Nghiên cứu tạo kháng thể kháng Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà

Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng thể kháng Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm bằng Công nghệ tạo kháng thể IgY ở Gà” với mục đích sản xuất kháng thể IgY

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập, được sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình, bạn bè, cùng với sự nỗ lực của bản thân em đã hoàn thành đề tài này Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô ThS Nguyễn Thị Kim Cúc đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm, góp nhiều ý kiến thiết thực, quý giá trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập để em có được nền tảng kiến thức vững vàng cho những chặng đường tiếp theo

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật đã quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả những người bạn đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học cũng như thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin kính gửi tới bố mẹ và gia đình lòng biết ơn sâu sắc nhất đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong những năm qua

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này!

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

Sinh viên thực hiện Trần Thị Cẩm Tiên

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH viiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) 3

1.1.1 Lịch sử phát triển 3

1.1.2 Tổng quan về trứng gà 4

1.1.3 So sánh IgY (kháng thể lòng đỏ trứng gà) và IgG (kháng thể động vật hữu nhũ) 6 1.1.3.1 So sánh cấu trúc của IgY và IgG 6

1.1.3.2 Ưu và nhược điểm của việc sản xuất IgY so với IgG 6

1.1.4 Tính chất của IgY 8

1.2 Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà 9

1.2.1 Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng 9

1.2.2 Các tế bào và cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch 10

1.2.2.1 Các tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch 10

1.2.2.2 Các cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch 11

1.2.3 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch 11

1.2.4 Các tính chất của đáp ứng miễn dịch 13

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà 14

1.2.5.1 Kháng nguyên 14

1.2.5.2 Liều lượng tiêm 15

1.2.5.3 Vị trí tiêm 15

1.2.5.4 Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm 16

1.2.5.5 Tá dược 17

1.2.5.6 Các nhân tố khác 18

1.3 Thu nhận, tinh sạch và bảo quản IgY 19

1.3.1 Thu nhận lòng đỏ trứng gà 19

1.3.2 Tinh sạch IgY 19

1.3.2.1 Các phương pháp phân tách protein tan trong nước (chứa IgY) và lipid 19

1.3.2.2 Các phương pháp phân tách IgY khỏi phần protein tan trong nước 21

1.3.3 Bảo quản IgY 22

1.4 Dịch bệnh do Streptococcus iniae gây ra 23

1.4.1 Tình hình dịch bệnh 23

1.4.2 Các phương pháp điều trị do Streptococcus iniae hiện nay 24

1.4.3 Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán và điều trị hiện nay 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu 26

2.2 Vật liệu 26

2.2.1 Chủng vi khuẩn 26

2.2.2 Gà mái 26

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất chuyên dụng 26

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Phương pháp gây miễn dịch trên gà 28

2.4.1.1 Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt (vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt) 28

2.4.1.2 Tiến hành gây miễn dịch trên gà 29

2.4.2 Phương pháp Bradford 29

2.4.3 Phương pháp SDS - PAGE 30

2.4.4 Phương pháp tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà 35

2.4.4.1 Tách chiết và tinh sạch theo phương pháp Polson 35

2.4.4.2 Tách chiết và tinh sạch IgY theo phương pháp Polson có hiệu chỉnh 37

2.4.4.3 Tách chiết và tinh sạch IgY theo phương pháp acid hóa 38

2.4.5 Phương pháp xác định hiệu giá ngưng kết (agglutination) vi khuẩn Streptococcus iniae với IgY tinh sạch 38

2.4.6 Phương pháp ELISA 39

2.4.7 Phương pháp Dot Blot 40

2.4.8 Phương pháp xác định khả năng ức chế Streptococcus iniae của IgY tinh sạch 42

2.4.9 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả nồng độ IgY qua các tuần với các liều kháng nguyên khác nhau 44

3.2 Kết quả tách chiết và tinh sạch IgY 47

3.2.1 Hàm lượng protein (IgY) của các phương pháp tinh sạch 48

3.2.2 Kết quả SDS-PAGE 48

3.3 Một số đặc điểm của IgY kháng Streptococcus iniae 51

3.3.1 Kết quả SDS-PAGE xác định khối lượng phân tử của IgY 51

3.3.2 Tính đặc hiệu và hiệu giá ngưng kết vi khuẩn của IgY trong dịch kháng thể tinh sạch từ lòng đỏ trứng 53

3.3.2.1 Kết quả ngưng kết vi khuẩn Streptococcus iniae của IgY tinh sạch 53

3.3.2.2 Kết quả ELISA 54

3.3.2.3 Kết quả Dot Blot 55

3.4 Kết quả xác định khả năng ức chế Streptococcus iniae của IgY tinh sạch 56

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 64

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABTS 2,2’, azino-di-ethylbenzothiazolinesulfonic

DAB 3-3’-diaminobezidine tetrahydrochloride

DDT Dithiothreitol

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FCA Freund’s Complete Adjuvant

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis

PBS - T Phosphate Buffered Saline - Tween

PBS Phosphate Buffered Saline

TEMED N,N,N,N’– Tetramethylethylenediamine

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các thành phần chính trong quả trứng, vỏ ngoài, lòng trắng và lòng đỏ 4

Bảng 1.2 Các thành phần protein và lipid trong lòng đỏ trứng gà 5

Bảng 1.3 So sánh hiệu suất thu nhận kháng thể đa dòng của thỏ và gà (trong suốt giai đoạn hai tuần theo sau lần miễn dịch thứ hai) 7

Bảng 1.4 Qui trình đề nghị liên quan đến miễn dịch trên gà 16

Bảng 1.5 Thành phần lipid và protein trong dịch nổi khi sử dụng các loại gum khác nhau 20

Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà mái ở 2 lần tiêm đầu 28

Bảng 2.2 Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn 30

Bảng 2.3 Thành phần và các dung dịch điện di protein 34

Bảng 3.1 Nồng độ IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà qua các tuần sau khi gây miễn dịch 44

Bảng 3.2 Bảng ANOVA kiểm định kết quả đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm miễn dịch (T1, T2, T3) và nhóm đối chứng (X) 46

Bảng 3.3 Bảng ANOVA kiểm định ảnh hưởng của các liều kháng nguyên khác nhau đến sự đáp ứng miễn dịch trên gà 47

Bảng 3.4 Hàm lượng protein (IgY) của 3 phương pháp tinh sạch 48

Bảng 3.5 Kết quả ngưng kết của các nồng độ kháng thể 53

Bảng 3.6 Kết quả Dot Blot ở các nồng độ kháng thể pha loãng khác nhau 56

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Thành phần cấu trúc của vỏ trứng, màng trứng, lòng trắng và lòng đỏ 4

Hình 1.2 Mô hình đơn giản cấu trúc của kháng thể động vật hữu nhũ (IgG) của thỏ so với kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) 6

Hình 1.3 Quá trình nhận diện kháng nguyên của các lympho bào 10

Hình 1.4 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch thu được 11

Hình 1.5 Tính đặc hiệu, nhớ và tự giới hạn của đáp ứng miễn dịch 13

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 27

Hình 2.2 Mô tả hiện tượng biến tính của protein khi ủ với SDS 31

Hình 2.3 Mô hình gel điện di (SDS-PAGE) 33

Hình 2.4 Mô hình của PEG với các khối lượng phân tử khác nhau 1500, 6000 và 20000 Da trong dung dịch nước 36

Hình 2.5 Sơ đồ chẩn đoán miễn dịch theo phương pháp Dot Blot 41

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ IgY và liều kháng nguyên Streptococcus iniae 45

Hình 3.2 Kết quả SDS-PAGE so sánh 3 quy trình tinh sạch 49

Hình 3.3 Kết quả điện di SDS-PAGE xác định trọng lượng5Error! Bookmark not defined Hình 3.4 Kết quả ELISA ở các nồng độ pha loãng IgY 54

