Ở thực vật, lysozyme đượctìm thấy trong mủ của cây sung và cây đu đủ có tính chất hóa học khác với lysozymetrong lòng trắng trứng Meyer và cộng sự 1956.. Tính chất ức chế vi khuẩn của ly
Trang 1LỜI MỞ ĐẦU
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinhsản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thựcphẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường.Nghiên cứu, sản xuất enzyme và ứng dụng của enzyme được phát triển rất mạnh từđầu thế kỷ 20 đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận rất lớncho nhiều nước Việt Nam là một trong nhiều nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụngenzyme Tuy nhiên, nền công nghiệp enzyme của ta chưa thực sự phát triển
Lysozyme là một loại enzyme có nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thựcphẩm và trong y học Đồ án này nhằm tìm hiểu về enzyme lysozyme, các tính chất và cơchế tác dụng của enzyme này với cơ chất cũng như phương pháp tinh sạch và các ứngdụng của nó Đây là đồ án mang cái nhìn tổng quát về enzyme lysozyme
Trong quá trình thực hiện đồ án này, em xin chân thành cám ơn sự hướng dẫn tận tìnhcủa cô Đống Thị Anh Đào, cùng với sự giúp đỡ của các bạn trong việc tìm và chia sẻ tàiliệu
Sinh viên thực hiện Phạm Thị Bích Ngọc
I Giới thiệu về lysozyme
Trang 2Lysozyme (ký hiệu E.C.3.2.1.17) là một enzyme thủy phân liên kết β – 1,4 glycosidicgiữa N – acetylmuraminic acid và N – acetylglucosamine trong polysaccharide, là thànhphần chủ yếu trong thành tế bào một số vi khuẩn Lysozyme cũng thủy phân liên kết β –1,4 glycosidic giữa N – acetylglucosamine trong chitin, một polymer của N –acetylglucosamine.
Lysozyme còn có các tên khác như: 1,4-N-acetylmuramidase, L-7001, diacetylmuramidase, GlobulinG1, GlobulinG, Mucopeptide N-acetylmuramoylhydrolase,Mucopeptide glucohydrolase và Muramidase
N,O-Lysozyme phân bố rộng rãi ở hầu hết các loài động vật và thực vật Trong đó,lysozyme trong lòng trắng trứng gà là được nghiên cứu nhiều nhất (lysozyme “c”) Mộtloại lysozyme khác có trong lòng trắng trứng của ngỗng nuôi là lysozyme “g” (Prager vàcộng sự 1974) Lysozyme cũng được tìm thấy trong chất tiết và mô của các loài động vật
có vú, nước bọt, nước mắt, sữa, đờm, bạch cầu, quả cật … Ở thực vật, lysozyme đượctìm thấy trong mủ của cây sung và cây đu đủ có tính chất hóa học khác với lysozymetrong lòng trắng trứng (Meyer và cộng sự 1956)
Trong virus (hay bacteriophase), lysozyme là một tác nhân để xâm nhập vào tế bào vikhuẩn vật chủ Lysozyme có ở đuôi của virus (hay bacteriophase) phá hủy peptidoglycancủa thành tế bào vi khuẩn và tiêm ADN của nó vào Khi vi khuẩn nguyên phân, rất nhiềuphân tử lysozyme được tạo thành để phá hủy thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nhiềuvirus nữa
2 Phân loại lysozyme
Trang 3Lysozyme đã được lấy ra từ nhiều nguồn: vi sinh vật, virus, côn trùng, cây, động vật.Người ta phân loại lysozyme thành những nhóm nhỏ dựa trên nguồn gốc, thứ tự các acidamin và chiều dài
