1.3.1. Thu nhận lòng đỏ trứng gà
Trứng thu nhận được từ gà gây tạo miễn dịch nên được tiến hành tách bỏ vỏ. Lòng đỏ trứng được tách khỏi lòng trắng, nên được rửa với nước và đệm để loại bỏ albumin còn sót lại rồi mới phá vỡ màng bên ngoài và thu nhận lòng đỏ. Lòng đỏ thu nhận nếu chưa tiến hành tinh sạch ngay thì nên bảo quản tại 4oC. Việc phân lập lòng đỏ khỏi lòng trắng có thể tiến hành thủ công bằng tay hay tự động hóa [37].
1.3.2. Tinh sạch IgY
Lòng đỏ trứng gà còn gọi là dung dịch nhũ hóa của protein và lipid, bao gồm 48% nước, 34% lipid, 17% protein. Vì vậy, một trong những trở ngại chính trong phân lập IgY từ lòng đỏ là nồng độ cao của lipid và lipoprotein. Trong lòng đỏ, IgY là protein tan trong nước trong khi lipid lại xuất hiện dưới dạng là lipoprotein, kết hợp với protein. Vì lý do này, tinh sạch IgY thường bao gồm hai bước: bước đầu tiên là tách phần protein tan trong nước (chứa IgY) và lipoprotein trong lòng đỏ, bước thứ hai là phân tách IgY khỏi phần protein tan trong nước.
1.3.2.1. Các phương pháp phân tách protein tan trong nước (chứa IgY) và lipid
Một vài chất gum tự nhiên (carrageenan, xanthan gum) được thấy là hiệu quả trong loại bỏ lipoprotein ở lòng đỏ dưới dạng kết tủa. Khi sử dụng λ - carrageena thì thành phần lipid trong dịch nổi bề mặt sau khi loại bỏ kết quả kết tủa ít hơn 0,4% so với lòng đỏ [17].
Bảng 1.5. Thành phần lipid và protein trong dịch nổi khi sử dụng các loại gum khác nhau [17]
Gum tự nhiên thêm vàoa Lipid còn lại (%) Protein còn lại (%)
Kiểm chứng Agar κ-Carrageenan ι-Carrageenan λ-Carrageenan Furcellaran Locust bean gum Guar gum Tamarind gum Arabic gum Karaya gum Xanthan gum Sodium alginate 93,8 73,8 0,7 1,1 0,4 3,0 83,6 93,2 72,2 40,2 56,3 0,7 4,3 72,9 50,2 16,2 16,2 20,2 18,4 53,6 55,3 46,0 34,9 42,5 18,1 20,1 a nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp là 0,1%.
Lipid cũng có thể được loại bằng cách kết tủa với dextran sulfate, PEG 3,5% [14], [19]. Sau khi kết tủa, tiến hành ly tâm để thu dịch nổi chứa IgY.
Chloroform cho phép tách lòng đỏ trứng thành hai pha với phần dịch nổi chứa protein hòa tan bao gồm cả IgY, và phần dịch nhũ hóa của lipid và chloroform. Có thể tách hai pha này bằng cách ly tâm tốc độ thấp 1500g trong 30 phút [27].
Một hệ thống hai pha nước với phosphate và Triton X-100 để phân pha và tách hiệu quả protein hòa tan và lipid. Lipid được chiết tách vào pha ở phía trên giàu chất tẩy (Triton X - 100), trong khi đó IgY thì được chiết tách trong pha ở dưới giàu thành phần phosphate.
Akita và Nakai (1993) đề nghị phương pháp pha loãng nước dưới điều kiện acid để loại bỏ lipid và lipoprotein khỏi lòng đỏ trứng gà. Đây là quá trình kinh tế và hiệu quả cho việc nâng qui mô sản xuất IgY từ lòng đỏ trứng gà. Hiện nay có một số nghiên cứu vẫn sử dụng phương pháp này để tách chiết kháng thể [22]. Phương pháp này có nhược điểm là cho nồng độ kháng thể thấp, nhưng thể tích dịch thu được rất cao, do đó thường có bước tủa lại để cô đặc kháng thể.
Acid caprylic nồng độ 6% (v/v) cũng được chứng minh là có khả năng tách hiệu quả protein hòa tan khỏi lipid và lipoprotein.
1.3.2.2. Các phương pháp phân tách IgY khỏi phần protein tan trong nước
Có thể sử dụng những chất có khả năng gây kết tủa như muối ammonium sufate, sodium sulfate, lithium sufate và sodium citrate, kẽm sulphate hay cadmium sulphate., PEG 12%, ethanol [8], [12], [14].
