Luận văn thạc sĩ Thú Y Vai trò của Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột và biện pháp phòng trị

Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược .... Kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược.. Bệnh xảy ra trên chó ở mọi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

VÕ QUỐC CƯỜNG

VAI TRÒ CỦA SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG

TIÊU CHẢY Ở CHÓ NUÔI TẠI THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SỸ THÚ Y

BUÔN MA THUỘT – 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

VÕ QUỐC CƯỜNG

VAI TRÒ CỦA SALMONELLA TRONG HỘI CHỨNG

TIÊU CHẢY Ở CHÓ NUÔI TẠI THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60 62 50

LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHÙNG QUỐC CHƯỚNG

BUÔN MA THUỘT – 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực Mọi trích dẫn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Các số liệu và kết quả của nghiên cứu này chưa ñược ai công bố và sử dụng ñể bảo vệ bất kỳ học vị nào

Ký tên

Võ Quốc Cường

LỜI CÁM ƠN

Tôi vô cùng biết ơn và tỏ lòng kính trọng sâu sắc ñến PGS TS Phùng Quốc Chướng - người thầy ñã tận tình, chu ñáo hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với sự ñộng viên, giúp ñỡ nhiệt tình của:

- Lãnh ñạo và cán bộ, công nhân viên chức Cơ quan Thú y vùng V

- Quý thầy, cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Tây Nguyên

Xin chân thành cám ơn tất cả bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi vượt qua khó khăn ñể hoàn thành nghiên cứu này

Buôn Ma Thuột, tháng 10 năm 2010

Tác giả

Võ Quốc Cường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC BIỂU xi

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 2

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Những nguyên nhân gây tiêu chảy ở chó 3

1.1.1 Điều kiện ngoại cảnh 3

1.1.2 Chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng 3

1.1.3 Do Stress 4

1.1.4 Nguyên nhân do ký sinh trùng 4

1.1.5 Do nấm mốc 4

1.1.6 Nguyên nhân do virus 5

1.1.7 Nguyên nhân do vi khuẩn 5

1.2 Vi khuẩn Salmonella 8

1.2.1 Hình thái 8

1.2.1 Đặc tính sinh vật học 9

1.2.3 Cấu trúc kháng nguyên 10

1.2.4 Yếu tố gây bệnh 12

1.3 Đặc ñiểm dịch tễ học của Salmonella 22

1.4 Cách sinh bệnh của Salmonella 23

1.5 Miễn dịch chống Salmonella 24

Chương 2- ĐỐI TƯỢNG-NỘI DUNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở ñàn chó nuôi trên ñịa

bàn thành phố Buôn Ma Thuột 26

2.2.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở ñàn chó nuôi trên ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột 26

2.2.3 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng tiêu chảy nuôi trên ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột 26

2.2.4 Xác ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng Salmonella phân lập ñược ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 26

2.2.5 Xác ñịnh các serotype vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 26

2.2.6 Kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 26

2.2.7 Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 26

2.2.8 Kiểm tra sự mẫn cảm với một số thuốc kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 26

2.2.9 Điều trị thử nghiệm và ñề xuất một số phác ñồ ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp chọn mẫu, lấy mẫu 26

2.3.2 Điều tra hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 27

2.3.3 Phương pháp phân lập, giám ñịnh vi khuẩn 28

2.3.4 Xác ñịnh ñộc lực vi khuẩn 28

2.3.5 Xác ñịnh khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột (enterotoxin) 28

2.3.6 Xác ñịnh khả năng xâm nhập 29

2.3.7 Kiểm tra tính mẫn cảm của Salmonella phân lập ñược với một số thuốc kháng sinh và hoá dược 29

2.3.8 Xác ñịnh serotype vi khuẩn Salmonella 31

2.3.9 Thực nghiệm ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột bằng thuốc kháng sinh 31

2.4 Xử lý các số liệu 31

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở ñàn chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 32

3.1.1 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chó theo lứa tuổi 32

3.1.2 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chó theo giống 35

3.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 37

3.3 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng tiêu chảy 40

3.3.1 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng tiêu chảy theo lứa tuổi 40

3.3.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng tiêu chảy theo giống 43

3.4 Kết quả xác ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng Salmonella phân lập ñược ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 46

3.5 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng Salmonella phân lập ñược ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 50

3.6 Kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 54

3.7 Kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược 56

3.7.1 Kiểm tra khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột (enterotoxin) 56

3.7.2 Kiểm tra khả năng xâm nhập của các chủng Salmonella 60

3.8 Tính mẫn cảm của các chủng Salmonella với thuốc kháng sinh và hoá dược 62

3.9 Kết quả ñiều trị thực nghiệm hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột 68

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72

4.1 Kết luận 72

4.2 Đề nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CHO: Chinese Hamster Ovary cell

Cs.: Cộng sự

E.coli: Escherichia coli

ETEC: Enterotoxigenic E.coli

Hly: Heamolysin

I: Intermediate sensitive (Mẫn cảm trung bình)

I.M: Intramuscular (Tiêm bắp)