Lòng trắng trứng là nguồn giàu lysozyme nhất, chứa khoảng 0,3 – 0,4 g lysozymetrong một quả trứng Lysozyme trong lòng trắng trứng là đại diện cho họ các lysozyme vàđược gọi là lysozyme type-c Những nghiên cứu đã cho thấy rằng lớp biểu bì và vỏ trứngchứa ít lysozyme trong khi màng ngoài và màng trong thì nhiều lysozyme Lysozymetype-g có mặt trong các loài chim Lysozyme type-c và lysozyme type-g có khối lượngphân tử khác nhau và trạng thái khác nhau
Lysozyme cũng có mặt trong mô động vật, huyết thanh và các cơ quan Lá lách củagia súc chứa một lượng lysozyme lớn nhất Lysozyme trong sữa bò có cùng khối lượngphân tử với lysozyme lòng trắng trứng nhưng hoạt độ thì gấp 2 lần Lysozyme type-v(viral) là lysozyme của virus, được xác định là khác với những lysozyme khác ở chỗ đây
là loại transglycosidase Lysozyme từ thực vật là lysozyme type-h và type-b tùy thuộcvào nguồn gốc của lysozyme
Bảng 1: Các loại lysozyme
sự,1996
sự,1996type-i (invertebrate) Động vật thân mềm, côn
trùng
Jolles và Jolles, 1975
Bảng 2: Hàm lượng lysozyme trong các nguồn khác nhau
Loại lysozyme Hàm lượng Tài liệu tham khảo
Trang 4Lysozyme trong chất lỏng của cơ thể
Ereifej và Markakis, 1980
II Cấu trúc, đặc tính hóa lý
Lysozyme là một polypeptide dạng hình cầu có 129 acid amin với 4 cầu nối disulfure
là hỗn hợp của globulin G1, G2 và G3, chủ yếu loại G1 có trọng lượng phân tử khoảng 14,7kDa ở các vị trí Cys6-Cys127, Cys30-Cys115, Cys64-Cys80 và Cys76-Cys94 Khi cáccầu nối disulfure bị cắt, lysozyme mất hoạt tính và để duy trì hoạt tính thì ít nhất phải còn
2 cầu nối disulfure Phân tử lysozyme chia làm 2 phần: α và β, nối với nhau bởi đườngxoắn ốc α chứa trung tâm hoạt động của lysozyme
Trang 5Hình 1: Cấu tạo của lysozyme Chuỗi acid amin được đánh dấu từ đầu N đến đầu C.
Đường chấm gạch thể hiện 4 cầu nối disulfure.
Lysozyme phá vỡ liên kết giữa C1 của acetylmuramic acid (NAM) và C4 của acetylglucosamine (NAG)
N-Hình 2: Cơ chất của lysozyme (Liên kết β 1,4 glucosidic giữa N-acetylmuramic acid
và N-acetylglucosamin được khoanh tròn.)
Quan sát hình cơ chế hoạt động của lysozyme (hình 3)
Phản ứng thủy phân diễn ra ở trong khe có chứa các nhóm hoạt động của lysozyme.Các nhóm hoạt động của lysozyme là mạch nhánh –COOH của glutamic acid 35 (Glu35)
Trang 6và –COO– của aspartate 52 (Asp52) Nhóm đường của thành tế bào nằm ở giữa 2 acidamin này Phản ứng bắt đầu khi Glu35 cho Oxy của nhóm glycoside 1 proton, làm biếndạng phân tử đường D từ dạng ghế thông thường bền vững thành dạng mới nguyên tửcarbon 1 và 2, nguyên tử oxy 5 đều ở cùng trên một mặt phẳng, gây sự biến dạng trongcấu tạo cơ chất làm cho liên kết bị yếu đi đưa đến cắt đứt liên kết glycosidic giữa oxy vànguyên tử carbon 1 của đường, tạo ra một C+.
C+ được ổn định bằng cách kết hợp với điện tích âm của Asp52 để tạo thành sản phẩmtrung gian Sản phẩm trung gian này sau đó phản ứng với phân tử nước tạo ra sản phẩmcủa phản ứng thủy phân và giải phóng enzyme Các monosaccharide được ký hiệu là C,
D, E Các mạch nhánh của đường được ký hiệu như: R1 là –CH2OH, R2 là –NH–C–CH2
||
O
Trang 7Hình 3: Cơ chế tác dụng của lysozyme trong quá trình thủy phân polysaccharide
1 Tính chất của lysozyme có trong lòng trắng trứng gà
Trang 8Khối lượng phân tử: 14 388 (Jollés 1969).
