ĐẶT VẤN ĐỀ Human Papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư đứng hàng thứ hai trong các loại ung thư ở nữ giới . Hàng năm trên thế giới, ước tính có khoảng 529.000 trường hợp mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triểnFerlay et al., 2010. Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục Ferlay et al., 2010; WHO, 2010. Cùng với sự tăng nhanh tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới. HPV thuộc họ papillomaviridea với hơn 200 genotype khác nhau về vật liệu di truyền trong đó đã được xác định khoảng 100 genotype, và khoảng 40 genotype HPV đã được xác định ở niêm mạc đường sinh dục người Burd, 2003,Munoz et al., 2006. Những genotype HPV nguy cơ cao gây tăng sinh, loạn sản và gây biến đổi tế bào cổ tử cung dẫn đến ung thư thường thuộc loại alpha mucosotropic 5, 6, 7, 9, 11 Bouvard et al., 2009; Schiffman et al., 2010. Tám genotype HPV (HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, và 58) được thống kê là những genotype phổ biến nhất, có liên quan tới hơn 90% các trường hợp UTCTC trên toàn thế giới và riêng HPV 16, 18 gặp ở 70% các trường hợp Munoz et al., 2003; Clifford et al., 2006. HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư hậu môn, âm hộ, âm đạo, dương vật, ung thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh cảnh lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dụchậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinh.... Hiện nay, vắc xin phòng chống HPV16 và HPV18 đã góp phần đáng kể trong việc giảm tỷ lệ UTCTC trên thế giới Harper et al., 2006; Wheeler, 2007. Tuy nhiên, sự phân bố các genotype HPV lại thay đổi theo từng vùng địa lý và theo từng sắc tộc khác nhau. Hơn nữa, khả năng bảo vệ chéo của vắc xin phòng chống HPV16, 18 được chứng minh là kém hiệu quả hơn đối với các genotype nguy cơ cao khác Wheeler et al., 2012.. Theo kết quả nghiên cứu dịch tễ học, HPV16 và HPV18 là những genotype phổ biến nhất tại châu Âu và châu Mỹ Clifford et al., 2005, ngược lại ở châu Á, HPV16, HPV52 và HPV58 là những genotype chiếm tỷ lệ cao nhất Bao et al., 2008.Tại Nhật Bản, Philippine, Đài Loan và tỉnh Chiết Giang phía nam Trung Quốc, HPV52 được xác định là genotype HPV thường gặp nhất Lin et al., 2006; de Sanjose´ et al., 2007; Miyashita et al., 2009; Ye et al., 2010. Vì vậy, nghiên cứu về sự phân bố dịch tễ học genotype HPV liên quan tới sự biến đổi tế bào là những thông tin rất cần thiết cho chương trình triển khai vắc xin phòng chống HPV và kế hoạch triển khai các phương pháp phát hiện, sàng lọc sớm HPV trong cộng đồng. Tại Việt nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2010, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất ở nữ lứa tuổi 15 44, với hơn 6000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 11,7 trên 100,000 phụ nữ) và tử vong hơn 3000 trường hợp mỗi năm WHO, 2010. Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn tiến từ nhiễm vi rút đến ung thư thường trải qua trong một thời gian dài. Quá trình tiến triển từ mức độ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) và đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 25 năm zur Hausen, 2011. Đây chính là cơ hội có ý nghĩa cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc những người có nguy cơ mắc UTCTC nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm. Tuy nhiên, ở Việt nam việc sàng lọc tế bào học (xét nghiệm Pap smear) và phát hiện HPV DNA còn chưa phổ biến rộng rãi WHO, 2002. Hơn nữa, các kết quả nghiên cứu về sự phân bố dịch tễ học HPV trong cộng đồng còn hạn chế Bao et al., 2008. Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc các định genotype HPV cũng như xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài Xác định tỷ lệ nhiễm Human Papillomavirus và yếu tố sự biến đổi tế bào học và các genotype HPV trên gái mại dâm, Hải Phòng, Việt Nam được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm Human Papillomavirus và một số yếu tố liên quan trên đối tượng gái mại dâm tại Hải Phòng. 2. Khảo sát sự phân bố genotype của HPV ở gái mại dâm nhiễm HPV. 3. Đánh giá sự liên quan giữa sự biến đổi tế bào học và các genotype HPV.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ HỒNG ĐIỆP XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM HUMAN PAPILLOMAVIRUS VÀ YẾU TỐ BIẾN ĐỔI TẾ BÀO HỌC VÀ CÁC GENOTYPE HPV TRÊN GÁI MẠI DÂM TẠI HẢI PHÒNG, VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH Y HỌC Mã số: 62.72.04.01 Hướng dẫn khoa học: GS.TS TẠ TRẦN TUẤN PGS.TS NGUYỄN THANH HÀ HÀ NỘI - 2015 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT FDA LCR SD HPV HIV HCV HBV N gonorrhoeae C trachomatis PCR DNA RNA dNTP TM G3PDH bp SDS EDTD gp OD ASC-US ASC-H : United State Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ : Long Control Region Vùng điều hòa dài : Standard Deviation Độ lệch chuẩn : Human Papillomavirus Virus gây u nhú người : Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải người : Hepatitis C virus Virus viêm gan C : Hepatitis B virus Virus viêm gan B : Neisseria gonorrhoeae : Clamydia trachomatis : Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi : DeoxyRibonucleic Acid : RiboNucleic Acid : Deoxyribonucleotide triphosphate : Melting temperature Nhiệt độ biến tính : Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase : base pair Cặp bazơ : Sodium Dodecyl Sulphate : EthyleneDiamineTetraacetic Acid : Glycoprotein : Optical Density Mật độ quang : Atypical squamous cell of undetermined significance Tế bào biểu mơ gai khơng điển hình, ý nghĩa chưa xác định : Atypical squamous cell cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion Tế bào biểu mơ gai khơng điển hình chưa loại trừ tổn LSIL : HSIL : NILM : CIN : thương nội biểu mô gai mức độ cao Low-grade squamous intraepithelial lesion Tổn thương nội biểu mô gai mức độ thấp High-grade squamous intraepithelial lesion Tổn thương nội biểu mô gai mức độ cao Negative for Intraepithelial lesion or malignancy Khơng có tổn thương biểu mơ tổn thương ác tính Cervical intraepithelial neoplasia Tân sản nội biểu mô ĐẶT VẤN ĐỀ Human Papillomavirus (HPV) tác nhân thường gặp nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư đứng hàng thứ hai loại ung thư nữ giới [] Hàng năm giới, ước tính có khoảng 529.000 trường hợp mắc UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp 85% tổng số trường hợp bệnh gặp nước phát triển[Ferlay et al., 2010] Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc toàn giới đặc biệt khu vực Nam Á Đơng Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao châu lục [Ferlay et al., 2010; WHO, 2010] Cùng với tăng nhanh tỷ lệ nhiễm HPV cộng đồng, UTCTC thực trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe tâm lý nữ giới HPV thuộc họ papillomaviridea với 200 genotype khác vật liệu di truyền xác định khoảng 100 genotype, khoảng 40 genotype HPV xác định niêm mạc đường sinh dục người [Burd, 2003],[Munoz et al., 2006] Những genotype HPV "nguy cao" gây tăng sinh, loạn sản gây biến đổi tế bào cổ tử cung dẫn đến ung thư thường thuộc loại alpha mucosotropic - 5, -6, -7, -9, -11 [Bouvard et al., 2009; Schiffman et al., 2010] Tám genotype HPV (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -45, -52, -58) thống kê genotype phổ biến nhất, có liên quan tới 90% trường hợp UTCTC toàn giới riêng HPV -16, -18 gặp 70% trường hợp [Munoz et al., 2003; Clifford et al., 2006] HPV khơng có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà cịn có vai trị quan trọng hình thành ung thư hậu mơn, âm hộ, âm đạo, dương vật, ung thư phổi số ung thư vùng hầu họng Đồng thời, HPV nguyên nhân nhiều bệnh cảnh lâm sàng da niêm mạc hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú quản trẻ sơ sinh [] Hiện nay, vắc xin phòng chống HPV-16 HPV-18 góp phần đáng kể việc giảm tỷ lệ UTCTC giới [Harper et al., 2006; Wheeler, 2007] Tuy nhiên, phân bố genotype HPV lại thay đổi theo vùng địa lý theo sắc tộc khác Hơn nữa, khả bảo vệ chéo vắc xin phòng chống HPV-16, -18 chứng minh hiệu genotype "nguy cao" khác [Wheeler et al., 2012.] Theo kết nghiên cứu dịch tễ học, HPV-16 HPV-18 genotype phổ biến châu Âu châu Mỹ [Clifford et al., 2005], ngược lại châu Á, HPV-16, HPV-52 HPV-58 genotype chiếm tỷ lệ cao [Bao et al., 2008].Tại Nhật Bản, Philippine, Đài Loan tỉnh Chiết Giang phía nam Trung Quốc, HPV-52 xác định genotype HPV thường gặp [Lin et al., 2006; de Sanjose´ et al., 2007; Miyashita et al., 2009; Ye et al., 2010] Vì vậy, nghiên cứu phân bố dịch tễ học genotype HPV liên quan tới biến đổi tế bào thông tin cần thiết cho chương trình triển khai vắc xin phịng chống HPV kế hoạch triển khai phương pháp phát hiện, sàng lọc sớm HPV cộng đồng Tại Việt nam, theo thống kê Tổ chức Y tế giới năm 2010, UTCTC loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nữ lứa tuổi 15 -44, với 6000 ca nhiễm (tỷ lệ: 11,7 100,000 phụ nữ) tử vong 3000 trường hợp năm [WHO, 2010] Điều đặc biệt quan tâm phần lớn trường hợp UTCTC thường phát giai đoạn muộn, trình diễn tiến từ nhiễm vi rút đến ung thư thường trải qua thời gian dài Quá trình tiến triển từ mức độ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư chỗ (giai đoạn tổn thương phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập kéo dài từ 10 - 25 năm [zur Hausen, 2011] Đây hội có ý nghĩa cho việc phát nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy mắc UTCTC nhằm giúp trình điều trị hiệu tổn thương tiền ung thư ung thư giai đoạn sớm Tuy nhiên, Việt nam việc sàng lọc tế bào học (xét nghiệm Pap smear) phát HPV DNA chưa phổ biến rộng rãi [WHO, 2002] Hơn nữa, kết nghiên cứu phân bố dịch tễ học HPV cộng đồng hạn chế [Bao et al., 2008] Với tầm quan trọng ý nghĩa việc định genotype HPV xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài " Xác định tỷ lệ nhiễm Human Papillomavirus yếu tố biến đổi tế bào học genotype HPV gái mại dâm, Hải Phòng, Việt Nam " thực với mục tiêu sau: Xác định tỷ lệ nhiễm Human Papillomavirus số yếu tố liên quan đối tượng gái mại dâm Hải Phòng Khảo sát phân bố genotype HPV gái mại dâm nhiễm HPV Đánh giá liên quan biến đổi tế bào học genotype HPV CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 Đặc điểm chung Human Papillomavirus (HPV) Hình thái cấu trúc HPV HPV nhóm vi rút có kích thước nhỏ, họ Papillomavirideae, khơng vỏ, đối xứng xoắn ốc Hạt vi rút có đường kính 52-55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer Mỗi đơn vị capsid gồm pentamer protein cấu trúc L1 kết hợp với protein L2 (protein thành phần kháng nguyên sử dụng phản ứng miễn dịch đặc hiệu) L2 protein L1 capsomer (Pentamer protein L1) DNA hai chuỗi, hình vịng (8kb) Hình 1.1 Hạt vi rút HPV Cả hai protein cấu trúc vi rút tự mã hóa: Protein capsid (L1) có kích thước khoảng 55kd chiếm khoảng 80% tổng số protein vi rút Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70kd 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc chức 1.1.2.1 Đặc điểm cấu trúc gen HPV HPV có vật liệu di truyền DNA, mạch đơi khơng hồn chỉnh, tồn dạng siêu xoắn hình vịng (circular ds-DNA) Bộ gen vi rút chiếm khoảng 12% trọng lượng hạt vi rút, có chiều dài khoảng 7800 đến 8000 cặp base (bp) guanosine cytosine chiếm 42% DNA vi rút liên kết với histone tế bào chủ tạo thành cấu trúc phức hợp giống chromatin (Chromatin-like complex) Cấu trúc gen nhóm Papillomavirus nói chung tương tự lồi vật chủ tất khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) vi rút chuỗi DNA Điều có nghĩa tất gen vi rút nằm mạch DNA trình phiên mã xảy mạch Bộ gen HPV có 10 khung đọc mở ORF chia làm hai loại khung đọc mở sớm khung đọc mở muộn tùy theo vị trí ORF gen [Lowy] Hình 1.2 Cấu trúc gen Papillomavirus HPV 16 Bộ gen HPV chia làm ba vùng quan trọng [Lowy]: Vùng điều hòa thượng nguồn URR (Upstream Regulatory Region) hay gọi vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region), chứa DNA khơng mã hóa, có chức điều hịa q trình chép DNA trình phiên mã Đây vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài gen, tương đương 800 đến 1000 bp tùy theo genotype khác Trình tự vùng URR bao gồm: o Trình tự tăng cường: nơi gắn nhân tố phiên mã AP-1, NF1, otc 1, TEF1, TEF2, YY1… o Promoter cho trình phiên mã tổng hợp RNA (P97 HPV16 P105 HPV18) Promoter bao gồm cấu trúc TATA vùng khởi đầu phiên mã o Điểm khởi đầu chép ORI, tiểu phần kích hoạt số chuỗi gen câm (Silencing gene)… Vùng gen sớm (Early region): Gồm gen, ký hiệu E1, E2, E4, E5, E6, E7 khung đọc mở ORF Sản phẩm vùng gen protein chức giúp cho trình nhân lên DNA vi rút, gây tượng tăng sinh tế bào gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào Vùng gen muộn (Late region): Gồm gen tổng hợp protein L1 L2, protein cấu trúc capsid vi rút Đây vùng gen mã hóa muộn hơn, nên vùng chứa gen L1 gen L2 gọi vùng chép muộn Hình 1.3 Cấu trúc gen HPV dạng mạch thẳng 1.1.2.2 Chức gen sản phẩm gen HPV • Chức gen E1 HPV vi rút sử dụng hoàn toàn thành phần tế bào chủ để chép DNA Gen E1 hai vùng gen bảo tồn HPV (cùng với L1) mã hóa protein chức có vai trị cần thiết cho q trình chép DNA plasmid Gen E1 gắn vào vị trí khởi đầu trình nhân lên (ori), thực trình chia tách DNA (helicase) giúp chuỗi gen vi rút duỗi trình chép Hoạt động tháo xoắn gen E1 không phụ thuộc ATP Tại thể sống, gen E1 E2 đóng vai trị quan trọng điều chỉnh q trình nhân lên vi rút Gen E2 cịn có khả gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) protein E1 Tuy nhiên, hai chức E2 gen E1 điều chỉnh Trong q trình chép vi rút, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gen