- Hoạt hóa chủng B.subtilis từ gói Bio Subty III và hoạt hóa chủng A.niger từ ống giống gốc.
SUBTILIS VÀ A NIGER.
24 Sữa đông thành khối ít mịn, không tách nước.
SUBTILIS VÀ A NIGER.
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng chất cảm ứng tới khả năng sinh enzim pectinaza
Để có thể xác định được hàm lượng chất cảm ứng (pectin) bổ sung vào môi trường để hai chủng B. subtilis và chủng A. niger có khả năng sinh ra enzim pectinaza có hoạt lực cao nhất thì chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm bằng phương pháp được đề cập ở mục 2.6.2.1 kết quả thí nghiệm được xác định ở hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin tới hoạt lực của enzim pectinaza.
Sau khi thực hiện xong nghiên cứu chúng tôi nhận thấy đối với cả hai chủng A. niger và chủng B. subtilis kết quả đo được từ 1g đến 3g hoạt độ của enzim pectinaza tăng lên đáng kể và đạt đỉnh ở hàm lượng pectin là 3g với A. niger (343.67U/ml), B.
pectin tăng lên 4g và 5g. Nguyên nhân là do khi lượng vi sinh vật thủy phân cơ chất sẽ tạo ra axit, lượng axit sinh ra càng nhiều khi lượng cơ chất càng lớn. ở mức cơ chất pectin là 3g lúc này enzim pectinaza sẽ thủy phân hết và tạo ra một lượng axit nhất định và làm giảm pH của dung dịch bằng với điểm dưới pH tối ưu của hai chủng B. subtilis và A. niger vì thế hoạt lực của enzim pectinaza lúc này đo được là cao nhất, nhưng khi tăng hàm lượng cơ chất lên 4g và 5g thì hoạt lực của enzim giảm vì lúc này nồng độ cơ chất lớn enzim thủy phân tạo ra lượng axit lớn làm pH giảm mạnh vì thế làm pH xuống mức pH tối ưu của hai chủng A. niger và B. subtilis gây ức chế cho sự tổng hợp pectinaza vì thế hoạt lực pectinaza lúc này giảm. Như vậy với hàm lượng chất cảm 3g trong 100g môi trường thì khả năng sinh enzim pectinaza của hai chủng A. niger và chủng B. subtilis là tốt nhất.
3.2.2. Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp của hai chủng B. subtilis và A. niger
Thời gian nuôi cấy là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzim cao hay thấp, do hoạt tính của enzim phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào vi sinh vật. Do đó thí nghiệm được tiến hành để khảo sát thời gian nuôi cấy nấm mốc cũng như vi khuẩn (48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 144 giờ), từ đó tìm ra được thời gian thích hợp chủng nấm A. niger và chủng vi khuẩn B. subtilis phát triển tối ưu để sinh enzim pectinaza. Trong nghiên cứu này thành phần dinh dưỡng cũng như pH môi trường đề thích hợp cho cả hai chủng vi sinh vật và được ủ ở nhiệt độ phòng. Thành phần môi trường nuôi A. niger và B. subtilis để sinh tổng hợp pectinaza đã được lựa chọn tương ứng ở bảng 1.4 và bảng 1.3 mục phụ lục 1. Kết quả được tính toán thống kê, thể hiện ở bảng 2.1 mục phụ lục, và hình 3.6.
Hình 3.6.Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến hoạt tính pectinaza sinh ra từ B. subtilis và A. niger.
Đối với B. subtilis
Hiệu suất thu nhận pectinaza tăng dần theo thời gian nuôi từ 48 giờ (268.7 U/ml) đến 72 giờ (342.85 U/ml), sau đó giảm dần. Ứng với thời gian 48 giờ, vi khuẩn B. subtilis ở giai đoạn này đã thích nghi với môi trường nên mật độ tăng đáng kể, quá trình sinh tổng hợp enzim pectinaza gia tăng đang kể. Sau 72 giờ nuôi thì chúng tôi đo được hoạt tính của enzim pectinaza với hoạt lực cao nhất và sao đó giảm dần, điều đó chứng tỏ khả năng sinh enzim pectinaza tốt nhất đối với B. subtilis là sau 72 giờ ủ và đây cũng chính là giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất của B. subtilis. Sau giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì sẽ chuyển sang giai đoạn suy vong số tế bào chết đi nhiều hơn số tế bào tạo thành trong điều kiện cơ chất đã cạn kiệt nên không thể tăng trưởng được nữa (Lê Xuân Phương, 2007). Do đó nếu kéo dài thời gian nuôi cấy thì hoạt tính Pectinaza sẽ giảm xuống.
Đối với A.niger
Hiệu quả thu pectinaza tăng dần theo thời gian nuôi từ 48 giờ (68.323 U/ml) đến 96 giờ (368.53 U/ml), sau đó giảm dần. Ứng với thời gian ủ 48 giờ nấm mốc A. niger ở giai đoạn này bắt đầu thích nghi với điều kiện môi trường nên chúng chưa gia tăng mật độ đáng kể, quá trình tổng hợp enzim đang ở giai đoạn khởi đầu, dẫn đến hiệu suất và hoạt tính pectinaza thu được khá thấp. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như đặc tính môi trường, hàm lượng dưỡng chất và điều liện sinh lí của quá trình nuôi.