Gồm: 129 acid amin (21 aspartic acid, 5 glutamic acid, 12 alanine, 11 arginine, 8cysteine, 3 phenylalanine, 12 glycine, 6 isoleucine, 1 histidine, 8 leucine, 6 lysine, 2proline, 2 methionine, 12 serine, 3 tyrosine, 7 threnonine, 6 tryptophan và 6 valine
pH tối ưu: 6,2 (Davies và cộng sự 1969)
Điểm đẳng điện: pH 11 (Alderton và cộng sự 1945)
Nét đặc trưng:
Chất ức chế: các chất hoạt động bề mặt như dodecyl sulfate, cồn và các acid béo, cácdẫn xuất của nhóm imidazole và indole
Độ bền: lysozyme bảo quản ở điều kiện khô lạnh hay dạng bột tinh thể ở nhiệt độ 2 –
8oC thì bền trong vòng 1 năm Dạng dung dịch pH 4 – 5 để ở nhiệt độ lạnh thì bền trongvòng nhiều tuần, nếu để nhiệt độ môi trường thì bền trong vài ngày
2 Tính chất ức chế vi khuẩn của lysozyme lòng trắng trứng gà
Cơ chất tự nhiên của lysozyme là màng peptidoglycan của thành tế bào, thành tế bào
có vai trò tạo hình dáng tế bào, bảo vệ tế bào chống lại áp suất thẩm thấu Vì thế, sự thủyphân màng peptidoglycan dẫn đến sự phân giải tế bào Thành phần hóa học của thành tếbào vi khuẩn Gram âm khác với vi khuẩn Gram dương Thành tế bào vi khuẩn Gramdương có cấu tạo bởi một lớp peptidoglycan dày cùng với teichoic acid và lipoteichoicacid Thành tế bào vi khuẩn Gram âm thì được cấu tạo bởi 2 lớp, lớp trong là một lớppeptidoglycan đơn không có teichoic acid và lớp ngoài là một lớp lipopolysaccharidedày Lớp ngoài của vi khuẩn Gram âm ngăn cản sự tiếp xúc giữa lysozyme vàpeptidoglycan, vì thế vi khuẩn Gram âm ít mẫn cảm với lysozyme hơn (Salton, 1958).Tuy nhiên, những nghiên cứu cho rằng cơ chế tiêu diệt vi khuẩn Gram dương thì độc lậpvới hoạt động enzyme mà chủ yếu là do tính chất kỵ nước và tích điện dương củalysozyme (Pellegrini và cộng sự, 1992) Những nghiên cứu cho thấy rằng hoạt độngenzyme và hoạt động dung giải thì không liên quan với nhau vì lysozyme đã biến tínhvẫn có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn (Pellegrini và cộng sự, 1992; Ibrahim vàcộng sự, 1996; Ibrahim và công sự, 2001)
a Hoạt động ức chế vi khuẩn Gram dương
Lysozyme lòng trắng trứng có hoạt động hiệu quả đối với một số loài vi khuẩn trongthực phẩm (Proctor và Cunningham, 1998) Lysozyme dung giải tế bào vi khuẩn bằngcách thay đổi tính chất của cấu trúc bề mặt trên thành tế bào Những quan sát trên kínhhiển vi cho thấy rằng có sự phồng ra của tế bào trước khi tế bào bị dung giải và nguyênnhân của sự phồng ra này là do sự thay đổi cấu trúc trong thành tế bào (Salton, 1957) Cơchế hoạt động của lysozyme được nghiên cứu bởi Salton năm 1957 Ông sử dụng ba vikhuẩn Gram dương và lysozyme hoàn toàn dung giải thành tế bào của chúng Khi
Trang 9Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, và Bacillus megaterium bị dung giải bởi
lysozyme, có sự giải phóng các đường acetyl amio Hoạt động của lysozyme đã được xácđịnh bằng cách đo sự giảm mật độ của thành tế bào và bằng cách ước tính lượng chấtmạch ngắn được giải phóng Những chất đó là một hỗn hợp phức tạp gồm rất nhiều chất
có kích thước phân tử khác nhau, tính chất điện khác nhau Chất chính trong hỗn hợp này
là các disaccharide của acetlyglucosamine và acetyl muramic acid Acid amin của thành
