Sau khi tách chiết và tinh sạch 2 ml lòng đỏ trứng bằng 3 phương pháp, dịch IgY tinh sạch được kiểm tra hàm lượng protein tổng số dựa vào phương pháp Bradford.
Kết quả nghiên cứu trên Bảng 3.4 cho thấy phương pháp tách acid hóa cho hàm lượng protein tổng số trong dịch IgY tinh sạch là cao nhất, trong khi hai phương pháp Polson và Polson có hiệu chỉnh cho hàm lượng protein không có sự khác biệt lớn. Tuy nhiên, để khẳng định hiệu quả tinh sạch của 3 quy trình chúng tôi tiến hành điện di SDS-PAGE dịch IgY tinh sạch để kiểm tra.
Bảng 3.4. Hàm lượng protein (IgY) của 3 phương pháp tinh sạch
TT Hàm lượng protein tổng số (µg) Phương pháp Polson Phương pháp Polson có hiệu chỉnh Phương pháp acid hóa 1 8023,4 ± 30 8146,4 ± 15 9891,4 ± 52 2 7054,6 ± 24 7130,6 ± 30 8837,7 ± 33 3 7693,9 ± 33 7789,4 ± 21 9061,8 ± 29 3.2.2. Kết quả SDS-PAGE
Để dễ dàng so sánh, các mẫu IgY tinh sạch theo 3 phương pháp sẽ được xử lý nhiệt và DDT trước khi tiến hành SDS-PAGE.
Hình 3.2. Kết quả SDS-PAGE so sánh 3 quy trình tinh sạch. Giếng 1: IgY tách chiết theo phương pháp Polson; giếng 2: IgY tách chiết theo phương pháp Polson có hiệu chỉnh; giếng 3: IgY tách chiết theo phương pháp acid hóa; giếng 4: thang chuẩn protein.
Kết quả nghiên cứu trên Hình 3.2 cho thấy ở tất cả các giếng có dịch protein được tinh sạch theo ba phương pháp đều xuất hiện các band đậm có khối lượng phân tử trong khoảng 25 – 27 kDa (tương ứng với khối lượng phân tử của chuỗi nhẹ của IgY) và 65 – 67 kDa (tương ứng với khối lượng phân tử của chuỗi nặng). Như vậy, việc tách chiết theo 3 phương pháp đều thu được kháng thể IgY. Tuy nhiên, khi xem xét về độ tinh sạch của các dịch IgY thì phương pháp Polson cho kết quả IgY tinh sạch nhất
(Giếng 1) thể hiện ở số lượng và độ đậm của các band tạp nhiễm (nằm giữa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ) thấp nhất so với hai phương pháp còn lại, trong khi đó phương pháp acid hóa là phương pháp cho kết quả tinh sạch của IgY kém nhất (Giếng 3) thể hiện ở số lượng và độ đậm của các band tạp nhiễm là nhiều nhất.
Kết hợp các kết quả về hàm lượng protein tổng số và kết quả điện di SDS – PAGE của các dịch IgY tinh sạch theo 3 phương pháp chúng tôi có một số nhận xét như sau :
Mặc dù phương pháp acid hóa có ưu điểm hiệu suất thu hồi protein tổng số cao, đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, dễ áp dụng trong sản xuất ở quy mô lớn, nhưng độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau tách chiết thấp. Chính vì vậy, các chế phảm IgY đòi hỏi có độ tinh sạch cao thì muốn sử dụng phương pháp này cần phải tiến hành các bước tinh sạch sau đó.
Tách chiết và tinh sạch IgY bằng phương pháp Polson mặc dù vẫn chưa loại bỏ hoàn toàn được các protein tạp nhiễm, nhưng cho độ tinh sạch của chế phẩm IgY tốt nhất trong 3 phương pháp. Tuy nhiên, phương pháp này khó ứng dụng trong sản xuất ở quy mô lớn. Cũng chính vì thế phương pháp này thường được lựa chọn trong hầu hết các nghiên cứu sản xuất IgY ở quy mô phòng thí nghiệm.
Phương pháp Polson có hiệu chỉnh cho thấy độ tinh sạch kháng thể IgY kém hiệu quả hơn so với phương pháp Polson, như vậy việc bỏ qua một bước tủa với PEG dẫn đến lượng protein tạp nhiễm cũng tăng lên.
Như vậy, tùy vào yêu cầu, mục đích và và quy mô sản xuất IgY mà lựa chọn phương pháp tách chiết và tinh sạch phù hợp nhất hoặc cũng có thể kết hợp các phương pháp để đạt được hiệu quả tốt nhất. Trong nghiên cứu này, để sản xuất chế phẩm IgY hướng tới việc ứng dụng trong chẩn đoán bệnh do S. iniae gây ra, chúng tôi lựa chọn phương pháp Polson để tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng.