Các phương pháp sắc kí (sắc kí trao đổi, sắc kí lọc gel, hay sắc kí ái lực) được sử dụng để thu được IgY có độ tinh sạch cao hơn. Tuy nhiên, phương pháp sắc kí có nhược điểm là khá đắt tiền. Tuy nhiên hiệu quả tách chiết của các phương pháp sắc kí co thể cho kháng thể IgY có độ tinh sạch hơn 90% [8], [17]. Vì chi phí tinh sạch theo phương pháp sắc kí tốn kém nên trong sản suất không ưu tiên sử dụng.
Kĩ thuật siêu lọc theo Kim (1998) cho phép tinh sạch IgY trong thời gian ngắn và hiệu quả cao. Tùy hệ thống lọc sử dụng, độ tinh sạch khoảng 72 - 99%.
Kĩ thuật Gradiflow cũng cho phép tinh sạch IgY với hiệu suất và độ tinh sạch cao. Gradiflow là một dụng cụ điện chuyển có thể tinh sạch một protein đích dựa sự tích điện của nó và khối lượng phân tử.Phương pháp này dựa trên sử dụng đệm pH đặc biệt trong liên kết với ba màng polyacrylamide có kích thước lỗ phù hợp để hạn chế sự di chuyển protein. Dụng cụ này được ứng dụng đặc biệt cho kháng thể lòng đỏ trứng vì khối lượng phân tử cao và dãy đẳng điện (pI) phân biệt. Kích thước phân tử của IgY là 180.000 Da và nó có dãy pI là 6,5 -7,5.
Trong thực tế, tùy vào yêu cầu và điều kiện phòng thí nghiệm mà có thể sử dụng một phương pháp riêng lẻ, hay phối hợp các phương pháp này lại để tinh sạch kháng thể có hiệu quả nhất.
1.3.3. Bảo quản IgY
Lòng đỏ trứng chứa kháng thể thu nhận được có thể bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Phương pháp sử dụng hóa chất: Natri azide (NaN3) có thể được sử dụng để bảo quản kháng thể vì nó có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ sử dụng phù hợp là khoảng 0,1% (w/v) [29]. Nồng độ sucrose, maltose, glycerol hay glycin 2% thể hiện hoạt tính bảo vệ chống lại việc phân hủy bởi nhiệt của IgY. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Jaradat và Marquardt (2000) thì Trehalose là chất bảo vệ tốt nhất, theo sau là cyclodextrin khi IgY được trữ tại 6 hay 14 tuần tại các nhiệt độ khác nhau. Sucrose, lactose và dextran không có hiệu quả là chất bảo vệ dưới điều kiện này. Bột lòng đỏ làm khô lạnh với 5% gum arabic thể hiện sự ổn định tốt hơn chống lại protease [37].
Phương pháp đông lạnh và sấy thăng hoa: Đông lạnh và sấy thăng hóa tại nhiệt độ thấp thường được xem xét là ít gây biến tính. Một số nghiên cứu đã báo cáo về ảnh hưởng của phương pháp sấy thăng hoa đến sự ổn định của IgY. Shimizu và cộng sự (1988) cho rằng sấy thăng hoa và làm lạnh không làm ảnh hưởng IgY trừ khi lặp lại vài lần. Tuy nhiên, Chansarkar (1998) thể hiện rằng phương pháp đông lạnh hay sấy thăng hoa IgY dẫn đến giảm hoạt tính gắn kết kháng nguyên và giảm độ hòa tan dưới điều kiện nồng độ muối và protein cao. Sunwoo (2002) cũng báo cáo những kết quả tương tự. Gần đây, Fu và cộng sự (2006) thử nghiệm độổn định nhiệt độ của IgY tại nhiệt độ khác nhau trong khoảng 25 và 90oC trong 15 phút xử lý, trước và sau khi dùng phương pháp sấy thăng hoa. Kết quả của họ chỉ ra rằng IgY sấy thăng hoa thể hiện sựổn định nhiệt tốt mà không làm giảm hiệu quả trong hoạt tính phản ứng trừ khi nhiệt độđạt đến 90oC [29].
Phương pháp sấy phun: Yokoyama (1992) đã phân tính một số đặc tính của bột IgY thu được từ phương pháp sấy phun và sấy thăng hoa phần hòa tan trong nước của lòng đỏ trứng gà (chứa IgY) từ gà miễn dịch với Escherichia coli. Khi so sánh với bột sấy thăng hoa, bột sấy phun vẫn giữ được độ chuẩn của kháng thể, kể cả khi nhiệt độ sấy phun lên đến 140 đến 170oC. Tuy nhiên, phương pháp sấy phun có độ ẩm thành phần của bột cao hơn sấy thăng hoa [29].
