá của các phân tử enzim

Enzim bền nhiệt hơn và enzim còn lại có khố i lượng là 51kD và 36kD, theo thứ

tự Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzim, các isoenim của kiwi có cùng khốilượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3 Tuy nhiên, chúng khác nhau vềmức độ bền nhiệt

1.1.3.2 Nguồn vi sinh vật

Hiện nay trên thế giới người ta tổng hợp enzim pectinaza từ nhiều chủng vi sinh vật

khác nhau, nhưng trong đó chủ yếu nhất vẫn là hai chủng A niger và B subtilis.

 Sơ lược về chủng nấm mốc A niger

 Đặc điểm hình thái

- Quan sát đại thể

Khóm nấm mốc A niger có đường kính 4 ¸ 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày.

Khóm nấm mốc màu đen hoặc nâu đen lấm tấm như bã cà phê

- Quan sát vi thể

Bông hình cầu có màu đen Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình 2 tầng,Metulae dài gấp đôi tầng Phialides Vách cuống conidi trơn Hạt đính hình cầu đến gầncầu, có gai rõ

Hình 1.1 Cấu tạo của chủng nấm mốc A niger

Đặc điểm nuôi cấy

Quá trình nuôi cấy nấm mốc A niger sản xuất enzim pectinaza có thể được thực

hiện theo hai phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn và lên men chìm Trong

đó, trong đó phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vậtphát triển trên bề mặt môi trường, hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm thông thường,môi trường dạng rắn với nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải và bột bắp nghiền,hạt thóc nảy mầm, trấu có bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác (amonium sulfat,ammoni chloride, ammoni photphat) Phương pháp này phát triển rất mạnh từ nhữngnăm 1970 đến nay Đối với phương pháp nuôi cấy bề sâu, vi sinh vật sẽ được nuôi

trong môi trường lỏng có bổ sung đầy đủ thành phần dinh dưỡng và chất cảm ứng

pectin để tác động tới vi sinh vật sinh enzim petinase pH thích hợp để nuôi cấy A niger [7].

A niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8 độ C, tối đa 45-470C, tối ưu25-280C Sinh trưởng được ở độ ẩm tối thiểu 23% Độ ẩm môi trường thích hợp để lênmen bán rắn là 60-65% Sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2, pH tối ưu 4-6,5 Tuy

nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng A niger sinh trưởng được ở pH 2.Trên môi trường thạch Czapek, A niger mọc thưa, đường kính khuẩn lạc khoảng 4cm Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn lạc A niger mọc tốt và to hơn, đạt

đường kính trung bình khoảng 6cm

Trên môi trường thạch malt khuẩn lạc mọc tốt nhưng không to như trên môi trườngthạch Czapek-cao nấm men

 Đặc điểm sinh hóa

Khả năng lên men đường: A niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn

và đường đôi như: glucoza, fructoza, maltoza, xyloza, manoza, saccharoza A niger

đồng hóa được galactoza, sorboza và lactoza ở mức độ kém hơn [3]

Khả năng tổng hợp enzim:

+ a-amylase: A niger có khả năng tổng hợp a-amylaza ngoại bào để thủy phân nhanh

tinh bột tạo dextrin và một ít maltoza và glucoza

+ Proteaza: A niger có khả năng tạo 2 loại proteaza Proteaza thứ nhất phân giải

protein thành polypeptid, peptonproteaza thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trênthành axit amin

+ Cellulaza: A niger có khả năng tạo cellulaza, chủ yếu là cellulaza Cl, cellulaza Cx và

b-glucosidaza hay cellobiaza

+ Pectinaza, Xylanaza: A niger có khả năng tạo pectinaza, xylanaza ở nhiệt độ tối

thích 25 độ C, pH 5,6

Ngoài ra, A niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác như: lipaza,

mananaza [7]

 Sơ lược về chủng vi khuẩn B subtilis

Đặc điểm hình thái

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 –

3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước

từ 0,8 - 1,8 µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, khôngkháng axit, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu,2000)

Hình 1.2.Cấu tạo của vi khuẩn B subtilis

Đặc điểm nuôi cấy

Nuôi cấy trong môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưakhông đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 - 4 ngày bềmặt nhăn nheo, màu hơi nâu