3.3. Một số đặc điểm của IgY kháng Streptococcus iniae
Chế phẩm IgY tinh sạch thu được của đề tài được tiến hành kiểm tra sơ bộ một số đặc điểm của kháng thể đặc hiệu S. iniae (trọng lượng phân tử, tính đặc hiệu, hiệu giá, khả năng ức chế vi khuẩn).
3.3.1. Kết quả SDS-PAGE xác định khối lượng phân tử của IgY
Thí nghiệm này nhằm kiểm tra trọng lượng phân tử của IgY trong chế phẩm kháng thể IgY tinh sạch.
Để xem xét khối lượng phân tử của IgY chưa bị phân cắt, mẫu IgY tính sạch không xử lý nhiệt và DDT để tránh làm biến tính và phân cắt IgY thành các tiểu đơn vị. Để so sánh với mẫu IgY không phân cắt, mẫu IgY được xử lý nhiệt và DDT để làm biến tính và phân cắt IgY thành các tiểu đơn vị.
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu IgY tinh sạch chưa phân cắt xuất hiện band có khối lượng phân tử trong khoảng 170-190 kDa (giếng 1, Hình 3.3) và một số band tạp nhiễm khác. Các mẫu IgY đã phân cắt xuất hiện các band nằm trong khoảng 25-27 KDa và 65-67 KDa (Giếng 2, 3 Hình 3.3) và một số band tạp nhiễm khác. Kết quả này tương tự với với kết quả đã được nghiên cứu cho biết khối lượng phân tử của IgY (180 KDa), chuỗi nặng của IgY (67-70 KDa), chuỗi nhẹ (25-27 kDa) [23], [33] và các kết quả nghiên cứu của các tác giả Lê Đông Dương (2011), Mahdavi (2010), Sentila (2011) [4], [22], [34].
Hình 3.3. Kết quả điện di SDS-PAGE xác định trọng lượng. Giếng 1: IgY không xử lý nhiệt và DDT; giếng 2, giếng 3: IgY được xử lý nhiệt và DDT với lượng mẫu cho
3.3.2. Tính đặc hiệu và hiệu giá ngưng kết vi khuẩn của IgY trong dịch kháng thể tinh sạch từ lòng đỏ trứng tinh sạch từ lòng đỏ trứng
3.3.2.1. Kết quả ngưng kết vi khuẩn Streptococcus iniae của IgY tinh sạch
Hiệu giá ngưng kết vi khuẩn S. iniae của kháng thể IgY tinh sạch được xác định ở nồng độ thấp nhất của IgY tinh sạch mà vẫn cho kết quả ngưng kết quan sát được.
Bảng 3.5. Kết quả ngưng kết của các nồng độ kháng thể Dịch pha loãng của IgY tinh sạch Mức độ ngưng kết
Kháng thể không pha loãng +++ 1/2 +++ 1/4 +++ 1/8 +++ 1/16 +++ 1/32 +++ 1/64 ++ 1/128 ++ 1/256 ++ 1/512 + 1/1024 - 1/2048 - 1/4096 -
Đối chứng 1 (IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng củaGà đối chứng)
-
Đối chứng 2 (PBS) -
Ngưng kết mạnh: +++, Ngưng kết yếu: +, Không có ngưng kết: -
Theo kết quả ngưng kết thu được ở Bảng 3.5, các mẫu đối chứng 1 và 2 đều cho kết quả âm tính, ở các mẫu dịch kháng thể IgY mức độ ngưng kết giảm dần theo sự giảm nồng độ kháng thể. Ở các mẫu kháng thể có nồng độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/16,
1/32 cho kết quả ngưng kết mạnh, các mẫu kháng thể pha loãng 1/64, 1/128, 1/256 và 1/512 cũng cho kết quả ngưng kết dương tính, trong khi các mẫu kháng thể pha loãng 1/1024, 1/2048, 1/4096 cho kết quả ngưng kết âm tính (giống mẫu đối chứng).
Như vậy, độ pha loãng dịch kháng thể 1/512 là hiệu giá ngưng kết vi khuẩn S. iniae của kháng thể IgY tinh sạch.
3.3.2.2. Kết quả ELISA
Tính đặc hiệu và nồng độ IgY trong dịch kháng thể tinh sạch từ lòng đỏ trứng được xác định bằng phương pháp ELISA. Từ kết quả hiệu giá ngưng kết vi khuẩn của IgY tinh sạch, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành kiểm tra dịch kháng ở các độ pha loãng 1/100, 1/1000 và 1/10000, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. Đối chứng âm gồm có: Đối chứng âm 1 là PBS, đối chứng âm 2 là vi khuẩn Vibrio sp. P1 (để khẳng định tính đặc hiệu của dịch IgY). Kết quả dương tính là các giếng chuyển từ không màu sang màu xanh lá cây (green), các mẫu không sang màu xanh lá cây là mẫu âm tính.