tế bào và đường đơn không được tìm thấy trong hỗn hợp này (Salton, 1958) Điều nàychứng tỏ là lysozyme cắt đứt liên kết glycoside của đường amino thành tế bào, vì thế giảiphóng ra các disaccharides của acetylglucosamine và acetylmuramic acid (Salton, 1958)
b Hoạt động ức chế vi khuẩn Gram âm
Những nghiên cứu gần đây trên một số vi khuẩn Gram âm nhất định cho thấy khi táchthành tế bào của các vi khuẩn này và để ủ với lysozyme, mật độ thành tế bào của chúngchỉ giảm một ít Dung dịch thu được gồm các chất chủ yếu là alanine, acid glytamic,diaminopimelic acid (DAP), glycosamine và một lượng nhỏ acid muramic và một vàiacid amin khác (Salton, 1958)
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hoạt động của lysozyme trên vi khuẩn Gram
âm không phụ thuộc vào hoạt động enzyme mà phụ thuộc vào sự chuyển pha cấu trúc(Ibrahim và cộng sự, 2001) Có chứng cứ của một phần chống vi sinh vật đặc biết gọi làphần 98-112 có liên quan đến hoạt động chống vi sinh vật Gram dương và Gram âm củalysozyme (Ibrahim và cộng sự, 2001) Hoạt động chống vi sinh vật của lysozyme độc lậpvới hoạt động enzyme của nó Lysozyme lòng trắng trứng biến tính nhiệt được dùng đểnghiên cứu khả năng chống vi sinh vật của lysozyme và người ta tìm ra rằng sau khi bịbiến tính lysozyme chống lại vi khuẩn Gram âm mạnh hơn với một phần mạch đuỗi ra,hoạt tính enzyme bị vô hoạt và cấu trúc kỵ nước (During và cộng sự, 1999) Người ta giảithích điều đó là do sự lồng cấu trúc đối xứng 2 bên của lysozyme vào màng tế bào dẫnđến sự phá vỡ màng
III Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lysozyme, ví dụ như: pH, nhiệt độ,các ion, khả năng tiếp cận với liên kết để phá hủy trong thành tế bào vi khuẩn…
1 pH
Đối với lysozyme lòng trắng trứng, khi các thí nghiệm được tiến hành ở dung dịchtrung tính và dung dịch acid, hoạt động của lysozyme trong dung dịch acid luôn luônmạnh hơn so với trong môi trường trung tính Sự ức chế hoạt động của lysozyme bắt đầutại pH 5,7, pH tối ưu của lysozyme khoảng 6,2 và khả năng dung giải tốt nhất ở pH 6,0-7,0 (Boasson, 1938; Smolelis và Hartsell, 1949)
Đối với lysozyme của hào, pH tối ưu là 5,5-6,0 (Xue và cộng sự, 2004)
Trang 102 Nhiệt độ
Sự dung giải tế bào vi khuẩn của lysozyme lòng trắng trứng tăng khi tăng nhiệt độ đến
60oC (Smolelis và Hartsell, 1949) Hoạt động của lysozyme tinh sạch từ huyết tương củahào tăng cùng với sự tăng nhiệt độ từ 0 – 45oC và sau đó giảm ở nhiệt độ lớn hơn 55oC
3 Sự có mặt của chất điện ly
Hoạt động dung giải của lysozyme lòng trắng trứng tốt nhất khi có sự có mặt củamuối Ka với lực ion khoảng 0,1 (Salton, 1957) Lysozyme dung giải ít hơn trong dungdịch muối Mg hay Ca so với dung dịch muối K và Na (Smolelis và Hartsell, 1949) Đối với lysozyme hào, lực ion khoảng 0,18 – 0,2 (Xue và cộng sự, 2004)
4 Điều kiện canh trường
Sự dung giải tế bào vi khuẩn bao gồm sự phá vỡ cấu trúc bề mặt của tế bào Vì thế,yếu tố ảnh hưởng đến sự bền của cấu trúc bề mặt tế bào hay bất cứ chất nào ngăn cản sựtiếp xúc giữa lysozyme và cơ chất của nó đều ảnh hưởng đến hoạt động dung giải củalysozyme (Salton, 1957)
IV Phương pháp xác định hoạt tính của lysozyme