Đối môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợnsóng Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin Thạch khoai tây: phát

triển đều, màu vàng lấm tấm hạt Môi trường canh TSB: B subtilis phát triển làm đục

môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều

Độ pH: B subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4 Nhu cầu O2: B subtilis là

vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C

 Đặc điểm sinh hóa

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucoza, maltoza, manitol, saccharoza,xyloza, arabinoza

Indo (-), nitrate (-), MR-VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein(+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+)

Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác độngcủa hemolysine [7]

Bảng 1.1.Các phản ứng sinh hóa của B subtilis

Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzim pectinaza được tiến hành trên nhiều đối

tượng khác nhau như: Fusarium (Guevara, 1997), Aspegillus japonicas (Maria, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Penicilium viridicatum (Dênis, 2002), trichoderma reesei (lisbeth, 2003)… Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;

Taragano, 1997; Caltisho, 2000)

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học phân tử và công nghệ gen, đa số cácchủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzim pectinaza đều là những chủngđột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004) Nhiều công trình nghiên cứu đã tiếnhành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzim pectinaza của các chủng vi sinh vật như:

Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu “sự thao tác gen trên chủng Aspegillus nhằm

làm tăng sự tổng hợp các enzim phân giải pectin” hay Solis (1997) đã “cải thiện việc

sản xuất pectinaza dùng các thể lai giữa các chủng Aspegillus ”

Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môitrường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzimpectinaza (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003) Enzim pectinaza đượctổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay axit polygalacturonic

và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu galacturonic hoặc glucoza (Aguilar,1987; Taraagano, 1997, Guevara, 1997)

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT PECTIN

1.2.1 Khái quát chung về Pectin

Pectin là một polyme của các axit polygalacturonic và este methyl của chúng.Pectin có nhiều ở quả củ hoặc thân cây Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng:dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, và dạng hòa tan pectin tồntại chủ yếu ở dịch tế bào

Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế người ta gọichúng là chất cement trong cấu trúc tế bào thực vật Khi quả còn xanh, protopectin

chiếm tỷ lệ khá cao, protopectin không hòa tan trong nước, giúp quả có độ cứng Khiquả chín dần, dưới tác dụng của enzim protopectinaza, protopectin sẽ chuyển sangpectin hòa tan, làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm hơn, quá trìnhnày cũng xảy ra dưới tác dụng của axit và nhiệt độ trong quá trình chần ở 60-85OC.Pectin tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ hoặc thân của một sốloài thực vật: trong táo 10-15%, quả citrus 20-50%, củ cải đường 10-20%, đài hoahướng dương 15-25%, pectin lấy từ các nguồn khác nhau sẽ khác nhau về khả năng tạogel và khác nhau ít nhiều về các nhóm thế methoxyl trong phân tử, trong cùng một loạiquả nhưng ở các phần khác nhau thì hàm lượng pectin cũng khác nhau, bản thân pectin

là một loại chất xơ hòa tan trong nước có khả năng làm tăng độ nhớt

Bảng 1.2 Phần trăm pectin trong các phần phế liệu của bưởi [10].

Các phế liệu Khối lượng (%) Hàm lượng

pectin (%)

Hiệu suất thu hồi(%pectin/%chấtkhô)

Pectin thường bảo quản ở dạng bột màu trắng, hơi vàng nhạt, hơi nâu hoặc xámnhẹ, độ ẩm không quá 12% (105oC, 2h) Mặt khác có thể bảo quản ở dạng dung dịch có

độ khô 10% chứa 4-5% pectin, nhưng chỉ bảo quản được trong thời gian ngắn [12].Chỉ số methoxyl (MI): biểu hiện tỷ lệ methyl hóa, là phần trăm khối lượng nhómmethoxyl (-OCH3) trên tổng khối lượng phân tử Sự methyl hóa hoàn toàn tương ứngvới chỉ số methoxyl bằng 16,3%, còn các pectin tách ra từ thực vật thường có chỉ sốmethoxyl từ 10-12% [12]

Chỉ số este hóa (DE): thể hiện mức độ este hóa của pectin, là phần trăm về sốlượng của các gốc axit galactoronic được este hóa trên tổng số lượng gốc axitgalacturonic có trong phân tử [12]

1.2.1.2 Cơ chế tạo gel của pectin

Tùy thuộc mức độ methoxyl hóa của phân tử mà các loại pectin khác nhau có cơchế tạo gel khác nhau:

 Các cơ chế tạo gel

 HMP: Tạo gel bằng liên kết hydro:

- Điều kiện tạo gel: nồng độ đường sucroza> 50%; pH = 3,1-3,5; nồng độ pectin0,5-1%

Hình 1.3 Cơ chế tạo gel bằng liên kết hydro

 Đường có khả năng hút ẩm, vì vậy nó làm giảm mức độ hydrat hóa củaphân tử pectin trong dung dịch

 Ion H+ được thêm vào hoặc đôi khi chính nhờ độ axit của quả chế biếntrung hòa các gốc COO-, làm giảm độ tích điện của các phân tử Vì vậy các phân

tử có thể tiến lại gần nhau để tạo thành liên kết nội phân tử và tạo gel

- Trong các trường hợp này liên kết các phân tử pectin có thể hydroxyl, carboxyl-carboxyl, hoặc hydroxyl-carboxyl Kiểu liên kết này không bền, do

hydroxyl-đó các gel tạo thành sẽ mềm dẻo do tính di động của các phân tử trong khối gel Loạigel này khác biệt với gel thạch hoặc gelatin

-Cấu trúc của gel: phụ thuộc vào hàm lượng đường, hàm lượng axit, hàm lượngpectin, loại pectin và nhiệt độ

 30-50% đường thêm vào là sucroza Do đó cần duy trì pH axit để khi đunnấu sẽ gây ra quá trình nghịch đảo đường sucroza, ngăn cản sự kết tinh của đườngsucroza Ngoài ra đường nghich đảo có khả năng hút ẩm hơn cả sucroza nên duytrì cho sản phẩm kết cấu mềm lỏng Tuy nhiên cũng không nên dùng quá nhiềuaxit vì pH quá thấp sẽ gây nghịch đảo một lượng lớn sucroza, gây kết tinhglucoza và hóa gel nhanh tạo nên các vón cục

 Khi dựng lượng pectin vượt quá lượng thích hợp sẽ gây ra gel quá cứng,

do đó khi dựng một nguyên liệu có chứa nhiều pectin cần tiến hành phân giải bớtchúng bằng cách đun lâu hơn

 Khi sử dụng một lượng cố định bất cứ một loại pectin nào, pH, nhiệt độcàng giảm và hàm lượng đường càng cao thì gel tạo thành càng nhanh

- Ứng dụng: làm mứt quả nghiền, nước quả đông…

 LMP: tạo gel bằng liên kết với ion Ca2+

- Điều kiện tạo gel: khi có mặt Ca2+, ngay cả ở nồng độ <0,1%, miễn là chiều dàiphân tử pectin phải đạt ở mức độ nhất định, khi đó gel tạo thành ngay cả khi khôngthêm đường và axit

 Khi chỉ số của methoxyl thấp, có nghĩa là tỷ lệ các nhóm –COO- cao thì

biệt là Ca2+ Các phân tử axit pectic tác dụng tương hổ lẫn nhau nhờ các nhómcarboxyl tự do, các nhóm này liên kết lại nhờ các ion Ca2+ thành khung bền vững.

Hình 1.4 Cơ chế tạo gel bằng liên kết với Ca 2+

Cấu trúc của gel: phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ và chỉ số methoxyl

 Khi pectin có cùng khối lượng phân tử thì khả năng tạo gel phụ thuộc vàomức độ este hóa các gốc của mạch galacturonic tại các nhóm metoxyl (-OCH3)

+ Nhóm methoxyl tăng từ 8 -11 % thì độ bền đông tụ của nó tăng ngượclại khả năng đông tụ giảm Pectin có từ 9,5 -11% nhóm (-OCH3) ở môi trường pH

= 3 và hàm lượng đường 35 % khả năng đông tụ tốt

+ Khi hàm lượng methoxyl giảm xuống 5% và thấp hơn khi pectin vẫngiữ được khả năng đông tụ tạo đông chậm, đòi hỏi thay đổi hàm lượng đươngcũng như pectin và axit

+ Nếu pectin có hàm lượng từ 3,5 -6 % nhóm methoxyl khi có sự tham giacủa các muối kim loại nhiều hóa trị như Ca2+ và trên 35% đường thì nó sẽ tạo rađông tụ bền vững.