Hình 3.4. Kết quả ELISA ở các nồng độ pha loãng IgY. Các nhóm giếng A1 và B1, A2 và B2, A3 và B3 có nồng độ kháng thể pha loãng tương ứng là 1/100, 1/1000 và 1/10000; các giếng A4 và B4: đối chứng 2 (Vibrio sp. P1); cácgiếng A5 và B5: đối chứng
Theo kết quả trên Hình 3.4, các giếng đối chứng 1 và đối chứng 2 đều cho kết quả âm tính, các nồng độ kháng thể 1/100 (Giếng A1 và B1) và 1/1000 (Giếng A2 và B2) cho kết quả dương tính (có sự chuyển màu của dung dịch trong giếng từ không màu sang màu xanh lá cây), ở nồng độ pha loãng IgY 1/10000 cho kết quả âm tính (không có sự chuyển màu). Kết quả này khẳng định tính đặc hiệu của kháng thể IgY tinh sạch với vi khuẩn S. iniae. Tuy nhiên, do nguyên nhân khách quan chúng tôi không thực hiện được việc đọc kết quả ELISA trên máy, điều này có thể dẫn tới việc xác định nồng độ kháng thể cho kết quả dương tính chưa chính xác (không phát hiện được sự chuyển màu bằng mắt thường ở nồng độ pha loãng 1/10000). Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành kiểm tra thêm bằng phương pháp Dot blot (phương pháp dựa trên nguyên tắc của ELISA nhưng đọc kết quả bằng mắt) để khẳng định.
3.3.2.3. Kết quả Dot Blot
Bố trí thí nghiệm của phương pháp Dot Blot cũng được thực hiện tương tự phương pháp ELISA. Các màng có màu xanh tím (cơ chất DAB) xuất hiện tại vòng tròn nhỏ dịch vi khuẩn ở trung tâm cho phản ứng dương tính, các màng không có sự chuyển màu sang màu xanh tím ở vòng tròn nhỏ trung tâm cho phản ứng âm tính. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.6.
Kết quả thu được tương tự như kết quả ELISA, ở các nồng độ kháng thể pha loãng 1/100, 1/1000 trên màng Nitrocellulose có sự thay đổi màu sang màu xanh tím, trong khi ở nồng độ kháng thể pha loãng 1/10000 và các mẫu đối chứng đều cho kết quả âm tính (không có sự chuyển màu sang màu xanh tím).
Bảng 3.6. Kết quả Dot Blot ở các nồng độ kháng thể pha loãng khác nhau Nồngđộ IgY Lần Đối chứng 1 (PBS) Đối chứng 2 (Vi khuẩn Vibrio sp. P1) Các nồng độ kháng thể pha loãng 1/100 1/1000 1/10000 1 2 3
Như vậy, kết quả Dot-blot và kết quả ELISA là giống nhau: ở nồng độ kháng thể IgY thấp nhất 1/1000 vẫn phát hiện được sự hiện diện của S. iniae. Điều này chứng tỏ việc xác định lượng kháng thể đặc hiệu bằng phương pháp ELISA và Dot-blot cho kết quả nhạy hơn so với phương pháp ngưng kết (1/512).
3.4. Kết quả xác định khả năng ức chế Streptococcus iniae của IgY tinh sạch
Sau khi cho dịch protein có chứa kháng thể IgY tinh sạch vào môi trường có vi khuẩn Streptococcus iniae (khoảng 107 CFU/ml) để đạt nồng độ cuối là 50 µg/ml, 100
µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml, 250 µg/ml, mẫuđối chứng sử dụng dịch IgY tinh sạch từ gà đối chứngcho vào đạt nồng độ 250 µg/ml. Sau đó kiểm tra số lượng vi khuẩn theo thời gian (0h, 3h, 6h, 9h) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ta thu được đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa số lượng CFU và thời gian (Hình 3.5).