I.V: Intravennous (Tiêm tĩnh mạch)

kDa: kilo Dalton

KIA: Kligler Iron Agar

ST: Heat stable Toxin (Độc tố chịu nhiệt)

XLD: Xyloze Lysine Desoxycholate Agar

Buôn Ma Thuột ……… 37 3.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và mắc hội chứng tiêu

chảy theo lứa tuổi ……… 41 3.5 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và bị tiêu chảy theo

giống ……… 44 3.6 Kết quả kiểm tra ñặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược ……… 47 3.7 Kết quả xác ñịnh serotype các chủng Salmonella 50 3.8 Kết quả xác ñịnh ñộc lực các chủng Salmonella ……… 54 3.9 Kết quả kiểm tra khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột ………… 57

3.10 Kết quả xác ñịnh khả năng xâm nhập của Salmonella ………… 61

3.11 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Salmonella phân

lập từ phân chó mắc hội chứng tiêu chảy ……… 63

3.12 Kết quả ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi trên ñịa bàn

thành phố Buôn Ma Thuột ……… 69

DANH MỤC BIỂU

3.1 Tình hình hội chứng tiêu chảy ở chó theo lứa tuổi……… 33 3.2 Tình hình hội chứng tiêu chảy ở các giống chó……… 36 3.3 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó theo lứa tuổi……… 38 3.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và bị tiêu chảy theo

lứa tuổi……… 41 3.5 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và bị tiêu chảy theo

giống……… 44

DANH MỤC HÌNH MINH HOẠ

TT Tên hình

1.1 Vi khuẩn Salmonella hình que thẳng, bắt màu hồng (quan sát

dưới ñược dưới vật kính 100x) ……… 9 1.2 Lông và fimbriae của vi khuẩn Salmonella ……… 9 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella trên các môi trường

phân lập chuyên biệt ……… 46 3.2 Đặc tính sinh hoá vi khuẩn Salmonella ñược kiểm tra trên các

môi trường KIA, Mantoz, Ure ……… 47 3.3 Hệ thống ñịnh danh vi khuẩn Vitek-2 ……… 51 3.4 Kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella trên chuột nhắt trắng 55 3.5 Kiểm tra khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột bằng phương

pháp phân ñoạn ruột lợn ……… 57 3.6 Kiểm tra khả năng xâm nhập của các chủng Salmonella ……… 61 3.7 Kháng sinh ñồ của các chủng Salmonella ……… 65

MỞ ĐẦU Đặt vấn ñề

Chó là loài vật ñược con người nuôi và thuần hóa sớm nhất; loài vật này ñược nhân dân ta nuôi vào khoảng 3000 – 4000 năm trước công nguyên với mục ñích ñể giữ nhà, ñi săn và làm thực phẩm

Đất nước phát triển, ñiều kiện sống ngày càng ñược cải thiện, mức sống người dân ngày một tăng cao, ñã tạo tiền ñề cho phong trào nuôi ñộng vật kiểng phổ biến ở nhiều gia ñình, trong ñó chó là con vật ñã ñược chọn nuôi nhiều nhất

Chó là loài vật thông minh, trung thành và là người bạn thân thiết của con người, có thể nói chó ñã trở thành một thành viên ñặc biệt trong gia ñình Chính những ñặc ñiểm này mà chó ñược nuôi ngày càng nhiều cả về số lượng và chủng loại; song việc chăm sóc nuôi dưỡng loài vật này ñang gặp phải khó khăn do bệnh tật xuất hiện ngày càng phức tạp và ñã thực sự trở thành nỗi lo cho nhiều người nuôi chúng

Việt Nam nói chung, tỉnh Dak Lak nói riêng có khí hậu nóng ẩm; khi ñiều kiện chăn nuôi kém vệ sinh sẽ tạo cơ hội cho hệ sinh vật và ký sinh trùng phát triển gây ra bệnh, ñặc biệt là bệnh trên ñường tiêu hóa Theo Nguyễn Như Pho (1995)[26], trong thực tế bệnh trên hệ thống tiêu hóa chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn so với các bệnh trên hệ thống khác ở chó và gây thiệt hại nghiêm trọng

Một trong số những bệnh phổ biến và gây nhiều thiệt hại cho chăn nuôi chó là viêm ruột tiêu chảy Bệnh xảy ra trên chó ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ mắc và tỷ lệ

chết khá cao; Salmonella ñược coi là một trong những nhân tố quan trọng gây

viêm ruột tiêu chảy ở chó (David Mc Clugage và cs, 2005)[47]

Theo tổ chức Y tế thế giới, ñến nay ñã phân lập ñược trên 3.000 chủng

Salmonella khác nhau; trong ñó có khoảng 3 - 4% số chúng có khả năng gây bệnh

cho người và ñộng vật Mỗi năm, trên toàn thế giới có khoảng 20 triệu người bị

ngộ ñộc thức ăn và khoảng 200.000 người tử vong do vi khuẩn Salmonella

Các ñàn gia súc bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh tế

cho người chăn nuôi mà chúng còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh chủ yếu ñối với con người (Selbitz H-J và cs., 1995)[69]

