a. Nguyên lý
Dựa vào phản ứng màu của protein với Coomassie Brilliant Blue G250, trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm dung dịch có màu xanh dương và thay đổi bước sóng hấp thu cực đại từ 465 nm của thuốc nhuộm sang 595 nm của phức hợp thuốc nhuộm - protein. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm cũng như cường độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch [31].
b. Tiến hành
Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin)
100µg/ml theo Bảng 2.2
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dung dịch BSA (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Nước cất (µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hút 1000 μl dung dịch protein vừa pha loãng theo bảng trên, thêm vào 5000 μl thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (μg/ml). Tại mỗi nồng độ tiến hành đo 3 lần, sau đó xác định giá trị OD trung bình.
Đo nồng độ protein các mẫu
Pha loãng mẫu đến nồng độ phù hợp để cho ∆ODmẫu. Ởđây, tiến hành pha loãng mẫu 1/75 lần.
Hút 900 μl dung dịch protein cần phân tích đã pha loãng, thêm vào 4500 μl thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Thực hiện ba lần đối với mỗi mẫu, lấy giá trị OD trung bình và tính ΔOD. Từđường chuẩn suy ra nồng độ protein mẫu cần phân tích.
Tính kết quả nồng độ protein theo công thức sau:
Nồng độ mẫu = nồng độtính toán × độ pha loãng