Hình 3.5 Đường cong ức chế sinh trưởng của S iniae 57

vừa tiêu diệt được vi khuẩn gây hại mà không gây ra tình trạng xuất hiện các vi khuẩn kháng lại kháng sinh Phương pháp dùng kháng thể ra đời đã mở ra cuộc cách mạng mới trong điều trị bệnh cho người và động vât Sản xuất kháng thể theo cách truyền thống lấy từ huyết thanh của động vật hữu nhũ (thỏ, cừu, dê , ngựa ) đã gặp những cản trở lớn: gây đau đớn cho động vật, tốn kém trong việc chăm sóc, tinh sạch kháng thể và lượng kháng thể thu được không đáng kể, nên chỉ dùng trong điều trị cho người, gây khó khăn trong công tác điều trị cho các loại động vật Việc tìm ra cơ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng từ gà đã giải quyết được khó khăn khi dùng động vật hữu nhũ

vì kháng thể trứng gà có thể thu nhận dễ dàng dựa trên việc thu nhận trứng, ngoài ra sản xuất IgY có nhiều thuận lợi do chi phí nuôi gà thấp, chăm sóc dễ dàng và năng xuất sản sinh kháng thể cao

Việc ứng dụng công nghệ tạo kháng thể IgY trong điều trị và chẩn đoán bệnh trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam còn nhiều hạn chế Đối tượng chúng tôi chọn

làm kháng nguyên là vi khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh trên cá chẽm - một loài cá

có giá trị kinh tế cao đang được đưa vào nuôi trồng trong thời gian gần đây Cá chẽm là loài giá trị dinh dưỡng cao, nhu cầu thị trường ngày càng mở rộng và là loài phân bố rộng, dễ nuôi nên được nuôi rất phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới: Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam, Australia, Mỹ, Hà Lan, Anh và Israel….[39] Việc nuôi cá chẽm ngày càng phổ biến nên vấn đề dịch bệnh trên cá chẽm được quan tâm nhiều hơn Có nhiều tác nhân gây bệnh trên cá chẽm

trong đó bệnh nhiễm khuẩn do Streptococcus iniae có tỉ lệ gây chết đến 70% trong một

thời gian ngắn gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh xảy ra trên cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn nước mặn Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo

kháng thể kháng Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm bằng Công nghệ tạo kháng

thể IgY ở Gà” với mục đích sản xuất kháng thể IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà nhằm tạo tiền đề cho các ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn

Streptococcus iniae gây ra

Nội dung chính của đề tài

 Khảo sát đáp ứng miễn dịch của Gà với vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt

 Khảo sát quy trình tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng

 Xác định một số đặc điểm của chế phẩm IgY (trọng lượng phân tử, độ sạch, tính đặc hiệu)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY)

1.1.1 Lịch sử phát triển

Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên chứng minh rằng việc tiêm một kháng nguyên vào gà mái dẫn đến việc chuyển giao các kháng thể đặc hiệu tương ứng từ huyết thanh vào lòng đỏ trứng Trong hơn một trăm năm không có ứng dụng khoa học cho kiến thức này Nhưng khi vấn đề đạo đức khoa học được coi trọng thì kết quả của Klemperer đã thu hút sự chú ý lớn, đặc biệt là từ những năm 1980 Sản xuất kháng thể

từ lòng đỏ trứng tỏ ra ưu thế hơn so với phương pháp lấy huyết thanh lúc bấy giờ vì hạn chế đau đớn cho động vật thí nghiệm, lượng kháng thể thu được cao từ đó giảm số lượng động vật thí nghiệm [28], [29]

Từ năm 1980, kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) đã được ứng dụng rộng rãi theo sự xuất hiện các dạng thương mại như kit tinh sạch IgY, các loại kháng thể thứ cấp kháng lại IgY gắn kết với các enzyme như alkaline phosphatase, peroxidase… Để mô tả việc sản xuất, ứng dụng IgY thuật ngữ kỹ thuật IgY ra đời và đã được chấp nhận trên toàn cầu vào năm 1996 Cũng cùng năm đó, Trung tâm Phê chuẩn Các phương pháp thay thế ở Châu Âu (European Centre for the Validation Alternative methods - ECVAM) đã khuyến khích việc sử dụng IgY thay thế cho IgG trong động vật hữu nhũ, để nhằm làm giảm bớt đau đớn gây ra bởi việc thu nhận kháng thể ở huyết thanh Đồng thời ECVAM cũng đưa ra nhiều thông tin về chăm sóc gà đẻ, gây tạo miễn dịch, sử dụng tá dược và các phương pháp tinh sạch IgY Năm 1999 cơ quan thú y của chính phủ Thụy

Sĩ đã chấp nhận kỹ thuật IgY như là một phương pháp thay thể để bảo về động vật tốt hơn [28]

Ngày nay kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như phát hiện và điều trị bệnh IgY có thể ứng dụng trong các phương pháp miễn dịch kiểm nghiệm, mà theo truyền thống thường sử dụng với kháng thể động vật hữu nhũ, đặc biệt là phương pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch enzyme, Western

blotting Bên cạnh đó IgY đã được báo cáo là chất bảo về miễn dịch thụ động được sử dụng thành công trong điều trị các bệnh khó điều trị bằng kháng sinh truyền thống hay bệnh thiểu năng miễn dịch [23]

1.1.2 Tổng quan về trứng gà

a Thành phần của trứng gà

Thành phần cấu trúc chính của trứng gồm vỏ ngoài, lòng trắng và lòng đỏ

Hình 1.1 Thành phần cấu trúc của vỏ trứng, màng trứng, lòng trắng và lòng đỏ [37] Bảng 1.1 Các thành phần chính trong quả trứng, vỏ ngoài, lòng trắng và lòng đỏ [37] Thành phần

b Thành phần của lòng đỏ

Lòng đỏ trứng gà bao gồm 48% nước, 32 35% lipid, 15,7 16,6% protein, 0,2 1,0 % carbonhydrate, 1,1% thành phần tro Protein của lòng đỏ trứng gà được chia thành plasma và granules Thành phần chính của plasma là lipoprotein mật độ thấp và livetin, còn thành phần của granule là lipoprotein mật độ cao (được biết là α - và β - lipovitellin)

-và phosvitin [37]

Livetin là thành phần chứa kháng thể IgY quan tâm hay còn gọi là γ - livetin, ngoài

ra trong livetin còn có α - livetin (albumin huyết thanh), β - livetin (α2 - glycoprotein) Khối lượng phân tử của ba loại livetin lần lượt là 180.000, 80.000, 45.000 Daton

Bảng 1.2 Các thành phần protein và lipid trong lòng đỏ trứng gà [32]

Protein

Apovitellenin I-VI Lipovitellin apoprotein α-Lipovitellin

β-Lipovitellin Livetins α-Livetin (albumin lòng trắng) β-Livetin (α-2-glycoprotein) γ-Livetin (γ-globulin)

Phosvitin Biotin gắn với protein

37,3

26,7 13,3

2,7 4,0 2,7 13,3 Dạng vết

Lipid

Triglyceride Phosphatidylcholine Phosphatidylethanolamine Lysophosphatidylcholine Cholesterol

Sphingomyelin

65

26 3,8 0,6

4 0,6

1.1.3 So sánh IgY (kháng thể lòng đỏ trứng gà) và IgG (kháng thể động vật hữu nhũ) 1.1.3.1 So sánh cấu trúc của IgY và IgG

IgY và IgG đều có cấu tạo gồm hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ IgY có hai chuỗi nặng (Hv) với khối lượng phân tử 67 - 70 kDa mỗi chuỗi và hai chuỗi nhẹ (L) với khối lượng phân tử là 25 kDa mỗi chuỗi [33]

Giữa IgY và IgG có điểm khác biệt rõ nhất là số lượng của vùng cố định (C) trong chuỗi nặng: IgG có ba vùng cố định (Cγ1 - Cγ3), trong khi đó IgY có bốn vùng

cố định (Cυ1 - Cυ4) IgY có thêm một vùng cố định thêm vào với hai chuỗi carbonhydrate tương ứng nên IgY có khối lượng phân tử là 180 kDa lớn hơn so với IgG 150 kDa