Từ những năm 1990, ñã có một số tác giả tiến hành nghiên cứu về

Salmonella và hội chứng tiêu chảy do chúng gây ra trên các loài nuôi tại Dak

Lak; nhưng chưa có nghiên cứu nào về loài vi khuẩn này trong hội chứng tiêu chảy chó; một loài vật nuôi sống gần gũi với con người Để tiếp tục khẳng

ñịnh vai trò của Salmonella, bằng các nghiên cứu ñộc lực và các yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược ở chó; từ ñó có luận cứ về

khoa học và ñưa ra biện pháp phòng - trị bệnh có hiệu quả, góp phần giảm thiểu dịch bệnh, phát triển ñàn chó nuôi tại ñịa phương, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe cộng ñồng

Xuất phát từ thực tế trên, trong phạm vi và ñiều kiện cho phép, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Vai trò của Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột và biện pháp phòng trị”

Mục tiêu của ñề tài

Xác ñịnh vai trò của vi khuẩn Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở

chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột; trên cơ sở ñó ñề xuất biện pháp phòng trị hợp lý

Ý nghĩa khoa học của ñề tài

Salmonella là một loại vi khuẩn sống hoại sinh trong ñường tiêu hoá của

người và ñộng vật, Salmonellosis là bệnh truyền lây giữa người và gia súc Việc

nghiên cứu Salmonella và các yếu tố gây bệnh của chúng, xác ñịnh ñược những

chủng có khả năng gây bệnh ở chó, ñể có cơ sở khoa học và từ ñó ñưa ra các

biện pháp phòng chống bệnh do Salmonella gây ra, với mục ñích phát triển ñàn

chó nuôi, chống ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khoẻ cho con người

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nguyên nhân gây tiêu chảy ở chó

Tiêu chảy là biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý ở ñường tiêu hoá Tuỳ theo ñặc ñiểm, tính chất, diễn biến, tuỳ theo ñộ tuổi gia súc, tuỳ theo yếu

tố ñược coi là nguyên nhân chính hoặc kế phát mà hội chứng tiêu chảy ở từng loài gia súc ñược gọi bằng nhiều tên khác nhau; hội chứng tiêu chảy có liên quan ñến rất nhiều yếu tố; trong ñó có yếu tố ñược coi là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố ñược coi là nguyên nhân thứ phát Việc phân loại ñể xác ñịnh ñược nguyên nhân gây tiêu chảy là một vấn ñề phức tạp, nó ñã và ñang ñược các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ñể ñề ra biện pháp phòng trị thích hợp Đến nay, các nhà khoa học ñã thống nhất rằng việc phân loại nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy chỉ có ý nghĩa tương ñối; ñiều quan trọng là phải tìm

ra ñược yếu tố nào là chính, yếu tố nào là phụ; yếu tố nào xuất hiện trước, yếu

tố nào xuất hiện sau, ñể từ ñó xây dựng ñược phác ñồ ñiều trị có hiệu quả Hội chứng tiêu chảy ở chó thường do các nguyên nhân chủ yếu sau:

1.1.1 Điều kiện ngoại cảnh

Điều kiện khí hậu thay ñổi ñột ngột: quá nóng, quá lạnh, mưa gió, ẩm ướt… kết hợp với chuồng trại không hợp vệ sinh Niconxki V.V (1986)[37], Hồ Văn Nam và cs (1997)[22]; cho biết: khi gia súc bị lạnh ẩm ướt kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào do ñó gia súc dễ bị vi khuẩn sẵn có trong ñường ruột có cơ hội bội nhiễm, tăng cường ñộc lực gây bệnh

1.1.2 Chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng:

Thức ăn có chất lượng kém, ôi thiu, khó tiêu hoá là nguyên nhân gây tiêu chảy ở gia súc Thức ăn thiếu các chất khoáng, Vitamin cần thiết cho cơ thể gia súc, ñồng thời phương thức cho ăn không phù hợp sẽ làm giảm sức ñề kháng của cơ thể gia súc và tạo cơ hội cho các vi khuẩn gây ra hội chứng tiêu chảy (Laval V, 1997 [36])

1.1.3 Do Stress

Trong ñời sống hàng ngày có các tác nhân ngoại cảnh tác ñộng, gia súc cũng xuất hiện tiêu chảy hàng loạt, mà trước ñó không hề có dấu hiệu này Có

nhiều tác giả cho ñó là hậu quả tất yếu của Stress

Hệ thống tiêu hoá (dạ dày và ruột) mẫn cảm ñặc biệt với Stress (Phạm Khắc Hiếu, 1998 [13]) Stress gây nên hiện tượng chán ăn, nôn mửa, tăng nhu

ñộng ruột, có khi tiêu chảy, ñau bụng

1.1.4 Nguyên nhân do ký sinh trùng

Theo Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996)[17] các loại ký sinh trùng ñường ruột gây tổn thương niêm mạc ruột cũng là một nguyên nhân dẫn ñến tiêu chảy