 Ion Ca2+: Dạng cation và anion có ảnh hưởng đến độ bền đông tụ cáccation Ca2+, Al3+ làm tăng độ bền gel còn cation hóa trị I như Na+ ở điều kiện xácđịnh có tác dụng ngược lại

- Ứng dụng: cho phép chế tạo được thịt đông có độ cứng bền ngay cả ở khí hậu

nhiệt đới (khác với đông gelatin) Hoặc làm mứt đông cho người bị tiểu đường

1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cơ chế tạo gel

 Pectin

- Nồng độ của các phân tử pectin trong dung dịch càng lớn thì sự liên kết giữacác phân tử xảy ra càng nhanh và sự đông tụ được tạo ra càng bền

- Nhưng không phải tất cả lượng pectin đều tham gia vào việc tạo đông tụ chính

vì vậy độ bền gel không phải xác định theo số lượng nhiều ít mà xác định theo chiềudài mạch phân tử và mức độ methoxyl hóa

+Nếu phân tử pectin quá ngắn sẽ không tạo được gel mặc dù sử dụng với liềulượng cao Nếu phân tử pectin quá dài thì gel rất cứng, khi các sợi chỉ được tạo ra ngắn,mạng lưới giữ pha lỏng của keo kém do đó sự đĩng tụ sẽ yếu và có khả năng đưa đến

sự rữa nát (vì nhả nước)

+ Mức độ methoxyl hóa quy định cơ chế tạo gel: tùy thuộc vào chỉ số methoxyl

cao hay thấp ở phân tử pectin mà các kiểu kết hợp giữa chúng sẽ khác nhau trong việctạo gel [12]

 Nước

Độ ẩm của khối keo tăng thì quá trình tạo keo tụ càng nhanh (vì tăng tốc độ địnhhướng của các phân tử pectin do độ nhớt của dung dịch phân tán giảm)

 Đường

Vai trò của đường trong việc tạo đông là khử nước, giảm solvat hóa của các phân

tử pectin phụ thuộc vào số lượng và chất lượng pectin mà dung lượng đường khácnhau

Hàm lượng pectin càng cao, chất lượng của nó càng tốt thì đòi hỏi hàm lượngđường trong sự tao đông càng nhiều nhưng nếu:

- Cao quá so với pectin thì độ bền đông tụ giảm và giảm tốc độ tạo đông Lượngđường phải lớn hơn 50% thì mới có khả năng tạo gel Thông thường người ta thườngdùng ở nồng độ 65% Nếu hàm lượng đường cao quá có thể gây kết tinh đường trên bềmặt hạt keo hay trong hệ keo [12]

- Thấp quá thì không đủ để tạo gel

 Axit

- Yêu cầu của axit trong việc tạo gel pectin :

+ Axit cho vào phải có mức phân ly cao hơn axit pectic như vậy nó sẽ ngăn cản

sự phân ly của axit pectic do đo các mixen pectic mất điện tích cùng dấu, chúng đượcnối lại thành sợi dài

+ Khi cho axit vào thì ion hydro thay thế ion kim loại trong nhóm cacboxyl củaphân tử pectin sau khi đã tẩy được axit pectic ra khỏi muối của nó (muối pectat khôngtham gia quá trình tạo đông) [12]

- Nồng độ tối thiểu của ion hydro để tạo ra đông tụ là 3,46 Nồng độ ion H+ cànglớn thì khả năng tạo gel càng cao Nhưng nếu cao quá sẽ gây kết tinh glucoza và hóagel nhanh gây vón cục Mức độ tạo gel chỉ tăng đến một giới hạn nào đó của nồng độaxit rồi ngừng lại [12]

 Ion Ca 2+

Ca2+ ngoài việc giúp tạo gel cùng với pectin còn giúp trung hòa bớt lượng axit gây

ra vị chua quá cho sản phẩm

1.3 ỨNG DỤNG CỦA ENZIM TRONG SẢN XUẤT SỮA CHUA TRÁI CÂY

1.3.1 Giới thiệu về sản phẩm sữa chua trái cây

Sữa chua trái cây là một sản phẩm được kết hợp giữa sữa chua và trái cấy nhằmlàm tăng giá trị dinh dưỡng cũng như tạo ra sự đa dạng của sản phẩm sữa chua Hiệnnay những loại trái cây người ta thường sử dụng để làm sữa chua trái cây như xoài,dâu, chuối …

Hình 1.5 Sữa chua trái cây.