Do sự thiếu hụt của vùng hinge giữa Cγ1 và Cγ2 nên IgY ít linh động hơn so với IgG, trong khi đó vùng này lại là đặc trưng của động vật có vú Có một số vùng trong IgY (gần biên giới của Cυ1 - Cυ2 và Cυ2 - Cυ3) chứa điểm chứa glycine và proline làm giới hạn sự linh động IgY có điểm đẳng điện là 5,7 - 7,6 thấp hơn IgG và có tính

kị nước hơn IgG [23]

Hình 1.2 Mô hình đơn giản cấu trúc của kháng thể động vật hữu nhũ (IgG) của

việc giảm đau đớn cho động vật thí nghiệm vì lấy huyết thanh thường gây đau đớn, ảnh hưởng đến sức khỏe động vật thí nghiệm và vi phạm vấn đề đạo đức Thay vì lấy máu định kì theo phương pháp lấy huyết thanh truyền thống thì chỉ cần thu trứng hàng ngày sau khi gây tạo miễn dịch Bên cạnh đó gà có phổ phát sinh thấp hơn động vật hữu nhũ nên mức độ nhạy cảm thần kinh thấp hơn, do đó giảm đau đớn khi tiêm kháng nguyên tạo miễn dịch

Sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng còn làm giảm đáng kể số lượng động vật thí nghiệm vì gà sản xuất ra lượng IgY cao hơn nhiều so với IgG của động vật hữu nhũ cùng kích thước [20] Gà đẻ trứng có thể cho gần 250 - 300 trứng một năm và có thể thu nhận 17 – 35 g IgY tinh sạch từ lòng đỏ của những trứng này Ngược lại, phương pháp thu nhận huyết thanh thu được huyết thanh miễn dịch 40 – 50 ml/con thỏ nên chỉ

có khoảng 1400 mg của IgG tinh sạch thu nhận được Ngoài ra chi phí cho việc nuôi gà mái sản xuất IgY thấp hơn so với động vật hữu nhũ Vì vậy, IgY là phương pháp miễn dịch có hiệu quả kinh tế cho sản xuất qui mô lớn cho kháng thể đặc hiệu khi so với phương pháp miễn dịch động vật truyền thống [13], [24], [28], [37]

Bảng 1.3 So sánh hiệu suất thu nhận kháng thể đa dòng của thỏ và gà (trong suốt

giai đoạn hai tuần theo sau lần miễn dịch thứ hai) [23]

Lượng động vật

Phương pháp thu nhận mẫu

Thể tích mẫu (trong 2 tuần)

40 ml máu

200 mg 5% (10 mg)

5 - 6

2 - 11 IgM, IgA, IgE

1 Thu nhận trứng hàng ngày

Protein của động vật có vú có tính bảo tồn cao thỉnh thoảng lại không đáp ứng miễn dịch trong thỏ nhưng kháng thể kháng lại những protein này lại thường thành công trong hệ thống miễn dịch của gà [30]

IgY không gắn kết với protein A và G, không ràng buộc bổ sung cho động vật

có vú, không xuất hiện để phản ứng chéo với globulin miễn dịch động vật có vú, do đó làm giảm nguy cơ cho kết quả dương tính giả Đồng thời không kết gắn với protein A

và G, không có phản ứng chéo đối với những nhân tố gây bệnh thấp khớp [20], [28]

b Nhược điểm

Bên cạch các ưu điểm vượt trội so với IgG thì IgY cũng còn những mặt hạn chế sau:

 IgY không có khả năng trong việc kết dính với protein A và G, mà những protein này thường sử dụng trong việc phân lập IgY Tuy nhiên, hiện nay đã có các nghiên cứu cho phép tách chiết IgY đơn giản Bên cạnh đó, nghiên cứu “protein A/protein G” nhằm cho quá trình phân lập IgY đã được tiến hành [32]

 IgY là có khả năng kết tủa kháng nguyên thấp hơn IgG Đôi lúc kết tủa có thể tốt hơn bằng cách tăng nồng độ muối trong dung dịch đệm, nhưng khả năng kết tủa kháng nguyên thấp của IgY vẫn còn là sự thiếu sót có thể ngăn cản việc sử dụng của của nó trong chuẩn đoán bệnh [32]

 Ngoài ra còn có một số nguyên nhân phụ như: ít sử dụng gà là động vật thí

nghiệm nói chung và những yêu cầu chăm sóc đặc biệt cho loài gà

11 Tuy nhiên, hoạt động bị giảm đáng kể ở pH =12 hoặc cao hơn [32]

Đối với enzyme, IgY tương đối kháng trypsin hoặc chymotrypsin, nhưng khá nhạy cảm với pepsin Hatta (1993) đã chứng minh hầu như tất cả các hoạt động của IgY đã bị mất sau khi ủ với pepsin, nhưng sau khi 8 giờ ủ với trypsin hoặc chymotrypsin thì hoạt động của IgY vẫn còn 39% và 41% tương ứng [29]

Theo Shimizu (1992), Hatta (1993) và các cộng sự, IgY ổn định ở nhiệt độ khoảng 600C và 700C Hoạt động của IgY giảm khi nung nóng trong 15 phút ở 700C hoặc cao hơn và IgY đã biến tính nghiêm trọng khi được xử lý nhiệt ở nhiệt độ cao hơn

Kháng thể ở gà gồm có ba loại: IgA, IgM và IgY Khi trứng gà vẫn còn trong buồng trứng, gà mái tiến hành chuyển kháng thể vào trứng theo cơ chế sau: IgA và IgM (nồng độ khoảng 0,15 và 0,7 mg/mL) được tiết ra cùng với những protein khác là thành phần của lòng trắng trứng gà tại vòi trứng Trong khi đó, IgY trong huyết thanh ở nồng độ khoảng 25 mg/mL được chuyển một cách đặc hiệu sang màng lòng đỏ vào trong lòng đỏ trong suốt quá trình phát triển Vì receptor đặc hiệu cho việc chuyển IgY xuất hiện trên bề mặt của màng lòng đỏ Ở gà con mới nở, IgY được tìm thấy trong máu, còn IgA và IgM trong đường tiêu hóa [24], [33]

Dựa trên nguyên lý này, muốn thu kháng thể đặc hiệu thì tiến hành gây miễn dịch trên gà mái Sau khi bị tiêm kháng nguyên thì gà mái sẽ tự động tạo ra IgY đặc hiệu cho kháng nguyên quan tâm IgY đặc hiệu này sẽ được chuyển vào trong lòng đỏ trứng gà Tiến hành thu nhận lòng đỏ trứng của gà miễn dịch sẽ thu được kháng thể đặc hiệu mong muốn

1.2.2 Các tế bào và cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch

1.2.2.1 Các tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch [2]

Các tế bào chính của hệ miễn dịch là tế bào lympho, tế bào trình diện kháng nguyên, và tế bào hiệu quả Tế bào lympho là những tế bào có khả năng nhận diện một cách đặc hiệu kháng nguyên lạ và tạo phản ứng chống lại chúng Do vậy, lympho bào là

tế bào trung gian của cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào Có nhiều tiểu quần thể

tế bào lympho khác nhau về cả cách nhận diện kháng nguyên lẫn chức năng của chúng

Tế bào lympho B là tế bào duy nhất có thể sản xuất kháng thể hòa tan Chúng nhận diện kháng nguyên ngoại bào (kể cả kháng nguyên trên bề mặt tế bào) và biệt hóa thành tế bào tiết kháng thể, do đó chúng có tác dụng như tế bào trung gian của miễn dịch thể dịch Tế bào lympho T nhận diện kháng nguyên của vi sinh vật nội bào và có chức năng tiêu diệt những vi sinh vật này hoặc những tế bào bị nhiễm trùng