+ Các loài kí sinh trùng thường gặp ở chó: sán dây gồm có Teania

kydatiggena, Teania fisiformis, Dipilidium canium…; các loài giun ñũa Toxocara canis… Đặc biệt là giun móc Ancylostoma canium có những móc nhọn bằng kitin

cắm vào ruột non phần tá tràng, không tràng ñể hút máu gây tổn thương, làm xuất huyết ruột tạo ñiều kiện cho các vi sinh vật xâm nhập gây viêm ruột tiêu chảy

+ Các ñơn bào kí sinh như: Amip Entaoeba hystotitica gây bệnh lị, trùng roi Giardia intestinalis

1.1.5 Do nấm mốc

Độc tố nấm mốc rất ña dạng và phong phú, nhưng chúng ñều là sản phẩm của sự chuyển hoá thứ cấp trong quá trình phát triển của một loài, mỗi chủng nấm mốc nhất ñịnh (Butler E., Crisan E.V 1977 [44]) Bản chất của ñộc

tố nấm mốc là polypeptide, các hợp chất quinol, các hợp chất có nhân piron

Trong các loại ñộc tố nấm mốc thì Aflatoxin là loại ñộc tố ñược quan tâm

nhiều nhất hiện nay

Nấm mốc và ñộc tố do chúng sản sinh ra ñã gây thiệt hại ñáng kể cho chăn nuôi và ảnh hưởng ñến sức khoẻ của con người, những ñộc tố nấm mốc

có hại cho con người và gia súc là Aflatoxin, Ochratoxin, Sterigmato cystin

gây ñộc và gây ung thư gan, nhóm gây ñộc ñường tiêu hoá là các ñộc tố

Trichothecens, T2toxin Diacetocyscirpenol, Nivalenol

Độc tố nấm mốc với hàm lượng cao có thể gây chết hàng loạt gia súc, với biểu hiện là nhiễm ñộc ñường tiêu hoá, gây tiêu chảy dữ dội, mà thường người ta không nghĩ ñến nguyên nhân này, nên mọi phác ñồ ñiều trị bằng kháng sinh ñều không hiệu quả Ngoài việc gây tiêu chảy cho gia súc, ñộc tố nấm mốc còn gây ñộc trực tiếp cho người từ thực phẩm bị nhiễm nấm mốc

hoặc gián tiếp từ ñộc tố tồn dư trong thực phẩm (Biro H., 1985 [41])

1.1.6 Nguyên nhân do virus

Theo Trần Thanh Phong (1996)[27] gây tiêu chảy ở chó thường gặp ở các bệnh do virus là:

- Bệnh Carré do virus Carré thuộc họ Paramyxoviridae, giống Morbilivirus Bệnh xảy ra chủ yếu ở chó từ 2 ñến 4 tháng tuổi, ñặc biệt nhiều nhất ở chó 3 ñến 4 tháng tuổi

- Bệnh viêm ruột ở chó do Coronavirus

Hai loại virus này gây tiêu chảy cấp tính, phân nhiều nước, chó sốt cao nhanh chết

- Bệnh Parvo do virus thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus; bệnh gây chết nhiều ở chó non; chó lớn tỷ lệ chết thấp nhưng là nguồn trữ virus gây bệnh với ñặc trưng của bệnh là sốt nhẹ kéo dài, tiêu chảy có máu hồng và cả máu tươi

1.1.7 Nguyên nhân do vi khuẩn

Một trong số những bệnh phổ biến và gây nhiều thiệt hại cho chăn nuôi chó là viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn; Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ mắc

và tỷ lệ chết khá cao (David Mc Clugage, D.V.A.,C.V.A 2005)[47]

Trong lĩnh vực vi sinh vật, có nhiều nguyên nhân dẫn ñến tiêu chảy, tuy nhiên bất cứ nguyên nhân nào dẫn ñến tiêu chảy, tác nhân phổ biến nhất vẫn là vi khuẩn, hoặc với vai trò kế phát, hoặc nguyên phát (Nguyễn Bá Hiên, 2001)[11] Ở

ñiều kiện bình thường có thể phát hiện Salmonella trong ñường ruột của nhiều loài

gia súc, gia cầm; khi sức ñề kháng của ñộng vật bị giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào nội tạng và gây bệnh (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)[31]

Trong ñường ruột của ñộng vật có rất nhiều vi khuẩn, chúng ñược gọi

là “vi khuẩn chí ñường ruột” Chúng tồn tại ở một trạng thái cân bằng với nhau và với cơ thể vật chủ Do một nguyên nhân nào ñó dẫn ñến trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật bị phá vỡ, tất cả hoặc chỉ có một loại nào ñó sản sinh lên quá nhiều, gây hiện tượng loạn khuẩn (Vũ Văn Ngũ và cs., 1979)[24] Loạn khuẩn là nguyên nhân chủ yếu dẫn ñến bệnh ở ñường tiêu hoá, ñặc biệt là gây tiêu chảy

Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở chó diễn ra theo 2 quá trình, ñầu tiên là rối loạn tiêu hoá, sau ñó là quá trình nhiễm trùng

