Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tạo kháng thể IgY trong điều trị và chẩn đoán nhưng chủ yếu là các bệnh ở ngườivà động vật hữu nhũ [22], [32], [34]. Nhưng ứng dụng vào ngành nuôi trồng thủy sản chưa được phổ biến, mới chỉ có các nghiên cứu tạo kháng thể IgY kháng lại các bệnh do virus gây bệnh trên tôm và mới đây có nghiên cứu tạo kháng thể kháng Streptococcus mutan của Rajan (2011) và các cộng sự [5], [34]. Chưa có nhiều sản phẩm IgY dùng trong điều trị và chẩn đoán bệnh cho động vật thủy sản.Việc chẩn đoán hiện nay vẫn chủ yếu dùng kháng thể từ huyết thanh động vật hữu nhũ.
Tại Việt Nam mới chỉ có vài nghiên cứu tạo kháng thể IgY [4], [5], [6], nhưng vẫn chưa có ứng dụng vào điều trị và chẩn đoán bệnh phổ biến.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành và phòng thí nghiệm của Viện Công nghệsinh và Môi trường, trường Đại học Nha Trang.
Thời gian tiến hành nghiên cứu từngày 01/03/2013 đến ngày 28/06/2013.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Chủng vi khuẩn
Hai chủng vi khuẩn Streptococcus iniae VN091211R (phân lập từ cá chẽm) và
Vibrio sp. P1 (phân lập từ cá chẽm) sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ bộ sưu tập vi khuẩn của Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản.
2.2.2. Gà mái
7 con gà mái đẻ 20 tuần tuổi thuộc giống gà ISA-Brown. Đây là một giống gà siêu trứng nên cho năng suất trứng rất cao (300-310 trứng/năm). Gà mua về được nuôi trong chuồng có mái che, có dụng cụ chứa thức ăn, nước uống sạch sẽ. Chuồng được chia làm ba ngăn, xung quanh được che chắn cẩn thận bằng vải bạt để tránh gió lùa hay mưa. Chuồng được đặt ở nơi cao ráo, thoáng mát và thuận tiện cho việc chăm sóc. Để đảm bảo sức khỏe tốt nhất cho gà cần bổ sung thức ăn, thay nước sạch và làm vệ sinh chuồng gà hàng ngày. Gà được nuôi bằng thức ăn hỗn hợp dành cho gà đẻ trứng.
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất chuyên dụng
Hóa chất: Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O2, NaCl, KCl, KH2PO4, (NH4)2SO4, acid acetic, ethanol, methanol, tá dược FCA (Freund’s complete adjuvant), tá dược FIA (Freund’s incomplete adjuvant), PEG 6000, Tween 20, SDS tinh khiết của hãng Merck, các hóa chất điện di của hãng Bio-Rad, thuốc thử Bradford CCB G 250, TMB/H2O2, H2SO4, ABTS, DAB, casein, skimed milk, kháng thể thứ cấp gắn enzyme perosidase, acid citric…
Thiết bị chuyên dụng: Thiết bị đo quang phổ UV-VIS (CARY 100), thiết bị ly tâm lạnh thể tích nhỏ (Mega 17R), thiết bị điện di protein của hãng Bio-Rad (Mini PROTEAN® Tetra Cell), máy vortex, bể ổn nhiệt…
Dụng cụ: pipet, micropipette, đầu tuýp các loại, ống nghiệm, eppendorff, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, đèn cồn...