Sự khởi động và phát triển đáp ứng miễn dịch thu được cũng đòi hỏi kháng nguyên phải được bắt giữ và trình diện cho tế bào lympho Tế bào chịu trách nhiệm làm việc này được gọi là tế bào trình diện kháng nguyên (APC) Tế bào trình diện kháng nguyên được chuyên môn hóa cao nhất là tế bào hình sao (dendritic), chúng bắt giữ những vi sinh vật từ bên ngoài xâm nhập vào, vận chuyển những kháng nguyên này đến các cơ quan lympho và trình diện kháng nguyên cho những tế bào T để khởi động đáp ứng miễn dịch

Hình 1.3 Quá trình nhận diện kháng nguyên của các lympho bào [2]

1.2.2.2 Các cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch

Hệ thống miễn dịch của gà bao gồm bìu fabricius, tủy xương, tụy, tuyến giáp, tuyến Harderian, nốt bạch huyết, lympho bào tuần hoàn, lympho mô trong đường dinh dưỡng Tế bào lympho B được sản xuất từ túi Fabricius Tủy xương gà là nguồn tạo ra

tế bào túi và mầm thymus, còn tụy là trung tâm cho việc phát triển của tế bào huyết thanh và tế bào nhớ Gà không có tụy sẽ sản sinh ra kháng thể thấp Tuyến ức là trung tâm phát triển phân hóa tế bào gốc thành lympho T Sự kích hoạt lympho T tương tự động vật có vú [13]

Trong các cơ quan miễn dịch của gà, một cơ quan rất đặc biệt khác với động vật hữu nhũ là túi Fabricius Túi này là cơ quan lympho - biểu mô nằm ở gần hậu môn, có chức năng tạo ra tế bào B và tham gia vào đáp ứng miễn dịch dịch thể Như đã biết, tế bào B chịu trách nhiệm sản sinh IgY Vì vậy, nếu cắt bỏ túi này trong giai đoạn phôi trước khi trứng nở, sẽ làm rối loạn miễn dịch thể dịch làm giảm hàm lượng IgY rất nhiều

và sinh vật sẽ không sản xuất được kháng thể khi gây cảm nhiễm với mầm bệnh [29]

1.2.3 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch

Quá trình đáp ứng miễn dịch có thể chia ra thành nhiều giai đoạn khác nhau: nhận diện kháng nguyên, hoạt hóa tế bào lympho và giai đoạn hiệu quả (loại trừ kháng nguyên) Sau đó là sự trở lại hằng định nội môi và duy trì tính nhớ miễn dịch

Hình 1.4 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch thu được [2]

a Nhận diện kháng nguyên [2]

Thuyết clon lần đầu tiên được đưa ra bởi Niels Jerne vào năm 1955 và được Macfarlane Burnet làm sáng tỏ vào năm 1957 Nội dung của thuyết chỉ ra rằng, mỗi cá thể sở hữu một lượng tế bào lympho với rất nhiều clon khác nhau Mỗi clon mang sẵn những yếu tố để nhận diện và đáp ứng với một quyết định kháng nguyên nhất định Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể nó tìm đến clon tương ứng và hoạt hóa nó

Weill và Reynaud (1996) lại đưa ra cơ chế gene để giải thích cho sự đa dạng của kháng thể Theo giả thuyết này, động vật có vú hay gà không thể sản xuất ra kháng thể

đa dạng khổng lồ nếu mỗi phân tử kháng thể được mã hóa với những gene riêng biệt Thực tế chỉ ra rằng chỉ có một phần gene được dùng trong mã hóa kháng thể Theo Weill và Reynaud, có ba cơ chế cơ bản giải thích cho sự đa dạng này: sự sắp xếp lại của gene, sự đổi chỗ gene và đột biến thể soma

b Hoạt hóa tế bào lympho

Sự hoạt hóa tế bào lympho đòi hỏi 2 tín hiệu khác nhau: tín hiệu thứ nhất là kháng nguyên và tín hiệu thứ hai là các sản phẩm vi sinh vật hoặc là các thành phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đối với vi sinh vật Ý tưởng này được gọi là thuyết hai tín hiệu đối với sự hoạt hóa lympho bào Yêu cầu về kháng nguyên (tức tín hiệu 1) nhằm đảm bảo tính đặc hiệu của đáp ứng miễn dịch Còn yêu cầu về kích thích phụ do sản phẩm vi khuẩn hoặc của đáp ứng bẩm sinh đối với vi sinh vật nhằm đảm bảo phản ứng chỉ được tạo ra khi cần thiết (tức để chống vi sinh vật) chứ không chống lại các chất vô hại bao gồm kháng nguyên bản thân

c Giai đoạn hiệu quả của đáp ứng miễn dịch: loại bỏ kháng nguyên

Trong suốt giai đoạn hiệu quả của đáp ứng miễn dịch, các lympho bào đã được kháng nguyên hoạt hóa để tạo ra những chức năng hiệu quả để tiến đến việc loại bỏ kháng nguyên Kháng thể loại bỏ kháng nguyên ngoại bào và tế bào T loại bỏ kháng nguyên nội bào Chức năng này của kháng thể và tế bào T thường yêu cầu sự tham gia

của tế bào hiệu quả khác không thuộc hệ lympho và cả cơ chế đề kháng của miễn dịch bẩm sinh

d Hằng định nội môi và duy trì trí nhớ miễn dịch

Vào cuối đáp ứng miễn dịch, hệ thống miễn dịch trở lại trạng thái nghỉ cơ bản

do phần lớn các tế bào tiền thân của lympho bị kháng nguyên kích thích đã chết do hiện tượng chết lập trình (apoptosis) Chết lập trình là một dạng chết sinh lý được chuẩn bị trước, trong đó nhân tế bào bị đặc lại và vỡ ra từng mảng, màng bào tương nổi bọt, không còn sự tách biệt của lớp lipid màng và tế bào chết nhanh chóng bị thực bào

mà các chất nội bào không cần bị giải phóng ra ngoài Một số tế bào lympho B và lympho T được biệt hóa thành tế bào ghi nhớ miễn giúp cho đáp ứng miễn dịch lần sau với chính kháng nguyên đó nhanh và mạnh hơn

1.2.4 Các tính chất của đáp ứng miễn dịch

Hình 1.5 Tính đặc hiệu, nhớ và tự giới hạn của đáp ứng miễn dịch [2]

 Tính đặc hiệu: Đảm bảo các kháng nguyên khác nhau tạo ra đáp ứng đặc hiệu riêng cho chúng

 Tính đa dạng: Cho phép hệ thống miễn dịch đáp ứng được nhiều loại kháng nguyên

 Tính nhớ: Dẫn đến đáp ứng mạnh hơn đối với kháng nguyên đã từng tiếp xúc

 Tính chuyên môn hóa: Tạo ra đáp ứng tối ưu chống lại nhiều loại vi sinh vật khác nhau

 Tính tự giới hạn: Cho phép hệ thống miễn dịch đáp ứng được với các kháng nguyên mới xâm nhập

 Tính không tự phản ứng với bản thân: Ngăn ngừa các tổn thương đối với cơ thể chủ trong suốt quá trình phản ứng với kháng nguyên lạ

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà

1.2.5.1 Kháng nguyên

Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, song một số chất được coi

là kháng nguyên nhưng không gây đáp ứng miễn dịch Ví dụ, hapten là các chất có khối lượng phân tử thấp có thể gắn với kháng thể đặc hiệu nhưng bản thân nó không kích thích tạo kháng thể Hapten bao gồm các phân tử đường, axit amin, các polime nhỏ và nhiều loại kháng sinh [3]

Điều kiện bắt buộc của một chất sinh miễn dịch phải có ba yếu tố sau đây [3]:

 Tính lạ: Chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ với cơ thể, bởi vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với các chất của bản thân Chất càng

lạ với cơ thể bao nhiêu, khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu

 Khối lượng phân tử lớn: Nhìn chung kháng nguyên có khối lượng phân tử lớn hơn 10000 Da Nếu < 1000 Da (penicilin, progesteron, aspirin…) thì không có tính sinh miễn dịch Từ 1000 đến 6000 Da (insulin) có thể có hoặc không có khả năng đáp ứng miễn dịch

 Cấu trúc phân tử phức tạp: Một chất có tính sinh miễn dịch phải là chất có cấu trúc hóa – lí tương đối phức tạp Các chất có cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao

Kháng nguyên có thể hiện diện với hệ thống miễn dịch là phức hợp kháng nguyên (ví dụ, vi khuẩn, virus và kí sinh vật) hay là kháng nguyên đơn giản (ví dụ, protein hay polysaccharide) Protein được nhận diện là kháng nguyên hiệu quả bởi vì

cấu trúc và sự khác biệt xuất hiện giữa các loài và các cá thể Peptide (khối lượng phân

tử thấp dưới 10 kDa) có thể được sử dụng là kháng nguyên, nhưng nó nên được kết hợp với chất mang ví dụ Bovine Serum Albumin hay keyhole limpet haemocyanin theo Schade (2005) và các cộng sự Kháng nguyên polysaccharide cũng hiệu quả Tuy nhiên, lipid và nucleic acid không thể là kháng nguyên nếu chúng không được bắt cặp với protein hay polysaccharide [29]

Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay giữa kháng nguyên với tế bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao Kháng thể hay tế bào lympho không phải liên kết với toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ với những phần nhất định của kháng nguyên, gọi là quyết định kháng nguyên hay epitope Phần tương ứng với nó trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratope Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên tế bào lympho gọi là thụ thể Kích thước của epitope khoảng 7×12×35

A0 gồm 5 - 7 axit amin Một kháng nguyên có nhiều epitope khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng epitope [3]

1.2.5.2 Liều lượng tiêm

Liều lượng của kháng nguyên ảnh hưởng rất nhiều đến đáp ứng miễn dịch Quá nhiều hay quá ít kháng nguyên có thể dẫn đến sự giảm bớt, độ nhạy, sức chịu và những đáp ứng không mong muốn khác [29]

Liều lượng tiêm phù hợp phụ thuộc rất nhiều vào loại kháng nguyên Nếu kháng nguyên là protein thì lượng protein khoảng 10 - 100 µg protein nên được sử dụng [21] Trong các nghiên cứu tạo kháng thể từ vi khuẩn bất hoạt nồng độ kháng nguyên thường dùng trong khoảng 104 - 109 CFU/ml [34]

dưới chân cần tránh, vì chúng có thể dẫn đến việc đi khập khiểng [32] Đối với gà trưởng thành việc tiêm dưới da dễ tiến hành thường tiêm dưới da ở phần cánh, việc tiêm dưới da cần tránh các mạch máu, vị trí tiêm cần có độ lan tốt, không nên bị ứ đọng gây nên các u cục tại vị trí tiêm

Gần đây, phương pháp miễn dịch bằng đường miệng cũng thu hút nhiều sự chú

ý Mặc dù khả năng kích thích theo miễn dịch theo đường miệng là thấp hơn nhiều so với phương pháp tiêm Tuy nhiên, miễn dịch bằng đường miệng thường được xem là bớt gây đau hơn cho động vật, và được xem là sự tiến bộ trong các phương thức miễn dịch tạo kháng thể Phương pháp này được thực hiện bằng cách đưa hỗn hợp kháng nguyên và tá dược qua đường miệng và qua đường mũi họng [12]

1.2.5.4 Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm

Bảng 1.4 Qui trình đề nghị liên quan đến miễn dịch trên gà [32]

<1 ml

2 - 3 lần, kích hoạt miễn dịch trong suốt giai đoạn

đẻ trứng

4 - 8 tuần Toàn bộ thời kì đẻ trứng (khoảng 1 năm)

Tổng số lần tiêm phụ thuộc vào loại và liều lượng kháng nguyên, cũng như tá dược được sử dụng Trong mọi trường hợp, phải có ít nhất hai lần miễn dịch Nếu lượng kháng thể bắt đầu giảm thì nên gây tạo miễn dịch để duy trì kháng thể đặc hiệu luôn ở mức độ cao Kháng thể lòng đỏ nên được kiểm tra sau 14 ngày của lần miễn

dịch sau cùng Nếu lượng kháng thể quá thấp, sẽ tiếp tục thực hiện lại việc tiêm [32] Thường những kết quả báo cáo cho thấy khoảng cách lần tiêm thứ nhất và thứ hai và những lần tiêm tiếp theo nên tiến hành sau 2 đến 4 tuần sẽ cho hiệu quả cao [29]

Bên cạnh điểm có lợi thì tá dược cũng có một số điểm bất lợi là có tác dụng phụ, nên những nghiên cứu mở rộng tìm kiếm chất thay thế được đẩy mạnh Những tác dụng phụ sau đây có thể ít hoặc không có: sự đau u hạt dẫn đến sưng viêm có thể dẫn đến sự di căn; tác động gây ung thư ngẫu nhiên; nguy cơ gây ra dị ứng trong trường hợp sử dụng lặp lại; tác động ngược lên chất lượng thịt nếu dùng làm thực phẩm [33]

Ngày nay, có rất nhiều loại tá dược được sản xuất Tuy nhiên, trong số này tá dược Freund vẫn được sử dụng nhiều nhất Tá dược Freund có hai dạng là hoàn toàn (Freund’s Complete Adjuvant, FCA) và không hoàn toàn (Freund’s Incomplete Adjuvant, FIA) Tuy FCA làm tăng hiệu quả miễn dịch tốt hơn FIA nhưng cũng dễ gây

ra phản ứng phụ hơn ví dụ gây viêm tại vùng mô tiêm Vì vậy, một số nghiên cứu thích

sử dụng kết hợp hai loại tá dược: FCA cho lần miễn dịch nguyên phát và FIA cho lần miễn dịch thứ phát Trong những nghiên cứu này kết quả rất tốt đã đạt được mà không

có tác dụng phụ nào được báo cáo [29]

Tá dược Freund dạng hoàn toàn (FCA) là hệ nhũ hóa dầu trong nước, bao gồm:

dầu khoáng, mannide mono-oleate, và Mycobacterium tuberculosis đã giết chết bởi nhiệt (hay M butycium) hay một số thành phần của vi sinh vật này FCA là tá dược

kích hoạt cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tương tác tế bào FCA thường phản ứng

mạnh vì dầu khoáng không thể chuyển hóa và thành phần vi nấm có thể tạo ra một vài phản ứng viêm Nồng độ của vi nấm thay đổi lớn trong FCA thương mại Về phần này, cần chú ý rằng nếu nồng độ của vi nấm mà ít hơn 0,5 mg/ml thì kết quả phản ứng sưng viêm sẽ ít trầm trọng hơn [6]

Tá dược Freund dạng không hoàn toàn (FIA) có thành phần giống như FCA nhưng không có tế bào vi nấm hay thành phần tế bào FIA thì ít hiệu quả hơn so với FCA trong việc tạo ra kháng thể cao hơn và tạo giữ miễn dịch tương tác tế bào FIA thường được dùng cho các lần miễn dịch thứ phát [6]

1.2.5.6 Các nhân tố khác

Độ tuổi gà đẻ trứng: nồng độ IgY trong gà mới đẻ trứng cao hơn gà đẻ trứng già.Li (1998) so sánh trọng lượng của lòng đỏ và lòng trắng với phần trăm gà sản xuất hằng ngày và kháng thể lòng đỏ (IgY) sản xuất ở Single - Comb White Leghorn và Rhode Island Red được miễn dịch với huyết thanh albumin của bò (BSA) Phần trăm của tổng IgY cũng như kháng thể đặc hiệu cho BSA được sản xuất ra trong trứng là tương đương nhau Tuy nhiên, gà ở Single - Comb White Leghorn sản xuất ra trứng có khối lượng lòng đỏ cao hơn và phần trăm gà đẻ trong ngày cao hơn [36]