Giai ñoạn ñầu, thường do các yếu tố bất lợi như gặp lạnh ñột ngột, phẩm chất thức ăn kém, các stress có hại: nóng, lạnh, ẩm… làm cơ năng tiêu hoá ở ñường ruột bị rối loạn, thức ăn không ñược tiêu hoá sẽ lên men, phân giải các chất hữu cơ sinh ra chất ñộc như Indol, Scatol, H2S… Các sản phẩm ñộc này làm cho pH trong ñường ruột thay ñổi gây trở ngại về tiêu hoá và hấp thu trong ñường ruột (Hồ Văn Nam và cs., 1997)[22], Sử An Ninh, (1993)[23], Đào Trọng Đạt và cs, (1996)[8], Phạm Khắc Hiếu, (1998)[14] Những chất ñộc này tác ñộng lên niêm mạc ruột gây xung huyết, tăng nhu ñộng ruột gây tiêu chảy (Vũ Triệu An, 1978)[1]

Giai ñoạn tiếp theo, trong ñiều kiện rối loạn tiêu hoá, những vi khuẩn trong ñường ruột gặp ñiều kiện thuận lợi, sinh sôi nảy nở Chúng phát triển nhanh về số lượng làm phá vỡ trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật ñường ruột, các vi khuẩn có lợi giảm ñi, thay vào ñó là vi khuẩn có hại Các

vi khuẩn này sẽ tăng cường ñộc lực, sản sinh ñộc tố tác ñộng vào niêm mạc ruột gây tình trạng bệnh lý trầm trọng thêm

Cho ñến nay, các nhà khoa học ở nhiều nước ñã xác nhận các vi khuẩn

sau ñây có thể gây viêm ruột tiêu chảy cho chó (theo Manager, Janos mocsy dẫn theo Đào Trọng Đạt (1997)[7]

- Nhóm vi khuẩn E.coli:

Đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú sống hoại sinh ở khu vực ruột già trong ñường tiêu hoá của chó và tất cả những ñộng vật máu nóng Trong ñó, nhiều chủng gây dung huyết và gây bệnh ñường tiêu hoá Bệnh ở chó thường

do những E.coli có kháng nguyên O và K chiếm ưu thế Các chủng E.coli sản

sinh ñộc tố Shiga-toxin, loại ñộc tố này thường phân lập ñược ở lợn mắc bệnh phù ñầu (Beutin, 1999 - trích dẫn theo David Mc Clugage, D.V.A.,C.V.A 2005)[47]

- Nhóm vi khuẩn Shigella:

Gây bệnh kiết lị ở người, có 6 chủng chủ yếu Shigella dysenteria,

Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei…, mỗi nhóm lại chia ra

nhiều subtype Shigella tiết ra nội ñộc tố làm tăng sự phân tiết của dịch ruột,

kết hợp với sự xâm nhập và làm tổn thương tế bào biểu mô gây hoại tử ruột, xuất huyết ruột

- Nhóm tụ cầu và nhóm liên cầu khuẩn:

Hai nhóm vi khuẩn này gây bệnh cho hầu hết các cơ quan nội tạng của ñộng vật máu nóng, trong ñó có chó, mèo Chó bị viêm ruột cấp, người ta ñã

xác nhận vai trò gây bệnh của Staphylococus aureus và Streptococus fealis,

Streptococus pyogenes

- Nhóm vi khuẩn yếm khí:

Một số chủng vi khuẩn yếm khí như: Clostridium perfringens,

Clostridium necrophorus cũng gây viêm ruột rất nặng cho chó, nhất là chó nhỏ

- Nhóm vi khuẩn thương hàn:

Theo Galton và cs (1952)[51], ở chó ñã tìm thấy các chủng

Salmonella enteritidis; S paratyphy A, B; S typhimuriusm Nhóm vi khuẩn

này có nhiều serotype khác nhau Chúng là tác nhân gây bệnh cho hầu hết các

loài ñộng vật có vú kể cả con người Chó có thể nhiễm khuẩn do uống phải nước bẩn hoặc thức ăn bị nhiễm vi khuẩn (thức ăn sống không qua chế biến)

Bệnh viêm ruột tiêu chảy là bệnh phổ biến ở chó nghiệp vụ và chó cảnh, bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường thấy nhiều vào mùa hè và mùa thu khi thời tiết ẩm nóng và mưa ẩm ướt Qua theo dõi dịch bệnh của chó khu vực Hà Nội, thấy khoảng 80% số chó bị chết là do mắc bệnh dạ dày và ruột cấp tính Chó non dưới 6 tháng tuổi khi mắc bệnh sẽ chết với tỷ lệ rất cao (60-70%)