2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu được trình bày trong Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Khảo sát đáp ứng miễn dịch trên gà với
3 liều kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt (1,5×104, 1,5×106, 1,5×108 CFU)
Khảo sát 3phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng (IgY)
(Polson, Polson có hiệu chỉnh và acid hóa)
Kiểm tra tính đặc hiệu và hiệu giá kháng thể của
IgY với S. iniae
Xác định trọng lượng phân tử của IgY
Xác định một số đặc điểm của IgY
Kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của vi
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp gây miễn dịch trên gà
2.4.1.1. Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt (vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt)
Vi khuẩn Streptococcus iniae được nuôi cấy qua đêm trong môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) bổ sung 1,5% muối ở 370C trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút. Cho formalin 40% vào dịch vi khuẩn đã nuôi qua đêm sao cho đạt nồng độ 0,5% , ủ qua đêm ở 40C để bất hoạt vi khuẩn. Sau đó ly tâm 7000 vòng trong 20 phút ở 40C, thu cặn. Cặn được hòa lại trong PBS bằng thể tích ban đầu và tiếp tục ly tâm ở 7000 vòng trong 20 phút ở 40C, thu cặn. Lặp lại bước này một lần nữa, cặn được hòa trong 1ml PBS. Pha loãng dịch vi khuẩn bằng dung dịch PBS để đạt các nồng độ vi khuẩn (3×104), (3×106) và (3×108) CFU/ml, bảo quản ở 40C.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát đáp ứng miễn dịch của gà với 3 liều lượng kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt: T1 (1,5×104), T2 (1,5×106) và T3 (1,5×108) CFU nhằm xác định liều kháng nguyên hiệu quả nhất trong sản xuất IgY.
Thực hiện gây miễn dịch 6 con gà mái được chia thành ba nhóm (2 con/nhóm). Ngoài ra, còn 2 con gà đối chứng (kí hiệu X)được miễn dịch với 1 ml dung dịch PBS.
Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà mái ở 2 lần tiêm đầu
Nhóm Nhóm 1 (X) Nhóm 2 T1 Nhóm 3 T2 Nhóm 4 T3
Số con gà/nhóm 2 con 2 con 2 con 2 con
Nồng độ vi khuẩn 0 3×104 3×106 3×108
Thể tích kháng nguyên/con 0 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
2.4.1.2. Tiến hành gây miễn dịch trên gà
Gà được tiêm dưới da vào hai cánh tại bốn điểm (mỗi bên trái hay phải tiêm hai phát). Kháng nguyên được chuẩn bị như ở Bảng 2.3. Phối trộn đều 0,5 ml dung dịch vi khuẩn bất hoạt ở các nồng độ kháng nguyên phù hợp với 0,5 ml tá dược. Hỗn hợp được vortex kĩ cho đến khi thu được 1 ml dung dịch nhũ hóa hoàn toàn ở dạng sữa, bảo quản ở 40C.
Tiêm mũi nguyên phát bắt đầu vào ngày 0, mỗi con gà được miễn dịch với 0,5 ml dung dịch vi khuẩn được nhũ hóa trong 0,5 ml tá dược Freund hoàn toàn (FCA). Các mũi tiêm nhắc lại sử dụng tá dược Freund không hoàn toàn (FIA) ở ngày thứ 21, không sử dụng tá dược ở ngày 35 sau khi tiêm mũi đầu tiên.
Tất cả các con gà được miễn dịch đều được lấy máu tĩnh mạch sau mỗi lần tiêm để kiểm tra IgY đặc hiệu trong huyết thanh bằng phương pháp ELISA.
Trứng của các con gà có IgY đặc hiệu trong huyết thanh sẽ được thu nhận hằng ngày để theo dõi sự thay đổi nồng độ IgY theo thời gian. Trứng gà được thu ngay sau khi tiêm và kéo dài trong suốt 10 tuần. Trứng được dự trữ tại 4oC cho đến khi tiến hành tách chiết.
2.4.2. Phương pháp Bradford a. Nguyên lý a. Nguyên lý
Dựa vào phản ứng màu của protein với Coomassie Brilliant Blue G250, trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh dương và thay đổi bước sóng hấp thu cực đại từ 465 nm của thuốc nhuộm sang 595 nm của phức hợp thuốc nhuộm - protein. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm cũng như cường độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch [31].
b. Tiến hành
Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin)
100µg/ml theo Bảng 2.2
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dung dịch BSA (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nước cất (µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hút 1000 μl dung dịch protein vừa pha loãng theo bảng trên, thêm vào 5000 μl thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (μg/ml). Tại mỗi nồng độ tiến hành đo 3 lần, sau đó xác định giá trị OD trung bình.
Đo nồng độ protein các mẫu
Pha loãng mẫu đến nồng độ phù hợp để cho ∆ODmẫu. Ởđây, tiến hành pha loãng mẫu 1/75 lần.