Tokarzewski (2002) nghiên cứa ảnh hưởng của kháng sinh như là enrofloxacin

và chloramphenicol lên mức độ IgY trong huyết thanh và lòng đỏ sau khi kích hoạt

miễn dịch gà với kháng nguyên Samonella enteritidis Cả hai kháng sinh thử nghiệm

đều làm giảm mức độ đặc hiệu của IgY trong gà đẻ trứng được miễn dịch với vi khuẩn sống và lypopolysaccharide, thể hiện rằng kháng sinh có tác động mạnh lên hệ thống miễn dịch [37]

Theo Wang (2000), chế độ ăn uống acid béo không bão hòa tác động mạnh lên

sự phân chia của tế bào bạch huyết gà đẻ trứng và nồng độ IgG trong huyết thanh và trong lòng đỏ trứng gà Dầu hạt lanh trong khẩu phần tăng nồng độ IgG trong huyết thanh gà đẻ trứng trong khi đó dầu hướng dương trong khẩu phần ăn làm giảm nồng độ IgY trong lòng đỏ trứng gà Điều này cho thấy tỉ lệ của n - 6 cho n - 3 PUFA đóng vai

trò quan trọng trong việc đáp ứng miễn dịch của gà đẻ trứng và n - 3 của acid béo có hiệu lực khác nhau trong việc miễn dịch [37]

1.3 Thu nhận, tinh sạch và bảo quản IgY

1.3.1 Thu nhận lòng đỏ trứng gà

Trứng thu nhận được từ gà gây tạo miễn dịch nên được tiến hành tách bỏ vỏ Lòng đỏ trứng được tách khỏi lòng trắng, nên được rửa với nước và đệm để loại bỏ albumin còn sót lại rồi mới phá vỡ màng bên ngoài và thu nhận lòng đỏ Lòng đỏ thu nhận nếu chưa tiến hành tinh sạch ngay thì nên bảo quản tại 4oC Việc phân lập lòng đỏ khỏi lòng trắng có thể tiến hành thủ công bằng tay hay tự động hóa [37]

1.3.2 Tinh sạch IgY

Lòng đỏ trứng gà còn gọi là dung dịch nhũ hóa của protein và lipid, bao gồm 48% nước, 34% lipid, 17% protein Vì vậy, một trong những trở ngại chính trong phân lập IgY từ lòng đỏ là nồng độ cao của lipid và lipoprotein Trong lòng đỏ, IgY là protein tan trong nước trong khi lipid lại xuất hiện dưới dạng là lipoprotein, kết hợp với protein Vì lý do này, tinh sạch IgY thường bao gồm hai bước: bước đầu tiên là tách phần protein tan trong nước (chứa IgY) và lipoprotein trong lòng đỏ, bước thứ hai là phân tách IgY khỏi phần protein tan trong nước

1.3.2.1 Các phương pháp phân tách protein tan trong nước (chứa IgY) và lipid

Một vài chất gum tự nhiên (carrageenan, xanthan gum) được thấy là hiệu quả trong loại bỏ lipoprotein ở lòng đỏ dưới dạng kết tủa Khi sử dụng λ - carrageena thì thành phần lipid trong dịch nổi bề mặt sau khi loại bỏ kết quả kết tủa ít hơn 0,4% so với lòng đỏ [17]

Bảng 1.5 Thành phần lipid và protein trong dịch nổi khi sử dụng các loại gum

72,9 50,2 16,2 16,2 20,2 18,4 53,6 55,3 46,0 34,9 42,5 18,1 20,1

Một hệ thống hai pha nước với phosphate và Triton X-100 để phân pha và tách hiệu quả protein hòa tan và lipid Lipid được chiết tách vào pha ở phía trên giàu chất tẩy (Triton X - 100), trong khi đó IgY thì được chiết tách trong pha ở dưới giàu thành phần phosphate

Akita và Nakai (1993) đề nghị phương pháp pha loãng nước dưới điều kiện acid

để loại bỏ lipid và lipoprotein khỏi lòng đỏ trứng gà Đây là quá trình kinh tế và hiệu quả cho việc nâng qui mô sản xuất IgY từ lòng đỏ trứng gà Hiện nay có một số nghiên cứu vẫn sử dụng phương pháp này để tách chiết kháng thể [22] Phương pháp này có nhược điểm là cho nồng độ kháng thể thấp, nhưng thể tích dịch thu được rất cao, do đó thường có bước tủa lại để cô đặc kháng thể

Acid caprylic nồng độ 6% (v/v) cũng được chứng minh là có khả năng tách hiệu quả protein hòa tan khỏi lipid và lipoprotein

1.3.2.2 Các phương pháp phân tách IgY khỏi phần protein tan trong nước

Có thể sử dụng những chất có khả năng gây kết tủa như muối ammonium sufate, sodium sulfate, lithium sufate và sodium citrate, kẽm sulphate hay cadmium sulphate.,

PEG 12%, ethanol [8], [12], [14]

Các phương pháp sắc kí (sắc kí trao đổi, sắc kí lọc gel, hay sắc kí ái lực) được

sử dụng để thu được IgY có độ tinh sạch cao hơn Tuy nhiên, phương pháp sắc kí có nhược điểm là khá đắt tiền Tuy nhiên hiệu quả tách chiết của các phương pháp sắc kí

co thể cho kháng thể IgY có độ tinh sạch hơn 90% [8], [17] Vì chi phí tinh sạch theo phương pháp sắc kí tốn kém nên trong sản suất không ưu tiên sử dụng

Kĩ thuật siêu lọc theo Kim (1998) cho phép tinh sạch IgY trong thời gian ngắn

và hiệu quả cao Tùy hệ thống lọc sử dụng, độ tinh sạch khoảng 72 - 99%

Kĩ thuật Gradiflow cũng cho phép tinh sạch IgY với hiệu suất và độ tinh sạch cao Gradiflow là một dụng cụ điện chuyển có thể tinh sạch một protein đích dựa sự tích điện của nó và khối lượng phân tử Phương pháp này dựa trên sử dụng đệm pH đặc biệt trong liên kết với ba màng polyacrylamide có kích thước lỗ phù hợp để hạn chế sự

di chuyển protein Dụng cụ này được ứng dụng đặc biệt cho kháng thể lòng đỏ trứng vì khối lượng phân tử cao và dãy đẳng điện (pI) phân biệt Kích thước phân tử của IgY là 180.000 Da và nó có dãy pI là 6,5 -7,5

Trong thực tế, tùy vào yêu cầu và điều kiện phòng thí nghiệm mà có thể sử dụng một phương pháp riêng lẻ, hay phối hợp các phương pháp này lại để tinh sạch kháng thể có hiệu quả nhất

1.3.3 Bảo quản IgY

Lòng đỏ trứng chứa kháng thể thu nhận được có thể bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau

 Phương pháp sử dụng hóa chất: Natri azide (NaN3) có thể được sử dụng để bảo quản kháng thể vì nó có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Nồng độ sử dụng phù hợp là khoảng 0,1% (w/v) [29] Nồng độ sucrose, maltose, glycerol hay glycin 2% thể hiện hoạt tính bảo vệ chống lại việc phân hủy bởi nhiệt của IgY Ngoài

ra, theo nghiên cứu của Jaradat và Marquardt (2000) thì Trehalose là chất bảo vệ tốt nhất, theo sau là cyclodextrin khi IgY được trữ tại 6 hay 14 tuần tại các nhiệt độ khác nhau Sucrose, lactose và dextran không có hiệu quả là chất bảo vệ dưới điều kiện này Bột lòng đỏ làm khô lạnh với 5% gum arabic thể hiện sự ổn định tốt hơn chống lại protease [37]

