Kỹ thuật PCR trong y học

Bài giảng kỹ thuật PCR trong y học, dành cho sinh viên nghiên cứu học bài về PCR, sinh viên trường đại học y dược, xét nghiệm, công nghệ sinh học..............................................................................

KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME-PCR Dương Thị Loan MỤC TIÊU 1. N m đ c nguyên t c chung c a quá trình ly ắ ượ ắ ủ trích DNA - RNA 2. Hi u rõ nguyên t c c a k thu t PCR.ể ắ ủ ỹ ậ 3. K đ c các chu k nhi t trong ph n ng ể ượ ỳ ệ ả ứ PCR. 4. K tên đ c các thành ph n chính tham gia ể ượ ầ trong ph n ng PCR.ả ứ 5. Nêu đ c s khác nhau c a ph n ng PCR ượ ự ủ ả ứ và Realtime-PCR KHÁI NIỆM  PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay "phản ứng khuếch đại gen“(polymerase chain reaction)  Là một kỹ thuật phổ biến trong lĩnh v c ự sinh học phân tử, tạo ra nhiều bản sao c a ủ một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.  Được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học v i ớ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống. CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO VI KHUẨN CẤU TRÚC VIRUS VIÊM GAN C Ly trích DNA gồm 3 bước cơ bản Phá vở cấu trúc tế bào Dùng các hóa chất loại bỏ Lipid màng tế bào, protein Tủa DNA với alcohol NGUYÊN T C LY TRÍCH DNAẮ NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR  PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid ban đầu thành hàng tỷ bản sao, sau đó bằng phương pháp điện di trên mội trường thạch, các sản phẩm PCR sẽ được phát hiện dưới ánh sáng đèn UV. Ðể thực hiện được việc khuếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước. NGUYÊN LÝ [...]... phẩm PCR NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR  Như v y từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp được N 2n bản sao  Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon rất lớn (trên 109 bản sao) sau 30 chu kỳ  Những sản phẩm PCR được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện nucleic acid (điện di trên môi trường thạch) QUI TRÌNH KỸ THUẬT PCR. .. sao phải là dNTP chứ không phải là dNDP  (diphosphate) hay dNMP (monophosphate).  THÀNH PHẦN CHỦ Y U CỦA THỬ NGHIỆM PCR • Men polymerase,  phải là men polymerase chịu  được nhiệt độ. Ng y nay có nhiều loại  polymerase chịu được nhiệt độ đã được ly trích  hoặc tổng hợp, t y mục đích sử dụng mà chúng  ta có thể chọn polymerase thích hợp. Thường  dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men  Taq polymerase. Là men polymerase trích từ vi ... °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng DNA-Polymerase có tác dụng tốt nhất  Bước 2: Biến tính (denaturation). 96 °C trong 30 gi y Đối với mỗi chu kì thì lượng thời gian n y là đủ để biến tính DNA  Bước 3: Gắn mồi (Annealing) 65 °C trong 30 gi y  Bước 4: Kéo dài (Elongation).72 °C trong 45 gi y  THÀNH PHẦN CHỦ Y U CỦA THỬ NGHIỆM PCR  THÀNH PHẦN CHỦ Y U CỦA THỬ NGHIỆM PCR. .. được trong các suối nước nóng.  THÀNH PHẦN CHỦ Y U CỦA THỬ NGHIỆM PCR Dung dịch đệm cho phản ứng PCR,  thường  chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và  MgCl2 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn  có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể  thêm tween  hay formamide. Trong các thành phần trên, ảnh  hưởng đến thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng  độ MgCl2, vì v y để có được một thử nghiệm ... độ MgCl2, vì v y để có được một thử nghiệm  PCR có độ nh y cao, phản ứng rõ nét, người ta  phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò  một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.  • M Y PCR  Ngoài ra, một thiết bị hết sức quan trọng cho thử nghiệm PCR là m y chu kỳ nhiệt (thermal cycler) là m y có thể đưa nhiệt độ trong buồng ủ PCR lên cao rồi hạ xuống trong những khoảng thời gian nhất định theo chương trình mà người sử dụng định sẵn KẾT QỦA PCR. .. deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine  (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay  guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1). Ba phân tử  phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5  (C5) của phân tử deoxyribose n y và đ y chính là nơi  mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên  chuỗi đích. Năng lương để cho phản ứng n y x y ra  được l y từ các nối phosphate giàu năng lương của  triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do tại ...NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR  Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử nghiệm PCR, thường có thêm một giai đoạn gọi là bù thêm (soaking) Giai đoạn n y nhiệt độ được giữ 72°C trong thời gian tương đối lâu (10 phút) Ð y là giai đoạn để một số các bản sao của DNA đích vì một lý do nào đó trong các giai đoạn kéo dài của các chu kỳ PCR, không kéo dài được một cách đồng... THỬ NGHIỆM PCR DNA hay nucleic acid đích (DNA  template), tức là chuỗi acid nucleic ( đoạn  acid nucleic đặc hiệu của vi khuẩn g y bệnh,  của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền,. ). Vì  v y vấn đề sửa soạn bệnh phẩm cho thử  nghiệm PCR phải được coi trọng, đặc biệt  trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để  chẩn đoán phát hiện bệnh.  THÀNH PHẦN CHỦ Y U CỦA THỬ NGHIỆM PCR Primer hay đoạn mồi, tức là những đoạn DNA đơn ... DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’, Thông  thường trong phản ứng PCR,  người ta dùng một cặp  mồi, gọi là primer set, trong đó có một mồi lên gọi là up­ stream primer và một mồi xuống gọi là down­stream  prime. Cặp mồi n y quyết định nên kích thước của sản  phẩm PCR.    • THÀNH PHẦN CHỦ Y U CỦA THỬ NGHIỆM PCR • dNTP: tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản  sao của DNA đích. dNTP có cấu tạo gồm một đường  deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine ... (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18­30),  có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi  đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích. Trong thử  nghiệm PCR,  đoạn mồi có hai vai trò chính : (*) Quyết  định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, nghĩa là chỉ có  thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được  trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, (**) Khởi  động men polymerase để tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi  DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’, Thông  . n ng ể ượ ỳ ệ ả ứ PCR. 4. K tên đ c các thành ph n chính tham gia ể ượ ầ trong ph n ng PCR. ả ứ 5. Nêu đ c s khác nhau c a ph n ng PCR ượ ự ủ ả ứ và Realtime -PCR KHÁI NIỆM  PCR là Phản ứng chuỗi. nghiệm PCR đã tổng hợp được N. 2 n bản sao.  Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon rất lớn (trên 10 9 bản sao) sau 30 chu kỳ  Những sản phẩm PCR. CỦA KỸ THUẬT PCR  PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid ban đầu thành hàng tỷ bản sao, sau đó bằng phương pháp điện di trên mội trường thạch, các sản phẩm PCR sẽ được phát