Tính chất xúc tác của lysozyme có thể được xác nhận nếu lysozyme đó thỏa mãn 3tính chất sau:
a Lysozyme đó có thể làm giảm tính dày đặc của cấu trúc thành tế bào phân lập ra
b Lysozyme đó có thể dung giải các tế bào vi khuẩn
c Lysozyme đó có thể giải phóng ra phức của đường acetylamino của glucosamine
và acidic hexosamine và acid muramic
Nồng độ protein được đo bằng phương pháp Micro BCA Protein Assay (PierceBiotechnology, Rockford, IL) Tất cả các phép đo được tiến hành 3 lần Hoạt tínhcủa lysozyme được đo bằng phương pháp quang phổ (Xue và cộng sự, 2004) 20µL mẫu
được trộn với 180µL Micrococcus lysodeikticus đã được làm yếu trong 0,2M acetate
buffer ở pH 5,8 trong đĩa micro để ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở bướcsóng 450nm bằng microtiter plate reader (Dynatec, Chantilly, VA.) Sự hấp thu được đosau khi đọc ban đầu 5 phút và sự giảm của độ hấp thu ở bước sóng 450nm mỗi phút cũngđược tính toán Lysozyme được cho là có chất lượng khi một đơn vị lysozyme gây ra sựgiảm độ hấp thu của hỗn hợp trên là 0,001/phút
V Cách tinh chế, tinh sạch
Trang 11Việc nghiên cứu thành công của một enzyme không phải ở việc chiết xuất, xác địnhđặc tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme mà phải tinh chế được enzyme dạngtinh sạch, để chế phẩm có hoạt độ cao trên 1mg chế phẩm Thông thường của phươngpháp tinh chế bằng sự kết tủa nhiều lần để thu được chế phẩm enzyme có hoạt tính cao.
Để tiện lợi và nhanh hơn, nhiều enzyme được chiết xuất lại qua sắc ký cột trao đổi ionnhư CMC (carboxyle methyl cellulose), sắc ký rây lọc phân tử Sephadex, sắc ký ái lựccho phép tách đặc hiệu enzyme khi phần cánh tay của sắc ký ái lực gắn với cơ chất đặchiệu Đối với một số enzyme có phân tử nhỏ xác định như lysozyme 14000 đơn vị có khảnăng chui qua màng siêu lọc, người ta có thể tách lysozyme của lòng trắng trứng từ hỗnhợp các loại globulin lòng trắng trứng bằng phương pháp siêu lọc có hiệu suất rất cao.Việc tinh chế enzyme hết sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất,protein không phải enzyme, nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần, thuậnlợi cho nghiên cứu, bảo quản, nhất là nguyên liệu dùng làm thuốc trong điều trị và sảnxuất
1 Sắc ký trao đổi ion
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác nhân traođổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzyme Người tathường sử dụng các tác nhân trao đổi ion sau:
- Nhựa trao đổi ion
- Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose
diethylamino-ethyl-Người ta thường sử dụng DEAE-cellulose hơn cả Ưu điểm của DEAE-cellulose làngoài tạp chất protein, các loại nucleic acid đều được loại khỏi enzyme
- Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran Trong chất này, các phân tử củachúng thường liên kết với nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác dụng củaepiclohydrin, tạo thành “sàng phân tử” Số lượng liên kết ngang càng nhiều, kíchthước sàng phân tử càng nhỏ
Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong cáchạt sephadex đã được ngâm trong buffer Các phân tử có kích thước lớn hơn không cókhả năng đi vào các hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột Phương pháp này được ứng dụngrộng rãi trong kỹ thuật enzyme
