Phương pháp ELISA bao gồm: ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp. ELISA trực tiếp là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽđược gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme). Ởphương pháp ELISA gián tiếp, phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ được phát hiện nhờ kháng thể thứ cấp có gắn enzyme. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp.
a. Nguyên lý
Dựa vào liên kết đặc hiệu giữa phức hợp kháng nguyên - kháng thể và kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phân hủy cơ chất tạo màu để phát hiện.
b. Tiến hành
Cho vào mỗi giếng 150 μl dịch vi khuẩn có nồng độ 10 µg/ml. Chú ý không nên sử dụng các giếng ở rìa ngoài cùng. Đậy nắp và bỏ đĩa vào túi plastic, ủở 40C qua đêm (15 - 18h).
Rửa giếng 3 lần trong PBS - T mỗi giếng dùng 200 μl/lần
Cho vào mỗi giếng 200 µl blocking solution (3% w/v skimmed milk powder trong PBS - T)
Rửa giếng 3 lần trong PBS - T mỗi giếng dùng 200 μl/lần
Cho 100 μl IgY tinh sạch ở các nồng độ pha loãng 1/100, 1/1000 và 1/10000 vào mỗi giếng, giếng đối chứng cho vào 100 μl PBS - T
Đậy nắp và bỏđĩa vào túi plastic, ủ ở 37oC trong 2h Rửa giếng 3 lần trong PBS - T mỗi giếng dùng 200 μl/lần
Thêm 50 μl kháng thể thứ cấp được gắn với enzyme peroxidase đã được pha loãng ở mức 1/5000 trong PBS - T
Đậy nắp và bỏđĩa vào túi plastic, ủ ở 37 oC trong 1h Rửa giếng 3 lần trong PBS - T mỗi giếng dùng 200 μl/lần
Thêm 50 µl Peroxidase substrate solution (ABTS/ H2O2) vào mỗi giếng Sau 15 - 30 phút dừng phản ứng với H2SO4 2,5N và đọc kết quả