 Phương pháp đông lạnh và sấy thăng hoa: Đông lạnh và sấy thăng hóa tại nhiệt

độ thấp thường được xem xét là ít gây biến tính Một số nghiên cứu đã báo cáo về ảnh hưởng của phương pháp sấy thăng hoa đến sự ổn định của IgY Shimizu và cộng sự (1988) cho rằng sấy thăng hoa và làm lạnh không làm ảnh hưởng IgY trừ khi lặp lại vài lần Tuy nhiên, Chansarkar (1998) thể hiện rằng phương pháp đông lạnh hay sấy thăng hoa IgY dẫn đến giảm hoạt tính gắn kết kháng nguyên và giảm độ hòa tan dưới điều kiện nồng độ muối và protein cao Sunwoo (2002) cũng báo cáo những kết quả tương

tự Gần đây, Fu và cộng sự (2006) thử nghiệm độ ổn định nhiệt độ của IgY tại nhiệt độ khác nhau trong khoảng 25 và 90oC trong 15 phút xử lý, trước và sau khi dùng phương pháp sấy thăng hoa Kết quả của họ chỉ ra rằng IgY sấy thăng hoa thể hiện sự ổn định nhiệt tốt mà không làm giảm hiệu quả trong hoạt tính phản ứng trừ khi nhiệt độ đạt đến

90oC [29]

Phương pháp sấy phun: Yokoyama (1992) đã phân tính một số đặc tính của bột IgY thu được từ phương pháp sấy phun và sấy thăng hoa phần hòa tan trong nước của

lòng đỏ trứng gà (chứa IgY) từ gà miễn dịch với Escherichia coli Khi so sánh với bột

sấy thăng hoa, bột sấy phun vẫn giữ được độ chuẩn của kháng thể, kể cả khi nhiệt độ sấy phun lên đến 140 đến 170oC Tuy nhiên, phương pháp sấy phun có độ ẩm thành

phần của bột cao hơn sấy thăng hoa [29]

1.4 Dịch bệnh do Streptococcus iniae gây ra

1.4.1 Tình hình dịch bệnh

Tình hình dịch bệnh do Streptococcus iniae là vi khuẩn hình cầu có đường kính

lên đến 1,5 µm các tế bào thường ghép với nhau tạo chuỗi liên cầu khuẩn Những liên cầu khuẩn này thuộc gram dương, không sinh bào tử, không di động Khi nuôi cấy trên các môi trường tổng hợp như Tryptic Soy Agar (TSA), Brain Heart Infusion Agar (BHIA) hình thành các khuẩn lạc tròn nhỏ có đường kính 1 – 2 mm Những loài cá

khác nhau khi nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae có những dấu hiệu khác nhau, tuy

nhiên đều xuất hiện một số dấu hiệu chung bao gồm: màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không

bình thường Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá nói chung và trên cá

chẽm nói riêng gây ra nhiều thiệt hại về kinh tế cho ngành nuôi trồng trên thế giới Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn nước mặn và kết quả là làm cho cá chết với tỷ lệ cao lên đến 70% trong thời gian ngắn gây thiệt hại lớn cho người nuôi trên toàn thế giới [40]

Streptococcus iniae được tìm thấy vào năm 1976 bởi Pier và Madin từ đó nhiều đợt bùng phát dịch bệnh do Streptococcus iniae gây ra xuất hiện nhiều nơi trên thế

giới Năm 1970 và 1980 tại Nhật Bản năm 1970, 1980; Singapore, Israel và Đài Loan Các báo cáo của Alicia E (2005), Bromage E.S (1999) và các cộng sự cũng cho thấy

Streptococcus iniae là tác nhân chính gây bệnh trên cá chẽm ở Australia với liều gây

chết LD50 là 2,5 × 105 CFU/g trong 2 ngày và 3,2 × 104 CFU/g trong 10 ngày [38]

Ở Việt Nam trong những năm gần đây khi nghề nuôi tôm sú gặp khó khăn, người nuôi đã chuyển hướng nuôi mới là cá chẽm - một loài cá có giá trị kinh tế cao Các vùng nuôi cá chẽm như huyện Cam Ranh, Vạn Ninh thuộc tỉnh Khánh Hòa; Hương Trà thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế; Hà Tĩnh; Đồng Nai; Bình Định; Cà Mau; Hậu Giang; Trà Vinh [39] Tuy nhiên các vùng nuôi cá chẽm phát triển và mở rộng thì vấn đề dịch bệnh ở cá bắt đầu xuất hiện ngày càng nhiều, gây thiệt hại cho người nuôi

Trong đó bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra nhiều tổn thất cho nhà nuôi với

tỉ lệ chết khi nhiễm bệnh có thể lên đến 70%, gây khó khăn cho nhiều vùng nuôi Bên cạnh đó nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển mạnh và thành dịch trên diện rộng

1.4.2 Các phương pháp điều trị do Streptococcus iniae hiện nay

Hiện nay các phương pháp điều trị chủ yếu tập trung vào việc sử dụng kháng

sinh và các chất sát trùng đề loại bỏ mầm bệnh Vi khuẩn Streptococcus iniae nhạy

cảm với các kháng sinh như Norfloxacine, Ciproffloxacin, Sulphamethoxazol/ trimethoprim, Ampicillin, Erythromycin, Doxycycline và Amoxicyclin [18] Việc sử dụng kháng sinh bị hạn chế do ngày càng có nhiều kháng sinh bị cấm sử dụng Vậy nên việc sử dụng vaccine trong phòng và điều trị được tập trung hơn trước, tuy nhiên việc sản xuất vaccine để phòng và điều trị bệnh mới chỉ dùng cho những loài thủy sản có giá trị kinh tế cao, bên cạnh đó việc tiêm vaccine gây ra khó khăn như kĩ thuật tiêm, mất thời gian, gây strees cho vật nuôi có nhiều biện pháp đưa ra để hạn chế những khó khăn trên như thay vì tiêm sẽ chuyển qua phương pháp ngâm hay miễn dịch qua đường ăn uống nhưng vẫn chưa đạt được hiêu quả như mong muốn

Ở Việt Nam việc phòng trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất gần đây đã khiến cho việc xuất khẩu thủy sản gặp rất nhiều khó khăn

do danh mục các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng Việc sử dụng vaccine ở nước ta vẫn còn rất hạn chế, vì tính kinh tế không cao

Vì các lý do trên, cần tìm ra phương pháp mới, hiệu quả hơn trong điều trị bệnh,

do đó công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà ra đời Đây là bước ngoặt lớn cho việc điều trị bệnh nói chung và ứng dụng trong ngành thủy sản nói riêng Kháng thể IgY có nhiều điểm thuận lợi trong điều trị hơn kháng sinh: không gây ra hiện tượng kháng kháng sinh như hiện nay, sản phẩm thủy sản không tồn đọng kháng sinh So với vaccine thì IgY không gây stress cho vật nuôi, có thể dùng cho phòng bệnh và điều trị khi dịch bệnh xảy ra

1.4.3 Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán và điều trị hiện nay

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tạo kháng thể IgY trong điều trị và chẩn đoán nhưng chủ yếu là các bệnh ở người và động vật hữu nhũ [22], [32], [34] Nhưng ứng dụng vào ngành nuôi trồng thủy sản chưa được phổ biến, mới chỉ có các nghiên cứu tạo kháng thể IgY kháng lại các bệnh do virus gây bệnh trên tôm và mới đây có

nghiên cứu tạo kháng thể kháng Streptococcus mutan của Rajan (2011) và các cộng sự

[5], [34] Chưa có nhiều sản phẩm IgY dùng trong điều trị và chẩn đoán bệnh cho động vật thủy sản.Việc chẩn đoán hiện nay vẫn chủ yếu dùng kháng thể từ huyết thanh động vật hữu nhũ

Tại Việt Nam mới chỉ có vài nghiên cứu tạo kháng thể IgY [4], [5], [6], nhưng vẫn chưa có ứng dụng vào điều trị và chẩn đoán bệnh phổ biến