Đề án: Tinh sạch và mô tả đặc điểm của lysozyme
Trang 12Phần: Sắc ký trao đổi ion
Giới thiệu về đề án
Tinh sạch lysozyme từ lòng trắng trứng gà bằng sắc ký trao đổi ion Sử dụng phân tíchđịnh lượng protein và enzyme, bạn sẽ xác định được lượng lysozyme thu được, và mởrộng qui mô tinh sạch Cuối cùng, sử dụng sự dịch chuyển điện tử, bạn sẽ khảo sát chi tiết
Trang 13sự tách enzyme bằng phương pháp sác ký, nhận ra được những loại protein lòng trắngtrứng khác có thể tách ra được lysozyme Thêm vào đó, bạn sẽ sử dụng kết quả của sựdịch chuyển điện tử để xác định khối lượng phân tử của lysozyme
Thông tin chung về lysozyme
Lysozyme của lòng trắng trứng gà là một chuỗi polypeptide đơn gồm 129 acid amin,khối lượng phân tử 14600 daltons Lysozyme là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúcbằng phương pháp tinh thể học X quang Ở động vật có vú, lysozyme có trong nước mắt,
vì thế không dễ dàng tách được một lượng lớn lysozyme Lòng trắng trứng là một nguồngiàu lysozyme
Nhìn tổng thể về thời gian biểu của đề án
- Ngày 1: lập đường cong chuẩn của phương pháp biuret, cho phép bạn xác địnhđược nồng độ của dung dịch protein
- Ngày 2: tiến hành chạy sắc ký trao đổi ion salt-gradient dịch chiết lòng trắngtrứng, thu dung dịch ra khỏi cột vào một hũ nhỏ
- Ngày 3: xác định thành phần của dung dịch trong hũ bao gồm: nồng độ protein(phương pháp biuret) và nồng độ của lysozyme (sử dụng phương pháp phân tíchđịnh lượng)
- Ngày 4: sử dụng SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) polyacrylamide trao đổi ion đểnghiên cứu thành phần của chất chiết lòng trắng trứng chi tiết hơn
Giới thiệu phần 2: Sắc ký trao đổi ion dương sử dụng Gradient muối
Trong thí nghiệm này, pha tĩnh sử dụng là carboxymethyl-Sephadex, một loạipolysaccharide thương mại có các nhóm -CH2-COOH Khi pH lớn hơn 3, những nhómnày mang điện tích âm (-CH2-COO-), và vì thế sẽ giữ chặt những chất tan tích điệndương, làm chậm sự chuyển động của chúng ra khỏi cột Đối với loại cột này, các chấttan tích điện âm sẽ được rửa ra trước, theo sau là các chất tan trung hòa điện Các chất tantích điện dương sẽ được rửa ra sau cùng, hoặc chúng bị giữ lại trong cột cho tới khi bịthay bằng các ion muối, hay khi thay đổi pH để làm thay đổi sự tích điện của cột hay củachất tan
pH đẳng điện của lysozyme là 11 Ở pH này, phân tử lysozyme trung hòa về điện Ở
pH 8,2, pH tiến hành sắc ký, phân tử lysozyme tích điện dương, và vì thế lysozyme sẽđược giữ lại trong cột Nhiều loại protein lòng trắng trứng khác có pI dưới 8,0 Vì thế, khibạn áp dụng chạy sắc ký ở pH 8,2, mong muốn là giữ lại hầu hết các protein khác trêncột Sau đó, bạn rửa giải bằng dung dịch có nồng độ muối tăng dần (gọi là gradient –
Trang 14phương pháp này gọi là phương pháp rửa giải gradient) Những protein không liên kếtvới cột sẽ được rửa giải nhanh chóng, và những protein còn lại được rửa giải theo ái lựccủa chúng với cột: ái lực yếu ra trước, tại nồng độ muối thấp; ái lực mạnh trong đó cólysozyme ra sau khi nồng độ ion Cl- trong dung dịch rửa giải đủ lớn.