1.4. Dịch bệnh do Streptococcus iniae gây ra
1.4.1. Tình hình dịch bệnh
Tình hình dịch bệnh do Streptococcus iniae là vi khuẩn hình cầu có đường kính lên đến 1,5 µm các tế bào thường ghép với nhau tạo chuỗi liên cầu khuẩn. Những liên cầu khuẩn này thuộc gram dương, không sinh bào tử, không di động. Khi nuôi cấy trên các môi trường tổng hợp như Tryptic Soy Agar (TSA), Brain Heart Infusion Agar (BHIA) hình thành các khuẩn lạc tròn nhỏ có đường kính 1 – 2 mm. Những loài cá khác nhau khi nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae có những dấu hiệu khác nhau, tuy nhiên đều xuất hiện một số dấu hiệu chung bao gồm: màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không bình thường. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá nói chung và trên cá chẽm nói riêng gây ra nhiều thiệt hại về kinh tế cho ngành nuôi trồng trên thế giới. Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn nước mặn và kết quả là làm cho cá chết với tỷ lệ cao lên đến 70% trong thời gian ngắn gây thiệt hại lớn cho người nuôi trên toàn thế giới [40].
Streptococcus iniae được tìm thấy vào năm 1976 bởi Pier và Madin từ đó nhiều đợt bùng phát dịch bệnh do Streptococcus iniae gây ra xuất hiện nhiều nơi trên thế giới. Năm 1970 và 1980 tại Nhật Bản năm 1970, 1980;Singapore, Israel và Đài Loan. Các báo cáo của Alicia E (2005), Bromage E.S (1999) và các cộng sự cũng cho thấy
Streptococcus iniae là tác nhân chính gây bệnh trên cá chẽm ở Australia với liều gây chết LD50 là 2,5 × 105 CFU/g trong 2 ngày và 3,2 × 104 CFU/g trong 10 ngày [38].
Ở Việt Nam trong những năm gần đây khi nghề nuôi tôm sú gặp khó khăn, người nuôi đã chuyển hướng nuôi mới là cá chẽm - một loài cá có giá trị kinh tế cao. Các vùng nuôi cá chẽm như huyện Cam Ranh, Vạn Ninh thuộc tỉnh Khánh Hòa; Hương Trà thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế; Hà Tĩnh; Đồng Nai; Bình Định; Cà Mau; Hậu Giang; Trà Vinh.... [39]. Tuy nhiên các vùng nuôi cá chẽm phát triển và mở rộng thì vấn đề dịch bệnh ở cá bắt đầu xuất hiện ngày càng nhiều, gây thiệt hại cho người nuôi. Trong đó bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra nhiều tổn thất cho nhà nuôi với tỉ lệ chết khi nhiễm bệnh có thể lên đến 70%, gây khó khăn cho nhiều vùng nuôi. Bên cạnh đó nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển mạnh và thành dịch trên diện rộng.
1.4.2. Các phương pháp điều trị do Streptococcus iniae hiện nay
Hiện nay các phương pháp điều trị chủ yếu tập trung vào việc sử dụng kháng sinh và các chất sát trùng đề loại bỏ mầm bệnh. Vi khuẩn Streptococcus iniae nhạy cảm với các kháng sinh như Norfloxacine, Ciproffloxacin, Sulphamethoxazol/ trimethoprim, Ampicillin, Erythromycin, Doxycycline và Amoxicyclin [18]. Việc sử dụng kháng sinh bị hạn chế do ngày càng có nhiều kháng sinh bị cấm sử dụng. Vậy nên việc sử dụng vaccine trong phòng và điều trị được tập trung hơn trước, tuy nhiên việc sản xuất vaccine để phòng và điều trị bệnh mới chỉ dùng cho những loài thủy sản có giá trị kinh tế cao, bên cạnh đó việc tiêm vaccine gây ra khó khăn như kĩ thuật tiêm, mất thời gian, gây strees cho vật nuôi... có nhiều biện pháp đưa ra để hạn chế những khó khăn trên như thay vì tiêm sẽ chuyển qua phương pháp ngâm hay miễn dịch qua đường ăn uống nhưng vẫn chưa đạt được hiêu quả như mong muốn.
Ở Việt Nam việc phòng trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất gần đây đã khiến cho việc xuất khẩu thủy sản gặp rất nhiều khó khăn do danh mục các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng. Việc sử dụng vaccine ở nước ta vẫn còn rất hạn chế, vì tính kinh tế không cao.
Vì các lý do trên, cần tìm ra phương pháp mới, hiệu quả hơn trong điều trị bệnh, do đó công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà ra đời. Đây là bước ngoặt lớn cho việc điều trị bệnh nói chung và ứng dụng trong ngành thủy sản nói riêng. Kháng thể IgY có nhiều điểm thuận lợi trong điều trị hơn kháng sinh: không gây ra hiện tượng kháng kháng sinh như hiện nay, sản phẩm thủy sản không tồn đọng kháng sinh. So với vaccine thì IgY không gây stress cho vật nuôi, có thể dùng cho phòng bệnh và điều trị khi dịch bệnh xảy ra.