Trên thị trường hiện nay có hai dạng sữa chua trái cây chủ yếu đó là dạng pree vàdạng miếng trái cây được cắt nhỏ sau đó bổ sung vào sữa chua, nhưng đối với sảnphẩm sữa chua dạng miếng người ta chỉ chế biến và sử dụng ngay mà không thể bảoquản được thời gian dài vì trong quá trình bảo quản các miếng trái cây sẽ bị nhũn đilàm ảnh hưởng tới cảm quan sản phẩm [5]

1.3.2 Ứng dụng của enzim pectinaza trong sữa chua xoài

Mục đích sử dụng enzim pectinaza trong sản xuất sữa chua xoài đó là sử dụngenzim pectinaza để thủy phân thành phần pectin có trong xoài nhằm làm tăng khả nănglien kết của pectin với ion Ca2+ tạo thành liên kết mạng trong phân tử pectin làm chocấu trúc của miếng xoài được ổn định và không bị nhũn đi trong quá trình bảo quản.Khi pectin ở trạng thái không bị enzim pectinaza thủy phân thì trong phân tử pectin có

rất ít các cầu nối với ion Ca2+ chính vì thể khổng thể làm cho cấu trúc của trái cây được

ổn định

Hình 1.6 Pectin trước khi bị thủy phân (a), pectin sau khi bị thủy phân và tạo liên kết

mạng với Ca 2+ (b).

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Enzim pectinaza được tổng hợp từ chủng B subtilis và chủng A Niger.

- Xoài được mua từ chợ Thanh Bình – Đà nẵng, chọn các quả có độ chin đồngđều vàng tươi không bị hư hỏng dập nát, không nên chọn quả chín quá vì sẽ có mùirượu ảnh hưởng tới sản phẩm

- Sữa chua lên men từ sữa đặc có đường pha loảng theo tỷ lệ 1:2 với nước

- Muối CaCl2

2.3 THIẾT BỊ VÀ DUNG CỤ

- Thiết bị : kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử….

- Dụng cụ : ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, pipet,micropipete, ống đong, nhiệt kế, giá để ống nghiệm,….tất cả các ống nghiệm khi tiếnhành được hấp tiệt trùng ở 1210C trong vòng 20 phút

2.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

2.4.1 Môi trường hoạt hóa

2.4.1.1 Môi trường hoạt hóa vi khuẩn B subtilis

Môi trường dùng để hoạt hóa vi khuẩn B subtilis là môi trường thạch Czapek

nuôi vi khuẩn Thành phần môi trường xem ở phần mục lục

Môi trường nuôi nấm mốc A Niger là môi trường thạch Czapek nuôi nấm mốc.

Thành phần môi trường xem ở phần phụ lục

2.4.2 Môi trường tổng hợp pectinaza

2.4.2.1 Môi trường tổng hợp pectinaza từ vi khuẩn B subtilis

Môi trường tổng hợp pectinaza từ vi khuẩn B subtilis là môi trường lỏng Czapek

có bổ sung thành phần pectin làm chất cảm ứng Thành phần môi trường xem ở phầnphụ lục

2.4.2.2 Môi trường tổng hợp pectinaza từ nấm mốc A niger

Môi trường tổng hợp pectinaza từ chủng nấm mốc A Niger là môi trường lỏng

Czapek có bổ sung thành phần pectin làm chất cảm ứng Thành phần môi trường xem ởphần phụ lục

2.5 NỘI DUNG.

- Hoạt hóa chủng B subtilis từ gói Bio Subty I-II và hoạt hóa chủng A niger từ

ống giống gốc

- Sinh tổng hợp enzim pectinaza từ chủng B subtilis và chủng A niger.

Tiến hành khảo sát so sánh hoạt lực được sinh ra từ chủng B subtilis và chủng

A niger.

- Chọn chủng có khả năng sinh enzim pectinaza có hoạt lực mạnh hơn để tiếnhành sinh tổng hợp enzim pectinaza

- Tiến hành cắt nhỏ xoài và làm cứng cấu trúc của xoài

2.6 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU.