Theo nghiên cứu của Aguilar và Huitron (1990); Galiotou-Panayotou và Kapantai (1993); Solis-Perayra et al, (1993) cho thấy, thời gian nuôi tối ưu cho quá trình lên men
A. niger sinh pectinaza thay đổi trong khoảng 90 đến 120 giờ. Trong giai đoạn này nấm mốc đã hoàn toàn thích nghi với điều kiện môi trường và gia tăng mật số rất nhanh đồng thời với việc tổng hợp enzim tăng mạnh. Đây chính là thời điểm tốt nhất để thu nhận enzim.
Tóm lại, thời gian 96 giờ là thích hợp nhất để thu chế phẩm enzim, đây cũng là thời gian ủ tối ưu tương đồng với nghiên cứu của Joshi (2006) trên cơ chất bã táo cũng
như khảo sát của Patil và Dayanand (2006) khi khảo sát khả năng sinh pectinaza từ A. niger với cơ chất là dầu hạt hướng dượng.
Nhận xét :
Sau khi thực hiện xong thí nghiệm nghiên cứu sự phụ thuộc của thời gian nuôi cấy tới hoạt tính của hai chủng vi khuẩn B. subtilis và chủng nấm mốc A. niger chúng tôi đã thu được kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.6. Dựa vào đó chúng tôi nhận thấy rằng thời gian thích hợp để ủ chủng B. subtilis có hoạt lực enzim cao nhất (342,85) là 72 giờ và thời gian thích hợp để ủ chủng A. niger có hoạt lực cao nhất (368.53) là 96 giờ. 3.2.3. Kết quả so sánh hoạt lực enzim pectinaza của chủng A. niger và B. subtilis
Sau khi xác định được các điều kiện nuôi cấy thích hợp để tổng hợp enzim pectinaza đối với hai chủng A. niger và B. subtilis, phương pháp xác định được đề cập ở mục 2.6.1.5 thì chúng tôi tiến hành so sánh hoạt lực của enzim để xác định được chủng vi sinh vật thích hợp để sinh tổng hợp enzim pectinaza cho quá trình nghiên cứu. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.2 và hình
a b
Hình 3.7.Vòng bán kính thủy phân của (a) B.subtilis và (b) A. subtilis.
Từ kết quả đo hoạt lực enzim pectinaza ở bảng 3.2 và đo vòng bán kính thủy phân hình 3.6 (vòng bán kính thủy phân của B. subtilis là 1.88 cm, A. niger là 2.51 cm) chúng tôi nhận thấy một điều là trong cùng một điều kiện thích hợp cho hai chủng vi
sinh vật thì khả năng sinh enzim pectinaza của chủng A. niger là tốt hơn so với chủng
B. subtilis.
Sau khi tiến hành xong thí nghiệm nghiên cứu đánh giá hoạt lực enzim pectinaza dựa vào vòng bán lính thủy phân trên môi trường thạch pectin chúng tôi đã thu được kết quả được thể hiện ở hình 3.6. Dựa vào đó bán kính thủy phân pectin do enzim pectinaza được sinh tổng hợp từ hai chủng A. niger (2,51 cm) và B. subtilis (1,88 cm) thì vòng bán kính thủy phân của enzim được tổng hợp từ chủng A. niger lớn hơn chủng
B. subtilis đồng nghĩa với hoạt độ của enzim pectinaza được tổng từ chủng A. niger lớn hơn chủng B. subtilis. Chính vì thế chúng tôi đã chọn chủng nấm mốc A. niger để sinh tổng hợp enzim pectinaza cho quá trình nghiên cứu sản xuất sữa chua xoài.
3.3. KẾT QUẢ SINH TỔNG HỢP ENZIM PECTINAZA.
Tiến hành nuôi cấy chủng A. niger với thành phần môi trường được trình bày trong bảng 1.4 mục phụ lục 1. Tiến hành nuôi cấy bằng canh trường bề sâu với các thông số: nhiệt độ 280C, điều chỉnh độ pH =5.5, hàm lượng chất cảm ứng pectin 3%. Kết quả thu nhận dịch enzim được ghi nhận trong hình 3.6.
Sau khi kết thúc 96 giờ nuôi cấy ta tiến hành lọc dung dịch thì thu được dung dịch enzim thô, sau đó tiến hành đo hoạt lực của enzim pectinaza thì nhận thấy hoạt lực của
enzim khá cao (384.67 U/ml), điều đó cho thấy quá trình tiến hành nuôi cấy đạt hiệu quả tốt.
3.4. KẾT QUẢ XỬ LÝ XOÀI BẰNG ENZIM PECTINAZA VÀ MUỐI CaCl2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quá trình xử lý xoài với enzim pectinaza và muối CaCl2 thực hiện qua sáu thí nghiệm đã được trình bày trong bảng 3.2. Kết quả thu được trong quá trình thí nghiệm được xác định ở bảng 3.3, bảng 2.1 phụ lục2.
Bảng 3.2.Quá trình xử lý xoài với enzim pectinaza và muối CaCl2.
Mẫu Điều kiện xử lý xoài
1 Không xử lý
2 Xử lý xoài với nước ở 40oC trong 20 phút rồi ngâm trong dung dịch CaCl20,15% trong30 phút. 30 phút.
3 Xử lý xoài với nước ở 90oC trong 4 phút rồi ngâm trong dịch trích enzim ở 40oC, 20phút sau đó ngâm trong dung dịch CaCl2 0,15% trong 30 phút. phút sau đó ngâm trong dung dịch CaCl2 0,15% trong 30 phút.
4 Xử lý xoài với nước ở 90oC trong 4 phút rồi ngâm trong dịch trích enzim bổ sung dungdịch hổn hợp đệm citrate phosphate ở 400C trong 20 phút sau đó ngâm trong CaCl2