Hút 900 μl dung dịch protein cần phân tích đã pha loãng, thêm vào 4500 μl thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Thực hiện ba lần đối với mỗi mẫu, lấy giá trị OD trung bình và tính ΔOD. Từđường chuẩn suy ra nồng độ protein mẫu cần phân tích.
Tính kết quả nồng độ protein theo công thức sau:
Nồng độ mẫu = nồng độtính toán × độ pha loãng
2.4.3. Phương pháp SDS - PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS - PAGE) là phương pháp được Shapiro và cộng sự giới thiệu năm 1967, kể từ đó nó trở thành một
phương pháp được sử dụng rộng nhất để phân tích hỗn hợp protein. Phương pháp này điện di protein đứng để phân tách các thành phần protein theo trọng lượng phân tử [31].
a. Nguyên lý
Phương pháp diện di SDS-PAGE dựa trên cơ sở các phân tử tích điện âm, khi ở trong điện trường sẽ dịch chuyển về phía anode. Tốc độ dịch chuyển của chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử: các phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm và ngược lại. Kết quả là từ một điểm chung (giếng tải mẫu) các phân tử protein khác nhau trên cùng một làn (lane) sẽ dịch chuyển về một hướng và phân bố ở các vị trí (các band) khác nhau tương ứng với trọng lượng phân tử của chúng.
Protein bị biến tính bởi nhiệt độ với sự hiện diện của SDS (sodium dodecyl sulfate). SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide, làm biến tính protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, làm cho các phân tử protein trở thành dạng que (Hình 2.2).
Hình 2.2. Mô tả hiện tượng biến tính của protein khi ủ với SDS
SDS có thể phá vỡ các vùng kỵ nước bằng cách phá vỡ các liên kết cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của protein, làm các phân tử protein duỗi thẳng mạch, đồng thời SDS liên kết với mạch chính protein làm cho các phân tử này trở nên tích điện âm.
Sự phân tách các phân tử protein trên gel phụ thuộc vào nồng độ gel acrylamide được sử dụng. Nồng độ gel được sử dụng là từ 7,5% - 15%. Nồng độ gel càng cao thì phân tách được các loại protein có phân bố phân tử lượng càng nhỏ.
Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và bisacrylamide. Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học. Có hai tác nhân hóa học cần thiết, đó là ammonium persulfate làm vai trò peroxide khởi động (initiator peroxidase) và quanternary amine N.N.N’.N’- tetramethylene diamine (TEMED) làm vai trò chất xúc tác. Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động và TEMED làm tác nhân xúc tác. Quá trình hình thành gel có sinh nhiệt, do vậy cần phải tối ưu nồng độ tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình này hoàn tất không quá nhanh (trong vòng 20 đến 60 phút).
Có hai hệ thống điện di, hệ thống đệm liên tục và hệ thống đệm không liên tục. Trong đó, hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần so với hệ thống đệm liên tục. Vì vậy, hiện nay SDS-PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (1970), cải tiến từ hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964) [31].
Trong hệ thống đệm không liên tục, gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp (Hình 2.3). Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp Stacking gel. Lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là Running gel. Hai lớp gel này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH. Dung dịch điện di cũng được pha bằng một dung dịch đệm khác, gọi là Tank buffer. Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp Stacking gel. Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp
Running gel. Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong Running gel.
Hình 2.3. Mô hình gel điện di (SDS-PAGE) b. Tiến hành
Đổ gel
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ hóa chất.
Bước 2: Lau các tấm kính bằng nước cất, gắn vào giá đỡ.
Bước 3: Pha dung dịch Separating gel (1mm; 12%) thành phần như Bảng 2.3, vortex khoảng 1 – 2 phút, dùng micropipette 1000 µl đổ nhanh vào giữa hai tấm kính đã chuẩn bị sẵn lên đến hơn 3/4 độ cao tấm kính, cho nhanh nước cất vô trùng vào bên trên gel để khoảng 60 phút.