2.6.1 Phương pháp vi sinh

2.6.1.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn B subtils từ gói Bio Subty I-II

 Phương pháp tiến hành nuôi cấy

Chuẩn bị : 6 ống nghiệm, 1 bình tam giác 250 ml, đèn cồn, 1 pipet 10 ml, 1micropipetpe 1ml, 1 con dao, 1 que gạt, 1 ống đong 100ml khô sạch đã đươc tiệt trùng

ở 1210C trong vòng 20 phút bằng nồi hấp tiệt trùng (autoclave) và 5 đĩa petri đã được

phối môi trường thạch Czapek nuôi vi khuẩn và được hấp tiệt trùng ở 1210C trong vòng

20 phút , 1 gói Bio subty I-II 1g, nước tinh khiết đã qua tiệt trùng ở 1210C trong vòng

20 phút

Cách tiến hành: Dùng pipet 10 ml lấy 9 ml nước tinh khiết cho vào 6 ống nghiệm

đã được đánh số từ 1 đến 6 và đặt lên giá đỡ Dùng dao cắt gói Bio Subty I-II rồi chovào bình tam giác 250 ml, sau đó dùng ống đong đong 100 ml nước tinh khiết đã đượcchuẩn bị cho vào bình tam giác, tiến hành lắc đều, sau đó dùng micropipet 1 ml hútchính xác 1 ml ở bình tam giác cho vào ống nghiệm thứ nhất, tiến hành lắc đều ốngnghiệm số 1 trong vòng 3 phút, tiếp theo lấy 1 ml dịch ở ống nghiệm thứ nhất cho vàoống nghiệm số 2 và tiến hành lắc trong 3 phút cứ làm như thế cho đến ống nghiệm số 6[1,2]

Sau khi đã tiến hành pha loảng giống ta tiến hành phân phối dịch vào môi trườngbằng cách hút một ít dịch ở ống nghiệm số 6 và số 5 cho vào đĩa petri đã chuẩn bị (ống

số 5 hai đĩa, ống số 6 ba đĩa), sau đó dùng que gạt được đun nóng và để nguội gạt đềudịch lên bề mặt của môi trường và tiến hành nuôi cấy ở 370C

 Phương pháp tiến hành nhân giống

Sau khi tiến hành nuôi cấy trong 72h ta tiến hành nhân giống bằng cách chọnnhững đĩa giống không bị nhiểm sau đó cấy chuyền sang nhiều đĩa petri [1,2]

 Phương pháp tiến hành cấy giống bảo quản giống

2.6.1.2 Hoạt hóa chủng nấm mốc A niger từ ống giống gốc

 Phương pháp tiến hành nuôi cấy

Dùng que cấy đã được tiệt trùng bằng ngọn lửa đèn côn tiến hành lấy một ít nấmmốc từ ống giống cấy vào đĩa petri đã được phân phối môi trường thạch Czapek nuôinấm mốc và tiệt trùng ở 1210C trong vòng 20 phút sau đó đem ủ vào tủ ấm ở nhiệt độ

280C [1,2]

 Phương pháp tiến hành cấy giống bảo quản

Sau khi vi sinh vật đã phát triển tốt ở đĩa petry thì tiến hành cấy chuyền sang ốngthạch nghiêng đã được chuẩn bị trước và được tiệt trùng ở 1210C trong vòng 20 phút,thực hiện cấy ở điều kiện vô trùng tránh bị nhiểm vi sinh vật.

2.6.1.3 Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp của hai chủng B subtilis và A niger

 Mục đích

Xác định thời gian thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza đối với

hai chủng A subtilis và B.niger

 Nguyên tắc

Dựa vào hoạt lực của enzim pectinaza đo được từ các dung dịch nuôi cấy có thờigian nuôi cấy khác nhau, từ đó xác định được thời gian nuôi cấy thích hợp tương ứngvới dung dịch enzim có hoạt lực lớn nhất

 Cách tiến hành

Chuẩn bị 10 bình tam giác thủy tinh 250 ml có nut mài, sau đo chia làm 2,5 bình

nuôi cấy A niger và 5 bình nuôi B subtilis Tất cả các bình được đánh số 48h, 72h, 96h, 120h, 144h sau đó phối môi trường nuôi cấy đối với từng A niger và B subtilis

tương ứng môi trường được xác định ở mục 1.4 và 1.3 mục phụ lục rồi đem tiệt trùng ở

1210C trong 20 phút và làm nguội [2]

2.6.1.4 Phương pháp xác định hàm lượng chất cảm ứng pectin tới khả năng sinh enzim pectinaza

 Mục đích

Xác định hàm lượng pectin bổ sung vào môi trường cho khả năng sinh enzim

pectinaza tối đa cho cả hai chủng A niger và chủng B subtilis.

 Nguyên tắc

Dựa vào hoạt lực enzim pectinaza thay đổi do sự thay đổi của hàm lượng chấtcảm ứng pectin trong môi trường từ đó xác định được hàm lượng pectin phù hợp bổsung vào môi trường cho khả năng sinh enzim là tốt nhất