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu

 Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành và phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh và Môi trường, trường Đại học Nha Trang

 Thời gian tiến hành nghiên cứu từ ngày 01/03/2013 đến ngày 28/06/2013

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất chuyên dụng

Hóa chất: Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O2, NaCl, KCl, KH2PO4, (NH4)2SO4, acid acetic, ethanol, methanol, tá dược FCA (Freund’s complete adjuvant), tá dược FIA (Freund’s incomplete adjuvant), PEG 6000, Tween 20, SDS tinh khiết của hãng Merck, các hóa chất điện di của hãng Bio-Rad, thuốc thử Bradford CCB G 250, TMB/H2O2,

H2SO4, ABTS, DAB, casein, skimed milk, kháng thể thứ cấp gắn enzyme perosidase, acid citric…

Thiết bị chuyên dụng: Thiết bị đo quang phổ UV-VIS (CARY 100), thiết bị ly tâm lạnh thể tích nhỏ (Mega 17R), thiết bị điện di protein của hãng Bio-Rad (Mini PROTEAN® Tetra Cell), máy vortex, bể ổn nhiệt…

Dụng cụ: pipet, micropipette, đầu tuýp các loại, ống nghiệm, eppendorff, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, đèn cồn

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu được trình bày trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Khảo sát đáp ứng miễn dịch trên gà với

3 liều kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt

(1,5×104, 1,5×106, 1,5×108 CFU)

Khảo sát 3 phương pháp tách chiết và tinh sạch

kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) (Polson, Polson có hiệu chỉnh và acid hóa)

Kiểm tra tính đặc hiệu và hiệu giá kháng thể của

IgY với S iniae

Xác định trọng lượng

phân tử của IgY

Xác định một số đặc điểm của IgY

Kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của vi

khuẩn S iniae

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp gây miễn dịch trên gà

2.4.1.1 Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt (vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt)

Vi khuẩn Streptococcus iniae được nuôi cấy qua đêm trong môi trường Tryptic

Soy Broth (TSB) bổ sung 1,5% muối ở 370C trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút Cho formalin 40% vào dịch vi khuẩn đã nuôi qua đêm sao cho đạt nồng độ 0,5% , ủ qua đêm ở 40C để bất hoạt vi khuẩn Sau đó ly tâm 7000 vòng trong 20 phút ở 40C, thu cặn Cặn được hòa lại trong PBS bằng thể tích ban đầu và tiếp tục ly tâm ở 7000 vòng trong 20 phút ở 40C, thu cặn Lặp lại bước này một lần nữa, cặn được hòa trong 1ml

PBS Pha loãng dịch vi khuẩn bằng dung dịch PBS để đạt các nồng độ vi khuẩn

(3×104), (3×106) và (3×108) CFU/ml, bảo quản ở 40C

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát đáp ứng miễn dịch của gà

với 3 liều lượng kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt: T1 (1,5×104), T2 (1,5×106) và T3 (1,5×108) CFU nhằm xác định liều kháng nguyên hiệu quả nhất trong sản xuất IgY

Thực hiện gây miễn dịch 6 con gà mái được chia thành ba nhóm (2 con/nhóm) Ngoài ra, còn 2 con gà đối chứng (kí hiệu X) được miễn dịch với 1 ml dung dịch PBS

Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà mái ở 2 lần tiêm đầu

2.4.1.2 Tiến hành gây miễn dịch trên gà

Gà được tiêm dưới da vào hai cánh tại bốn điểm (mỗi bên trái hay phải tiêm hai phát) Kháng nguyên được chuẩn bị như ở Bảng 2.3 Phối trộn đều 0,5 ml dung dịch vi khuẩn bất hoạt ở các nồng độ kháng nguyên phù hợp với 0,5 ml tá dược Hỗn hợp được vortex kĩ cho đến khi thu được 1 ml dung dịch nhũ hóa hoàn toàn ở dạng sữa, bảo quản

ở 40C

Tiêm mũi nguyên phát bắt đầu vào ngày 0, mỗi con gà được miễn dịch với 0,5

ml dung dịch vi khuẩn được nhũ hóa trong 0,5 ml tá dược Freund hoàn toàn (FCA) Các mũi tiêm nhắc lại sử dụng tá dược Freund không hoàn toàn (FIA) ở ngày thứ 21, không sử dụng tá dược ở ngày 35 sau khi tiêm mũi đầu tiên

Tất cả các con gà được miễn dịch đều được lấy máu tĩnh mạch sau mỗi lần tiêm

để kiểm tra IgY đặc hiệu trong huyết thanh bằng phương pháp ELISA

Trứng của các con gà có IgY đặc hiệu trong huyết thanh sẽ được thu nhận hằng ngày để theo dõi sự thay đổi nồng độ IgY theo thời gian Trứng gà được thu ngay sau khi tiêm và kéo dài trong suốt 10 tuần Trứng được dự trữ tại 4oC cho đến khi tiến hành tách chiết

2.4.2 Phương pháp Bradford

a Nguyên lý

Dựa vào phản ứng màu của protein với Coomassie Brilliant Blue G250, trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh dương và thay đổi bước sóng hấp thu cực đại từ 465 nm của thuốc nhuộm sang 595 nm của phức hợp thuốc nhuộm - protein Độ hấp thu ở bước sóng 595

nm cũng như cường độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch [31]

b Tiến hành

Xây dựng đường chuẩn

Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin)

Hút 1000 μl dung dịch protein vừa pha loãng theo bảng trên, thêm vào 5000 μl

thuốc thử Bradford, lắc đều Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm Vẽ đồ thị

biểu diễn biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn

(μg/ml) Tại mỗi nồng độ tiến hành đo 3 lần, sau đó xác định giá trị OD trung bình

Đo nồng độ protein các mẫu

 Pha loãng mẫu đến nồng độ phù hợp để cho ∆ODmẫu Ở đây, tiến hành pha loãng

mẫu 1/75 lần

 Hút 900 μl dung dịch protein cần phân tích đã pha loãng, thêm vào 4500 μl

thuốc thử Bradford, lắc đều Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm Thực hiện

ba lần đối với mỗi mẫu, lấy giá trị OD trung bình và tính ΔOD Từ đường chuẩn suy ra

nồng độ protein mẫu cần phân tích

 Tính kết quả nồng độ protein theo công thức sau:

Nồng độ mẫu = nồng độ tính toán × độ pha loãng

2.4.3 Phương pháp SDS - PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS - PAGE) là

phương pháp được Shapiro và cộng sự giới thiệu năm 1967, kể từ đó nó trở thành một

phương pháp được sử dụng rộng nhất để phân tích hỗn hợp protein Phương pháp này điện di protein đứng để phân tách các thành phần protein theo trọng lượng phân tử [31]

a Nguyên lý

Phương pháp diện di SDS-PAGE dựa trên cơ sở các phân tử tích điện âm, khi ở trong điện trường sẽ dịch chuyển về phía anode Tốc độ dịch chuyển của chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử: các phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm và ngược lại Kết quả là từ một điểm chung (giếng tải mẫu) các phân tử protein khác nhau trên cùng một làn (lane) sẽ dịch chuyển về một hướng và phân bố ở các vị trí (các band) khác nhau tương ứng với trọng lượng phân tử của chúng

Protein bị biến tính bởi nhiệt độ với sự hiện diện của SDS (sodium dodecyl sulfate) SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide, làm biến tính protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, làm cho các phân tử protein trở thành dạng que (Hình 2.2)

Hình 2.2 Mô tả hiện tượng biến tính của protein khi ủ với SDS

SDS có thể phá vỡ các vùng kỵ nước bằng cách phá vỡ các liên kết cấu trúc bậc

2 và bậc 3 của protein, làm các phân tử protein duỗi thẳng mạch, đồng thời SDS liên

kết với mạch chính protein làm cho các phân tử này trở nên tích điện âm