Bước 4: Pha dung dịch Stacking gel (1mm; 5% ) thành phần như Bảng 2.3, vortex khoảng 1 phút, đổ nhanh vào giữa hai tấm kính bên trên Separating gel cho hết độ cao tấm kính, cẩn thận đặt lược vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí, để 30 - 60 phút cho gel đông rồi rút lược ra.
Bảng 2.3. Thành phần và các dung dịch điện di protein Thành phần Nồng độ Gel cô 5% (Stacking gel) Gel tách 12% (Separating gel) Monomer Solution 40% 1,3 ml 3 ml
4X Runing gel Buffer (pH 8.8) 1,5M - 2,5 ml
4X Stacking gel Buffer (pH 6.8) 0,5M 2,5 ml -
SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml Nước cất 6,2 ml 4,4 ml APS 10% 50 µl 50 µl TEMED 10 µl 5 µl Tổng thể tích 10,16 ml 10,055 ml Chuẩn bị mẫu
Lượng mẫu thích hợp để tải vào mỗi giếng gel trong SDS-PAGE là 5 - 10 μg/giếng. Có thể pha loãng một ít mẫu với nước cất đểđạt nồng độ tối ưu.
Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với một thể tích (V) 2X Treatment buffer. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi để trong 5 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữtrong đá bào cho đến khi thực hiện thí nghiệm.
Dùng micropipette 1 - 10 µl, hút trộn đều mẫu và tải mẫu từ từ vào giếng gel. Tránh tải mẫu quá nhanh gây xáo trộn mẫu trong dung dịch đệm (Tank buffer 1X) và tránh không cho mẫu lan ra các giếng khác. Luôn luôn chừa một giếng để tải protein thang chuẩn.
Chạy điện di
Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm Tank Buffer.
Dùng micropipette load mẫu vào các giếng, cẩn thận không để mẫu tràn ra ngoài. Chạy điện di ở cường độ 15 mA trong khoảng 1,5 – 2 giờ cho đến khi vạch màu đến gần đáy của gel.
Nhuộm và rửa gel
Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch Standard Staining R250, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng 4 giờ, tốt nhất là nên nhuộm qua đêm.
Rửa gel bằng dung dịch Destaining Solution trên máy lắc nhẹ, khoảng 30 phút thay dung dịch rửa một lần cho đến khi hoàn thành.
2.4.4. Phương pháp tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà
Trứng gà sau khi thu và bảo quản, được đem đi tách chiết và tinh sạch theo 3 phương pháp: phương pháp Polson, phương pháp Polson có hiệu chỉnh và phương pháp acid hóa, để xác định quy trình tinh sạch hiệu quả nhất ứng dụng trong sản xuất IgY tinh sạch.
2.4.4.1. Tách chiết và tinh sạch theo phương pháp Polson a. Nguyên lý a. Nguyên lý
Dựa vào cấu trúc cuộn xoắn càng phức tạp và gấp nếp của phân tử PEG càng nhiều thì nước sẽ bị giữ nhiều hơn. Điều này giải thích cho hiện tượng hệ số kết lắng của PEG tăng khi khối lượng phân tử tăng.
PEG có khối lượng phân tử nhỏ hơn 1500 Da hầu như không có khả năng kết tủa trong suốt quá trình ly tâm, chứng tỏ rằng nó ít có khả năng giữ nước bên trong.
Thực tế cho thấy, PEG có khối lượng phân tử lớn hơn hay bằng 6000 Da có khả năng kết tủa gần như nhau và tốt nhất. Còn PEG có khối lượng thấp hơn 6000 Da thì khả năng kết tủa lại kém hơn rất nhiều. Ngoài ra, nồng độ PEG cũng ảnh hưởng rất lớn đế khả năng kết tủa. Khi tăng nồng độ polymer thì sự gấp khúc của PEG sẽ tăng thêm và khả năng kết tủa cũng tăng lên.
Hình 2.4. Mô hình của PEG với các khối lượng phân tử khác nhau 1500, 6000 và 20000 Da trong dung dịch nước [26]
Phương pháp Polson dựa trên việc kết tủa phân đoạn với hai nồng độ PEG khác nhau. Đầu tiên, lòng đỏ trứng gà được xử lý với PEG tại nồng độ 3,5%. Ở nồng độ này,