Kỹ thuật PCR trong y học

Bài giảng kỹ thuật PCR trong y học, dành cho sinh viên nghiên cứu học bài về PCR, sinh viên trường đại học y dược, xét nghiệm, công nghệ sinh học..............................................................................

KỸ THUẬT PCR VÀ

REALTIME-PCR

Dương Thị Loan

MỤC TIÊU

1. N m đ c nguyên t c chung c a quá trình ly ắ ượ ắ ủ

trích DNA ­ RNA

2. Hi u rõ nguyên t c c a k  thu t PCR.ể ắ ủ ỹ ậ

3. K  đ c các chu k  nhi t trong ph n  ng ể ượ ỳ ệ ả ứ

KHÁI NIỆM

 PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay "phản ứng khuếch đại gen“(polymerase chain reaction)

 Là một kỹ thuật phổ biến trong lĩnh v c ự sinh học phân tử, tạo ra nhiều bản sao c a ủ một đoạn DNA

mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli

hay nấm men

 Được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học v i ớ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những

bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và

xác định huyết thống.

CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO VI KHUẨN

CẤU TRÚC VIRUS VIÊM GAN C

Ly trích DNA gồm 3 bước cơ bản

Phá vở cấu trúc tế bào

Dùng các hóa chất loại bỏ Lipid màng tế bào, protein

Tủa DNA với alcohol

NGUYÊN T C LY TRÍCH DNA Ắ

NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR

 PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid ban đầu thành hàng tỷ bản sao, sau

đó bằng phương pháp điện di trên mội trường thạch, các sản phẩm PCR sẽ được phát hiện

dưới ánh sáng đèn UV Ðể thực hiện được việc khuếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước.

NGUYÊN LÝ

NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR

 Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử

nghiệm PCR, thường có thêm một giai đoạn gọi

là bù thêm (soaking) Giai đoạn này nhiệt độ

được giữ 72°C trong thời gian tương đối lâu (10 phút) Ðây là giai đoạn để một số các bản sao

của DNA đích vì một lý do nào đó trong các giai

đoạn kéo dài của các chu kỳ PCR, không kéo

dài được một cách đồng bộ như các bản sao

khác, có thể kéo dài để hoàn tất chiều dài của

sản phẩm PCR

NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR

 Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp được N 2 n bản sao

 Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản

phẩm PCR (PCR product) hay amplicon rất lớn (trên 109 bản sao) sau 30 chu kỳ

 Những sản phẩm PCR được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện nucleic acid (điện di trên môi trường thạch)

 Bước 3: Gắn mồi (Annealing) 65 °C trong 30 giây.

 Bước 4: Kéo dài (Elongation).72 °C trong 45 giây

  THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA THỬ NGHIỆM PCR

c a gene b nh lý, c a d u  n di truy n,. ). Vì ủ ệ ủ ấ ấ ề

v y v n đ  s a so n b nh ph m cho th  ậ ấ ề ử ạ ệ ẩ ử

nghi m PCR ph i đ c coi tr ng, đ c bi t ệ ả ượ ọ ặ ệ

trong các phòng thí nghi m áp d ng PCR đ  ệ ụ ể

ch n đoán phát hi n b nh. ẩ ệ ệ

THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA THỬ NGHIỆM PCR

• Primer hay đo n m i, t c là nh ng đo n DNA đ n ạ ồ ứ ữ ạ ơ (oligonucleotide) có kích th c ch  vài ch c base (18­30),  ướ ỉ ụ

có th  b t c p theo nguyên t c b  sung vào đo n kh i  ể ắ ặ ắ ổ ạ ở

đ u và đo n k t thúc c a chu i DNA đích. Trong th   ầ ạ ế ủ ỗ ử nghi m PCR, đo n m i có hai vai trò chính : (*) Quy t  ệ ạ ồ ế