Khi chó ăn uống phải thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn, vi khuẩn sẽ phát triển trong niêm mạc ñường tiêu hoá gây ra bệnh viêm dạ dày và ruột cấp Bệnh lây nhiễm trực tiếp từ chó bệnh sang chó khoẻ qua ñường tiêu hoá Chó khoẻ ăn uống phải vi khuẩn gây bệnh từ thức ăn và phân của chó ốm thải

ra sẽ mắc bệnh; chó bệnh thể hiện các triệu chứng ñiển hình: vài ngày ñầu chó

ăn ít hoặc bỏ ăn, sốt 39,50C – 400C, mệt mỏi, thích uống nước Đặc biệt khi bị

nhiễm vi khuẩn Salmonella, chó sốt cao 400C – 41,50C kèm theo các cơn run rẩy; sau ñó nôn mửa liên tục, uống nước cũng nôn, ñồng thời ỉa chảy dữ dội, phân lúc ñầu táo sau lỏng có màu vàng xám, có lẫn niêm mạc của dạ dày và ruột lầy nhầy, có mùi rất tanh Do nôm mửa và tiêu chảy liên tục, chó bị mất nước nhanh nếu không ñiều trị kịp thời sẽ chết sau một vài ngày (Phạm Sỹ Lăng - Phan Địch Lân - Bùi Văn Đoan, 1993)[18]

Như vậy, nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ñến nay ñã

khẳng ñịnh rằng: Salmonella là một trong những tác nhân vi khuẩn gây tiêu

chảy ở gia súc Dưới ñây chúng tôi xin trình bày những nghiên cứu và một số hiểu biết cần thiết về loài vi khuẩn này

1.2 Vi khuẩn Salmonella

1.2.1 Hình thái

Salmonella là một loại vi khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, kích thước 0,4-0,6

x 1-3µ, không hình thành giáp mô và nha bào, phần lớn vi khuẩn thuộc giống

Salmonella có thể di ñộng, có 7 - 12 lông xung quanh thân (trừ S pullorum và

S gallinarum không có lông) Vi khuẩn bắt màu gram âm Tiêu bản làm từ

khuẩn lạc sau khi nuôi cấy 18 giờ, nhuộm gram, soi kính hiển vi cho thấy vi khuẩn bắt màu ñỏ, hình ovan, tụm lại với nhau hay riêng lẻ

Vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt

ñộ thích hợp 370C, nhưng có thể phát triển ñược từ 6 - 420C, nuôi cấy ở 430C

có thể loại trừ tạp khuẩn, nhưng Salmonella vẫn phát triển ñược; pH thích hợp

là 7,6; phát triển ñược ở pH = 6 - 9

Nuôi cấy trong môi trường nước thịt, sau vài giờ ñã ñục ñều, sau 18 giờ canh trùng ñã ñục ñều Nuôi cấy lâu ở ñáy ống nghiệm có cặn, trên môi trường có màng mỏng và có mùi thối

Trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi ở giữa, ñường kính = 1 - 1,5 nm; thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (Rough), nhám, mặt trong mờ

Chuyển hoá ñường: Mỗi loại salmonella có khả năng lên men một số ñường nhất ñịnh và không ñổi Phần lớn các loại Salmonella lên men sinh hơi

glucoz, mantoz, galactoz, levuloz, arabinoz Một số loại cũng lên men các

ñường trên nhưng không sinh hơi: Salmonella abortus equi, Salmonella typhi,

Salmonella cholerae suis, Salmonella gallinarum, Salmonella enteritidis Salmonella pullorum khôn lên men ñường mantoz Salmonella cholerae suis

không lên men arabinoz Tất cả các Salmonella ñều không lên men ñường

lactoz, saccaroz

- Môi trường có kalixyanua: Tất cả các Salmonella ñều không mọc

- Khoảng 96% Salmonella tiết ra enzym khử cacboxyn ñối với lyzin,

ocnitin và acginin

- Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê,

không sản sinh Indon Một số sử dụng ñược cacbon ở nguồn xitrat, phân giả xanh metylen

- Phản ứng MR, catalaz dương tính (trừ Salmonella choleraesuis,

Salmonella gallinarum-pullorum có MR âm tính)

- Phản ứng H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A, Salmonella

abortus equi, Salmonella typhi suis)

1.2.3 Cấu trúc kháng nguyên

Ở Salmonella, ngoài phản ứng huyết thanh ñặc hiệu của từng vi

khuẩn, còn có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các kháng nguyên của vi khuẩn này với kháng nguyên của loài khác, thậm chí giữa nhóm này với

nhóm khác trong giống Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella hết sức phức

tạp, bao gồm các loại sau:

1.2.3.1 Kháng nguyên O (KN O)

Lypopolysaccharide (LPS) là một thành phần cơ bản cấu trúc nên màng ngoài của thành phần tế bào vi khuẩn LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm

3 vùng riêng biệt: vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipide A Kháng nguyên O

do nhiều Oligosaccharide tạo thành, nằm trong vùng ưa nước (Gyles và Dela, 1993)[56]; nó bao gồm 2 nhóm:

-Polysaccharide nằm ở bên trong, không có nhóm hydro, không mang ñặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo ra sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc

từ dạng S sang dạng R

-Polysaccharide nằm ở bên ngoài, có nhóm hydro, quyết ñịnh tính kháng nguyên và ñặc trưng cho từng chủng

Kháng nguyên O là loại kháng nguyên chịu nhiệt, có thể chịu ñược

1000C trong nhiều giờ, chịu ñược cồn và acide HCl ở nồng ñộ 1N trong 20 giờ

Kháng nguyên O của Salmonella rất phức tạp, hiện nay người ta ñã

tìm thấy 65 yếu tố khác nhau, lý hiệu bằng số La Mã hay số Ả Rập (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)[31]