Hình 3.5. Đường cong ức chế sinh trưởng của S. iniae
Các mẫu có nồng độ kháng thể IgY 50 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml không cho thấy sự ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn S. iniae rõ ràng so với đối chứng sử dụng IgY không đặc hiệu (Hình 3.5). Ở nồng độ kháng thể IgY 250 µg/ml sự ức chế sinh trưởng vi khuẩn cho thấy rõ ràng nhất: từ 0 - 3h không có sự ức chế sinh trưởng rõ ràng thể hiện qua số lượng vi khuẩn vẫn phát triển nhẹ tương tự với 5 mẫu còn lại, từ 3 - 6h có sự khác biệt lớn về số lượng vi khuẩn (thấp hơn rất nhiều) của mẫu IgY có nồng độ 250 µg/ml với các mẫu còn lại, sự ức chế vẫn hiệu quả cho đến 9h. Sự ức chế này có thể được giải thích do sự gắn của kháng thể đặc hiệu IgY vào các thành phần nằm ở bề mặt tế bào có thể làm thay đổi cấu trúc của vi khuẩn.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
Gà đáp ứng miễn dịch tốt và cho hiệu quả kinh tế với nồng độ kháng nguyên
Streptococcus iniae VN091211R là 1,5x104 CFU/con/lần tiêm. Việc tiêm kháng nguyên lặp lại sau hai tuần kể từ lần tiêm trước và chỉ dừng khi không tiến hành sản xuất IgY.
Phương pháp tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà theo quy trình tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp Polson cho độ tinh sạch cao nhất.
Kháng thể tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà có một sốđặc điểm: có khối lượng phân tử trong khoảng 170 – 190 kDa, đặc hiệu với vi khuẩn Streptococcus iniae
VN091211R ,có hiệu giá1/1000. Ức chế sinh trưởng vi khuẩn Streptococcus iniae
VN091211R ở nồng độ kháng thểở 250 µg/ml
4.2. Đề nghị
Cần tiến hành tối ưu các điều kiện tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng để thu nhận được lượng kháng thể IgY lớn với độ tinh sạch cao.
Cần xác định các yếu tố trong quá trình tinh sạch và bảo quản gây ảnh hưởng đến hoạt lực của kháng thể IgY.
Cần xác định protein đặc trưng trên màng vi khuẩn Streptococcus iniae
VN091211R là kháng nguyên đóng vai trò kích thích miễn dịch để thu được IgY có tính đặc hiệu hơn.
Nghiên cứu ứng dụng IgY vào trong điều trị và chẩn đoán bệnh do
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1998), Hóa sinh học, Nhà xuất bản giáo dục. 2. Huỳnh Đình Chiến (2001), Giáo trình miễn dịch học, Bộ môn kỹ thuật y học, Đại học Y Dược Huế.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục.
4. Lê Văn Đông, Dương Hương Giang và các cộng sự (2011), “Nghiên cứu chế tạo kháng thể từ lòng đỏ trứng IgY kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá tra”, Tạp chí y dược học quân sự số 1.
5. Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Lê Phúc Chiến, Nguyễn Trọng Bình, “Kháng thể lòng đỏ trứng ứng dụng trong chuẩn đoán và điều trị bệnh nhiễm trùng”, Báo cáo hội nghị hóa sinh tháng 10/2008, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
6. Văn Thị Hạnh, Trần Phú Trị, Nguyễn Tấn Thịnh, Nguyễn Thị Thùy Trang, Lê Phúc Chiến (2009), “Tạo kháng thể lòng đỏ trứng kháng virus gây bệnh đốm trắng và khả năng ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh virus ở tôm”, Báo cáo hội nghị công nghệ sinh học miền nam, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM.
7. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại và các cộng sự (2010) “Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá tra bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà”, Tạp chí Thông tin y dược, Chuyên đề Miễn dịch học, tr.71-76.
Tiếng Anh
8. Akita E. M., Nakai. S (1992), “Immunoglobulins from egg yolk: Isolation and Purification, Journal of Food Science”, Vol. 57(3), pp. 629-634.
9. Akita E. M., Nakai. S (1993), “Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an
enterotoxigenic E. coli strain”, Journal of Immunological Methods, Vol. 160, pp. 207- 214.
10. Annette T., Francoise B., Stéphanie F., Denis V. (2002), Understanding salt or PEG induced attractive interactions to crystallize biological macromolecules, Acta Cryst., Vol. 58, pp. 1549-1553.
11. Antonio V., Giancarlo B., Giorgio F. (2000), “Affinity purification of immunoglobulins from egg yolk using a new synthetic ligand”, Journal of Chromatography B, Vol. 749, pp. 233-242.
12. Bizhanov. G, Jonauskiene. I, Hau. J (2004), “A novel method, based on lithium sulfate precipitation for purification of chicken egg yolk immunoglobulin Y, applied to immunospecific antibodies against Sedai virus”, Scand. J. Lab.Anim. Sci, Vol. 31(3). 13. Carlander D. (2002), Avian IgY Antibody In vitro and in vivo, Dissertation for the Degree of Doctor of Philosophy (Faculty of Medicine) in Clinical Chemistry presented at Uppsala University.
14. Christopher R. B., Robin T., Purification of immunoglobulin Y (IgY) from chicken eggs, The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition (edited by: J.M.Walker), Humana Press Inc, Totowa, NJ.
15. Clark A., Befus B., Pamela O.H., Fred H., Michael S., Andrew F., Gilly G. (2002),