a. Nguyên lý
Dựa vào cấu trúc cuộn xoắn càng phức tạp và gấp nếp của phân tử PEG càng nhiều thì nước sẽ bị giữ nhiều hơn. Điều này giải thích cho hiện tượng hệ số kết lắng của PEG tăng khi khối lượng phân tử tăng.
PEG có khối lượng phân tử nhỏ hơn 1500 Da hầu như không có khả năng kết tủa trong suốt quá trình ly tâm, chứng tỏ rằng nó ít có khả năng giữ nước bên trong.
Thực tế cho thấy, PEG có khối lượng phân tử lớn hơn hay bằng 6000 Da có khả năng kết tủa gần như nhau và tốt nhất. Còn PEG có khối lượng thấp hơn 6000 Da thì khả năng kết tủa lại kém hơn rất nhiều. Ngoài ra, nồng độ PEG cũng ảnh hưởng rất lớn đế khả năng kết tủa. Khi tăng nồng độ polymer thì sự gấp khúc của PEG sẽ tăng thêm và khả năng kết tủa cũng tăng lên.
Hình 2.4. Mô hình của PEG với các khối lượng phân tử khác nhau 1500, 6000 và 20000 Da trong dung dịch nước [26]
Phương pháp Polson dựa trên việc kết tủa phân đoạn với hai nồng độ PEG khác nhau. Đầu tiên, lòng đỏ trứng gà được xử lý với PEG tại nồng độ 3,5%. Ở nồng độ này, các lipoprotein và các lipid có trọng lượng lớn trong lòng đỏ sẽ kết tủa, nên giúp loại bỏ phần protein hòa tan trong lòng đỏ trứng khỏi phần lipid và lipoprotein không hòa tan. Tiếp theo, dịch chứa protein hòa tan sẽ được tiếp tục xử lý với PEG tại nồng độ 12%. Ở nồng độ này, các protein có khối lượng nằm trong khoảng thích hợp, bao gồm IgY được kết tủa. Do đó, IgY được tinh sạch và tách khỏi các protein hòa tan khác. Phương pháp Polson có một số ưu điểm [19]:
Hiệu quả cao: cho phép thu nhận được 90% IgY tinh khiết và thu nhận 60 mg của protein phân lập trong mỗi quả trứng
Nhanh chóng: qui trình polyethylene glycol không đòi hỏi bước thẩm tách và vì vậy có thể hoàn thành trong 3h
Đơn giản: Không cần đòi hỏi thiết bị, máy móc phức tạp Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số khuyếtđiểm :
Khó có thểứng dụng trên qui mô lớn Tỉ lệ thu nhận IgY thấp
b. Tiến hành
Tách lòng đỏ
Trứng gà được rửa sạch, tráng bằng nước cất trước khi tiến hành tinh sạch. Khu vực tách chiết cần được vệ sinh sạch sẽ và lau với cồn 700. Tiến hành bổđôi quả trứng, loại bỏ lòng trắng một cách nhẹnhàng để không làm rách màng lòng đỏ. Lòng đỏ trứng được rửa bằng PBS nhiều lần để loại tối đa albumin. Cần loại tối đa đệm PBS ra khỏi lòng đỏ trứng sau mỗi lần rửa.
Chọc thủng màng và tách màng khỏi lòng đỏ. Thu dịch lòng đỏ thu được và mang bảo quản lạnh ở -10oC cho đến khi tiến hành tinh sạch.
Quy trình tinh sạch
Bước 1: Dùng tỉ lệ 2 ml lòng đỏvà 1 ml đệm PBS 0,01 M, pH = 7,2, thêm 3 ml dung dịch PEG 7%. Hỗn hợp được khuấy cho đến khi toàn bộ polymer được hòa tan. Ly tâm 14000 ×g trong 10 phút ở 4oC.
Bước 2: Dịch nổi được lọc qua giấy lọc để loại lipid. PEG dạng bột được cho vào tới nồng độ 12% (w/v). Hỗn hợp được khuấy cho đến khi toàn bộ polymer được hòa tan.
Bước 3: Ly tâm dung dịch ở 14000 ×g trong 5 phút tại 4oC. Cặn chứa IgY được hòa lại trong 2 ml đệm phosphate và được trộn với 2 ml của dung dịch PEG 24% trong đệm cho lần kết tủa thứ hai. Vortex hỗn hợp cho đến khi tan hoàn toàn. Ly tâm 14000 ×g trong 10 phút, tại 4oC. Cặn sau ly tâm được hòa lại trong 1 ml đệm. Kháng thể sau khi tinh sạch được bảo quản lạnh ở -20oC cho đến khi dùng.