1.2.3.2 Kháng nguyên H (KN - H)

Bản chất kháng nguyên H là một Protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn Kháng nguyên H không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá huỷ ở nhiệt ñộ 600C trong 1 giờ, dễ bị phá huỷ bởi cồn, acide yếu Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng có ý nghĩa trong việc xác ñịnh giống loài vi khuẩn (Trần Quang Diên, 2002)[6] Kháng nguyên H chia làm 2 pha (phase):

-Pha 1 có tính chất ñặc hiệu, gồm 28 kháng nguyên lông, ñược biểu thị bằng chữ mẫu Latin thường: a, b, c, d…

-Pha 2 không có tính chất ñặc hiệu, gốm có 6 loại ñược biểu thị bằng chữ số Ả rập: 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay chữ latin thường: e, n, x Loại này có thể ngưng kết với loại khác, ñôi khi thành phần nay có thể gặp ở Escherichia

1.2.3.3 Kháng nguyên vỏ K (KN-K)

KN-K của Salmonella không phức tạp; có một kháng nguyên vỏ ñã

biết là kháng nguyên Vi (Virulence) và cũng chỉ có ở hai typ huyết thanh là

Salmonella typhi và Salmonella paratyphi

KN-K chỉ là thành phần của KN-O; có 3 loại KN-K là: kháng nguyên

5 (KN-5), kháng nguyên Vi (KN-Vi) và kháng nguyên M (KN-M)

- KN-5 dễ bị acide HCl phá hủy và tính chất ngưng kết của KN-5 hoàn toàn bị phá huỷ ở nhiệt ñộ 1200C, nhưng không bị phá huỷ bởi cồn

- KN-Vi có sức ñề kháng cao với cồn và a xit HCl KN-Vi không liên quan gì ñến ñộc lực của vi khuẩn nhưng ñóng vai trò chính trong việc tạo miễn dịch chủ ñộng và thụ ñộng ở ñộng vật và người

- KN-M kháng nguyên của dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng nhầy 1.2.3.4 Kháng nguyên màng ngoài vỏ bọc (KN-OMP)

Lớp màng ngoài của Salmonella chứa protein có ñộc tính ñã ñược

hydro hoá, thành phần này chiếm tới 5% toàn bộ KN-OMP Theo Smith và

Nikaido (1978), OMP (Outer Menbrane Protein) của Salmonella typhimurium

có 4 loại protein phân chia theo trọng lượng phân tử, trong ñó có 3 loại tạo kênh vận chuyển của màng tế bào Cho ñến nay, vẫn còn rất ít thông tin về KN-OMP cũng như nhiệm vụ của nó trong mối tương tác giữa thân tế bào vi khuẩn với tổ chức cơ thể vật chủ

1.2.3.5 Kháng nguyên Pili (KN-Pili)

Ngoài chức năng bám dính (như Pili type 1), pili còn mang chức năng kháng nguyên Bản chất KN-Pili là protein Thành phần và trật tự các acide amin của mỗi kháng nguyên ñều có những ñiểm khác biệt Đến nay, một số

nhóm KN-PIli của salmonella ñã phát hiện gây tiêu chảy ở người và ñộng vật

như CFA (Colonizaton Factor Antigen) I và II (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)[31]

1.2.4 Yếu tố gây bệnh

Salmonella gây bệnh cho người và gia súc bằng các yếu tố gây bệnh là

ñộc tố và các yếu tố không phải là ñộc tố

1.2.4.1 Các yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố

1.2.4.1.1 Kháng nguyên O (KN-O)

Thành phần hoá học, cấu trúc kháng nguyên O ñều ảnh hưởng tới ñộc

lực của vi khuẩn Salmonella Kháng nguyên O giúp vi khuẩn chống lại khả

năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của ñại thực bào Ngoài ra kháng nguyên O còn kích

thích các cơ quan ñáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể ñặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Đây là cơ chế phòng vệ quan trọng, giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn

1.2.4.1.2 Kháng nguyên K (KN-K)

Bản chất kháng nguyên K là một polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là một thành phần của kháng nguyên O Kháng nguyên K của vi

khuẩn Salmonella và các vi khuẩn ñường ruột khác khi xâm nhập vào hệ

thống tiêu hoá ñều có khả năng gây bệnh ở những mức ñộ khác nhau

Vai trò của kháng nguyên K chưa thống nhất, nhưng có ý nghĩa về mặt ñộc lực, vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể, chống lại hiện tượng thực bào

1.2.4.1.3 Kháng nguyên H (KN-H)

Bản chất kháng nguyên H chính là protein trong thành phần lông của vi

khuẩn Salmonella Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong tạo miễn dịch

phòng bệnh, không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực và vai trò bám dính của vi

khuẩn Tuy vậy, kháng nguyên H có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn Salmonella

không bị tiêu diệt bởi thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào ñại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein và cs, 1984)[77]