đ nh nên tính đ c hi u c a th  nghi m, nghĩa là ch  có  ị ặ ệ ủ ử ệ ỉ

th  b t c p trên chu i đích mà không th  b t c p đ c  ể ắ ặ ỗ ể ắ ặ ượ

trên các chu i DNA khác ngoài chu i đích, (**) Kh i  ỗ ỗ ở

đ ng men polymerase đ  t ng h p s i b  sung cho chu i  ộ ể ổ ợ ợ ổ ỗ

DNA đích m t khi nó nh n d ng đ c đ u 3’, Thông  ộ ậ ạ ượ ầ

th ng trong ph n  ng PCR, ng i ta dùng m t c p  ườ ả ứ ườ ộ ặ

m i, g i là  ồ ọ primer set, trong đó có m t ộ m i lên ồ  g i là  ọ up­

stream primer và m t ộ m i xu ng ồ ố  g i là  ọ down­stream  prime. C p m i này quy t đ nh nên kích th c c a s n ặ ồ ế ị ướ ủ ả

ph m PCR.   ẩ

THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA THỬ NGHIỆM PCR

• dNTP: t c là đ n v  đ  có th  t ng h p đ c các b n ứ ơ ị ể ể ổ ợ ượ ả

sao c a DNA đích. dNTP có c u t o g m m t đ ng  ủ ấ ạ ồ ộ ườ

deoxyribose có g n m t base, có th  là adenine  ắ ộ ể (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay 

guanine (dGTP) ,   carbone s  1 (C1). Ba phân t   ở ố ử phosphate (triphosphate) đ c g n t i carbone s  5  ượ ắ ạ ố (C5) c a phân t  deoxyribose này và đây chính là n i  ủ ử ơ

mà dNTP g n vào đ u 3’ c a chu i b  sung trên  ắ ầ ủ ỗ ổ chu i đích. Năng l ng đ  cho ph n  ng này x y ra  ỗ ươ ể ả ứ ả

đ c l y t  các n i phosphate giàu năng l ng c a  ượ ấ ừ ố ươ ủ triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do t i  ạ

sao ph i là dNTP ch  không ph i là dNDP  ả ứ ả (diphosphate) hay dNMP (monophosphate). 

THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA THỬ NGHIỆM PCR

• Men polymerase,  ph i là men polymerase ch u ả ị

đ c nhi t đ  Ngày nay có nhi u lo i  ượ ệ ộ ề ạ polymerase ch u đ c nhi t đ  đã đ c ly trích  ị ượ ệ ộ ượ

ho c t ng h p, tùy m c đích s  d ng mà chúng  ặ ổ ợ ụ ử ụ

ta có th  ch n polymerase thích h p. Th ng  ể ọ ợ ườ dùng nh t trong các phòng thí nghi m là men  ấ ệ

Taq polymerase. Là men polymerase trích t  vi ừ khu n  ẩ Thermus aquaticus,  là các vi khu n s ng ẩ ố

đ c trong các su i n c nóng ượ ố ướ  

THÀNH PHẦN CHỦ YẾU

CỦA THỬ NGHIỆM PCR

• Dung d ch đ m ị ệ  cho ph n  ng PCR, th ng  ả ứ ườ

ch a mu i đ m Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và  ứ ố ệ MgCl2 1.5mM. Ngoài ra dung d ch đ m PCR còn  ị ệ

có th  ch a 0.001% BSA hay Gelatine và trong  ể ứ

m t s  ph n  ng PCR còn có th   thêm tween  ộ ố ả ứ ể hay formamide. Trong các thành ph n trên,  nh  ầ ả

h ng đ n th  nghi m PCR nhi u nh t là n ng  ưở ế ử ệ ề ấ ồ

đ  MgCl ộ 2, vì v y đ  có đ c m t th  nghi m  ậ ể ượ ộ ử ệ PCR có đ  nh y cao, ph n  ng rõ nét, ng i ta  ộ ạ ả ứ ườ

ph i t i  u hóa ph n  ng b ng cách thăm dò  ả ố ư ả ứ ằ

m t n ng đ  MgCl2 thích h p nh t ộ ồ ộ ợ ấ  

MÁY PCR

 Ngoài ra, một thiết bị

hết sức quan trọng cho

thử nghiệm PCR là

máy chu kỳ nhiệt

(thermal cycler) là máy

có thể đưa nhiệt độ

trong buồng ủ PCR lên

cao rồi hạ xuống trong

những khoảng thời gian

nhất định theo chương

trình mà người sử dụng

định sẵn

KẾT QỦA PCR

 Sản phẩm PCR có thể được nhận biết d a vàoự kích thước của chúng qua việc sử dụng sắc ký gel agarose Sắc ký gel agarose là phương pháp bao gồm việc cho mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau

đó chạy điện di trên gel Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương Kích thước của sản phẩm PCR

có thể được xác định bằng việc so sánh vói thang

DNA, thang này có chứa các DNA đã biết trước kích

thước, cũng nằm trong gel (hình 3). 

KẾT QỦA PCR

        

KẾT QỦA PCR