E1 DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 yếu tố chép A gen E1 có khả trực tiếp thúc đẩy thành phần • Chức gen E2 Ngoài chức chép DNA vi rút, gen E2 cịn đóng vai trị chủ đạo q trình phiên mã q trình điều hịa giải mã trì chuỗi gen vi rút ngồi nhiễm sắc thể Chức điều hịa giải mã gen E2 thực gắn kết với E2BSs chuỗi gen vi rút có lực với gen E2 vị trí liên quan xác định hiệu gen E2 trình giải mã Ở chuỗi gen HPV nhóm "nguy cao", gen E2 có khả ức chế trình chép từ yếu tố thúc đẩy bộc lộ gen sớm vi rút, gen HPV nhóm "nguy cao" xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủsẽ làm tăng khả bộc lộ gen gây ung thư E6 E7 • Chức gen E1^E4 Giống protein khác HPV, protein điều hòa E1^E4 sản phẩm tạo từ mRNA kết nối vòng mở dịch chuyển gen E1 E4, có chức giúp cho q trình trưởng thành phóng thích vi rút khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ Gen E1^E4 chứa dạng tác động vào chu kỳ sống vi rút gồm: (1) Dạng gen chứa nhiều leucine đầu tận N liên quan đến keratin cần thiết cho nhân lên DNA; (2) Vùng chừa nhiều proline đoạn trung tâm, chứa vị trí threonine cần thiết cho khoảng nghỉ chu kỳ tế bào giai đoạn G2/M giải mã phức hợp cyclinB/cdk1 bào tương; (3) Đầu tận C chứa domain đơn dạng kiểu niêm mạc điều hòa khả gen E1^E4 tạo olimerize, gắn với DEADbox RNA helicase tạo phá vỡ hệ thống sợi keratin Đơn nhiễm genotype "nguy thấp" Đơn nhiễm genotype "chưa xác định nguy cơ" 18 Loại đa nhiễm 167 Đa nhiễm genotype "nguy cao" 75 Đa nhiễm genotype "nguy cao + nguy thấp" 60 Đa nhiễm genotype "nguy cao + chưa xác định nguy 20 cơ" Đa nhiễm genotype "nguy cao + nguy thấp + chưa 12 xác định nguy cơ" Đa nhiễm genotype "nguy thấp" Đa nhiễm genotype "chưa xác định nguy thấp" 7,31 2,84 67,89 30,5 24,39 8,13 4,87 0 Đa nhiễm HPV "nguy cao": 30,5% Đa nhiễm HPV "nguy cao + nguy thấp": 24,39% Đa nhiễm HPV "nguy cao + chưa xác định nguy cơ": 8,13% Đa nhiễm HPV "nguy cao + nguy thấp + chưa xác định nguy cơ": 4,87% Đơn nhiễm HPV "nguy cao": 21,96% Đơn nhiễm HPV "nguy thấp": 7,31% Đơn nhiễm HPV "chưa xác định nguy cơ": ,84% 24,39 8,13 4,87 30,5 21,96 2,84 7,31 Hình 3.5 Tình trạng đơn nhiễm đa nhiễm genotype HPV GMD Hải Phòng Nhận xét: + Từ 246 trường hợp nhiễm HPV, có 79 trường hợp đơn nhiễm genotype HPV (32,11%) 167 trường hợp đa nhiễm genotype HPV (nhiễm ≥ genotype HPV) chiếm 67,89% + Tình trạng đa nhiễm genotype HPV "nguy cao" chiếm tỷ lệ cao nhất: 30,3%, đa nhiễm genotype HPV "nguy cao + nguy thấp" chiếm 24,39% tiếp đến tình trạng đơn nhiễm genotype HPV "nguy cao" chiếm 21,96% + Tình trạng đơn nhiễm genotype HPV đa nhiễm genotype HPV "nguy thấp + chưa xác định nguy cơ" chiếm tỷ lệ thấp 3.2.2.3 Một số yếu tố liên quan đến tình trạng đơn nhiễm đa nhiễm genotype HPV Lựa chọn yếu tố liên quan có ý nghĩa thống kê với tình trạng nhiễm HPV để phân tích mối liên quan với tình trạng đơn nhiễm đa nhiễm genotype HPV Một số yếu tố liên quan sau: * Mối liên quan lứa tuổi tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV Bảng 3.7 Mối liên quan lứa tuổi tình trạng đơn, đa nhiễm genotype HPV Tuổi N ≤ 25 233 Đơn nhiễm genotype HPV N % OR 95% CI 40 17,2 1,06 0,7 - 1,7 > 25 233 246 39 15,9 P 0,807 Đa nhiễm genotype HPV N % OR 95% CI 101 43,3 2,08 1,4 - 3,1 66 26,8 p < 0,0001 Nhận xét: + Yếu tố tuổi liên quan có ý nghĩa mật thiết với tình trạng đa nhiễm genotype HPV (p