1.4.3. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán và điều trị hiện nay
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tạo kháng thể IgY trong điều trị và chẩn đoán nhưng chủ yếu là các bệnh ở ngườivà động vật hữu nhũ [22], [32], [34]. Nhưng ứng dụng vào ngành nuôi trồng thủy sản chưa được phổ biến, mới chỉ có các nghiên cứu tạo kháng thể IgY kháng lại các bệnh do virus gây bệnh trên tôm và mới đây có nghiên cứu tạo kháng thể kháng Streptococcus mutan của Rajan (2011) và các cộng sự [5], [34]. Chưa có nhiều sản phẩm IgY dùng trong điều trị và chẩn đoán bệnh cho động vật thủy sản.Việc chẩn đoán hiện nay vẫn chủ yếu dùng kháng thể từ huyết thanh động vật hữu nhũ.
Tại Việt Nam mới chỉ có vài nghiên cứu tạo kháng thể IgY [4], [5], [6], nhưng vẫn chưa có ứng dụng vào điều trị và chẩn đoán bệnh phổ biến.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành và phòng thí nghiệm của Viện Công nghệsinh và Môi trường, trường Đại học Nha Trang.
Thời gian tiến hành nghiên cứu từngày 01/03/2013 đến ngày 28/06/2013.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Chủng vi khuẩn
Hai chủng vi khuẩn Streptococcus iniae VN091211R (phân lập từ cá chẽm) và
Vibrio sp. P1 (phân lập từ cá chẽm) sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ bộ sưu tập vi khuẩn của Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản.
2.2.2. Gà mái
7 con gà mái đẻ 20 tuần tuổi thuộc giống gà ISA-Brown. Đây là một giống gà siêu trứng nên cho năng suất trứng rất cao (300-310 trứng/năm). Gà mua về được nuôi trong chuồng có mái che, có dụng cụ chứa thức ăn, nước uống sạch sẽ. Chuồng được chia làm ba ngăn, xung quanh được che chắn cẩn thận bằng vải bạt để tránh gió lùa hay mưa. Chuồng được đặt ở nơi cao ráo, thoáng mát và thuận tiện cho việc chăm sóc. Để đảm bảo sức khỏe tốt nhất cho gà cần bổ sung thức ăn, thay nước sạch và làm vệ sinh chuồng gà hàng ngày. Gà được nuôi bằng thức ăn hỗn hợp dành cho gà đẻ trứng.
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất chuyên dụng
Hóa chất: Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O2, NaCl, KCl, KH2PO4, (NH4)2SO4, acid acetic, ethanol, methanol, tá dược FCA (Freund’s complete adjuvant), tá dược FIA (Freund’s incomplete adjuvant), PEG 6000, Tween 20, SDS tinh khiết của hãng Merck, các hóa chất điện di của hãng Bio-Rad, thuốc thử Bradford CCB G 250, TMB/H2O2, H2SO4, ABTS, DAB, casein, skimed milk, kháng thể thứ cấp gắn enzyme perosidase, acid citric…
Thiết bị chuyên dụng: Thiết bị đo quang phổ UV-VIS (CARY 100), thiết bị ly tâm lạnh thể tích nhỏ (Mega 17R), thiết bị điện di protein của hãng Bio-Rad (Mini PROTEAN® Tetra Cell), máy vortex, bể ổn nhiệt…
Dụng cụ: pipet, micropipette, đầu tuýp các loại, ống nghiệm, eppendorff, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, đèn cồn...
2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu được trình bày trong Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Khảo sát đáp ứng miễn dịch trên gà với
3 liều kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt (1,5×104, 1,5×106, 1,5×108 CFU)
Khảo sát 3phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng (IgY)
(Polson, Polson có hiệu chỉnh và acid hóa)
Kiểm tra tính đặc hiệu và hiệu giá kháng thể của
IgY với S. iniae
Xác định trọng lượng phân tử của IgY
Xác định một số đặc điểm của IgY
Kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của vi
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp gây miễn dịch trên gà
2.4.1.1. Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt (vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt)
Vi khuẩn Streptococcus iniae được nuôi cấy qua đêm trong môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) bổ sung 1,5% muối ở 370C trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút. Cho formalin 40% vào dịch vi khuẩn đã nuôi qua đêm sao cho đạt nồng độ 0,5% , ủ qua đêm ở 40C để bất hoạt vi khuẩn. Sau đó ly tâm 7000 vòng trong 20 phút ở 40C, thu cặn. Cặn được hòa lại trong PBS bằng thể tích ban đầu và tiếp tục ly tâm ở 7000 vòng trong 20 phút ở 40C, thu cặn. Lặp lại bước này một lần nữa, cặn được hòa trong 1ml