Nguyên liệu
Thuốc thử
Buffer A: Tris buffer 0.05M, pH 8,2, chứa 0.05M NaCl
Buffer B: Tris buffer 0.05M, pH 8,2, chứa 1M NaCl
Sephadex CM-52 trong buffer A
Lưu ý: Buffer A và buffer B khác nhau ở nồng độ mol của NaCl
2 Chuyển 10mL phần lòng trắng trứng sau khi lọc vào một cái cốc 100mL khác vàpha loãng bằng 70mL buffer A (0,05M Tris-HCl buffer, pH 8,2, chứa 0,05MNaCl) Cho hỗn hợp này qua một cái phễu chứa bông thủy tinh Nếu bạn có thểnhìn thấy cặn trong phần lọc được, lọc lại lần nữa bằng một cái phễu chứa nhiềubông thủy tinh hơn Chất lỏng sau cùng phải trong suốt và loãng, không cặn vàkhông có cấu trúc gel Chất lỏng này được gọi là chất chiết lòng trắng trứng Lưu ýrằng chất chiết lòng trắng trứng loãng 1:8 so với lòng trắng trứng nguyên chất.Trong tính toán cuối cùng, bạn sẽ xác định lượng protein và enzyme trong lòngtrắng trứng nguyên chất, từ sự đo lường chất chiết lòng trắng trứng
Trang 153 Kiểm tra cột sắc ký bằng cách cho vào một lượng nước và chắc chắn rằng nướcchảy qua dễ dàng Nếu có nhiều cột sắc ký thì chọn cột nào mà tốc độ nước chảy
ra nhanh nhất Lắp vào cột sắc ký một cột ngắn và một cái van để điều chỉnhlượng nước qua cột Ở đáy cột có lưới bằng plastic để lọc giữ lại môi trường củasắc ký (chromatography medium (Sephadex CM-25), cho phép buffer đi qua.Khóa van lại Tháo nắp cột ra và thay thế bằng một cái phễu Lắp chặt phễu vàocột để tránh bị rỉ chất lỏng Kiểm tra sự rỉ của chất lỏng bằng cách cho nước vàophễu và cột
4 Đặt một cái khuấy từ lên cái vòng ở trên cột, đặt dụng cụ rửa giải gradient lên trêncái khuấy Dụng cụ rửa giải gồm có 2 cốc: một cốc nhập liệu và một cốc trộn, nốivới nhau bằng ống nhập liệu (Xem hình) Đặt một cái khuấy từ vào trong cốc trộn
5 Ước tính thể tích của CM-25 cần dùng để chiều cao nó chiếm trong cột sắc ký là10cm Khuấy đều CM-25 để đảm bảo đồng nhất, tránh tạo bọt khí Cho vào cốcnhỏ có chia độ lượng thể tích CM-25 gấp 2 lần so với lượng thể tích vừa tínhđược
6 Cho 5mL buffer A vào cột (van đang đóng) Trộn đều CM-25 (tránh tạo bọt khí)
và cho vào cột sử dụng một đũa thủy tinh để dẫn dòng chảy và tránh tạo bọt khí.Bọt khí sẽ tạo nên những lỗ hổng trong pha tĩnh, làm giảm hiệu năng của cột, vìbuffer có xu hướng đi theo những lỗ hổng, không tiếp xúc được với pha tĩnh
7 Để gel ổn định trong 2-3 phút Sau đó, đặt một cái cốc nhỏ ở dưới cột, mở van,cho buffer chảy qua từ từ Khi pha tĩnh đã ổn định, mở van hoàn toàn vài giây đểkiểm tra dòng chảy (ít nhất là 20 giọt/phút), sau đó khóa van lại
8 Đo chiều dài của pha tĩnh trong cột
Cho mẫu vào và rửa cột như sau:
9 Cho 20mL dịch chiết lòng trắng trứng vào cột theo thứ tự sau Bỏ đi phần bufferthừa bằng cách hút nhẹ nhàng, tránh làm nhiễu loạn đến phần đỉnh của pha tĩnh.Sau đó cho buffer chảy ra khỏi cột tới khi chỉ còn 1-2mm buffer ở phần trên củapha tĩnh Đóng van lại Dùng Pasture pipet cho từ từ dịch chiết lòng trắng trứngvào đỉnh cột
10 Đặt một cái erlen sạch 50mL ở dưới cột, mở van cho các chất chảy ra khỏi cột vàoerlen cho tới khi còn ít hơn 1-2mm dịch chiết lòng trắng trứng ở phía trên pha tĩnh.Đóng van lại và nhẹ nhàng rửa các mặt bên của cột bằng 0,5 ml buffer Tris/NaCl
Mở van và cho chất rửa chảy qua cho tới khi còn lại ít hơn 1-2mm dịch chiết lòngtrắng trứng ở phía trên pha tĩnh Lập lại thao tác tháo và rửa này thêm 1 lần nữavới 0,5 ml Tris buffer Dòng chất lỏng chảy vào cốc gọi là chất rửa cột
11 Sau khi rửa cột lần thứ 2, cho buffer A vào đầy cột Đổ 25ml buffer A bộ phậnphối trộn của hệ thống gradient Bắt đầu dòng chảy của buffer qua ống chích mẫu