1.2.4.1.4 Yếu tố bám dính

Khả năng bám dính của Salmonella lên tế bào nhung mao của ruột là

bước ñầu quan trọng trong quá trình gây bệnh Mỗi loại vi khuẩn ñều sinh ra một yếu tố có cấu trúc ñặc trưng ñể liên kết giữa chúng và ñiểm tiếp nhận trên

tế bào; với Salmonella ñó chính là Fimbriae type1 - một dạng protein phân

cực có cấu trúc bậc 1, bao gồm nhiều ñơn vị xác ñịnh, có trọng lương phân tử

từ 8000 - 28000 dalton (01dalton = 10-27 gram)

Khi yếu tố bám dính Fimbriae của Salmonella có diện tích ion bề mặt

trái với diện tích ion bề mặt tế bào nhung mao (Jones và Richardson, 1982)[60] Như vậy Fimbriae có nhiệm vụ quan trọng là tạo ñiều kiện cho

Salmonella từ ruột ñi vào biểu mô và phân tán vào các tế bào biểu mô khác

của cơ thể

Năm 1982, Tanaka nghiên cứu và cho biết: Khi gây miễn dịch cho

chuột qua ñường miệng bằng các giống Salmonella có yếu tố bám dính, ñã quan sát ñược Salmonella có trong ñường tiêu hoá, ñồng thời còn tìm thấy vi

khuẩn này trong gan lách và hạch lympho Ngược lại, khi gây nhiễm bằng các

chủng Salmonella không có yếu tố bám dính, Salmonella chỉ khu trú cục bộ

và di chuyển qua ống tiêu hoá; không thể tìm thấy ñược vi khuẩn này trong hạch, lách và gan; cũng không xác ñịnh ñược sự có mặt của kháng thể O và kháng thể H trong huyết thanh chuột bị gây nhiễm (trích theo Lê Văn Tạo, 1986)[30] Điều ñó khẳng ñịnh rằng: khả năng bám dính của vi khuẩn

Salmonella lên tế bào biểu mô ruột là yếu tố gây bệnh quan trọng, giúp cho vi

khuẩn xâm nhập vào tế bào cơ thể vật chủ và gây bệnh Không những vậy, người ta còn phát hiện thấy có sự liên quan giữa ñộc lực của vi khuẩn và khả năng bám dính của nó, những vi khuẩn có ñộc lực cao thì có khả năng bám dính tốt hơn những vi khuẩn có ñộc lực thấp

Quá trình bám dính của Salmonella cũng tương tự như quá trình bám

dính chung của các loại vi khuẩn ñường ruột khác; nó tiến hành theo 3 bước:

- Bước 1: Tiếp xúc từng phần vi khuẩn lên bề mặt tế bào, bước này có thể xảy ra ngẫu nhiên

- Bước 2: Hấp thụ vi khuẩn lên bề mặt tế bào, bước này phụ thuộc vào tính chất bề mặt tế bào mang tính thuận nghịch

- Bước 3: Yếu tố bám dính phát triển liên kết với ñiểm tiếp nhận của bề mặt tế bào, ví dụ như màng glycoprotein của tế bào nhung mao ruột non

1.2.4.1.5 Khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào

Khả năng xâm nhập vào vào tế bào biểu mô và lớp mucosa ñường ruột

là ñặc tính của các chủng Salmonella có ñộc lực Những chủng Salmonella

không có ñộc lực thì không có khả năng xâm nhập vào tế bào; thí dụ: 6 chủng

biến dị của Salmonella choleraesuis, có 2 chủng biến dị có khuyết tật trong

phần lõi hoặc trong phần kháng nguyên O trong chuỗi lypopolysaccharide (LPS) không có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô

Vi khuẩn Salmonella xâm nhập ñược vào tế bào biểu mô ekaryotic là bước

cần thiết ñể tạo khả năng ñộc lực Quá trình này có rất nhiều yếu tố tham gia: -Trên bề mặt tế bào biểu mô (epithen) có nhiều loại protein bề mặt cần cho quá trình xâm nhập và vai trò ñộc lực của vi khuẩn

- Trong nhiễm sắc thể có các gen kề nhau, mỗi ñoạn gen mã hoá cho một loại protein phân tiết, ñược ký hiệu là SIP (Salmonella Ivasion Protein)

A, B, C, D (Finley và cs, 1988)[48]

- Trong môi trường nuôi cấy Salmonella ở nhiệt ñộ 370C, xuất hiện 5 loại protein, trong ñó có 1 loại protein phân tiết, ñược ký hiệu là SOP (Salmonella Outer Protein) E Loại SOP E ñược ñưa vào trong cytoplasma,

kết hợp với SIP sẽ giúp cho Salmonella xâm nhập vào trong tế bào (Nguyễn

Như Thanh và cs., 1997)[31]

Sau khi xâm nhập ñược vào trong tế bào, vi khuẩn Salmonella tiếp tục

hành trình xuyên tế bào (transcytose) qua mặt ñối diện Thời gian cần thiết cho sự xuyên bào tối thiểu là 4 giờ (Finlay và cs, 1988)[48]

Tác giả Clarke và Gyles lại cho rằng: Để ñảm bảo nhu cầu sắt cho quá

trình phát triển của mình trong cơ thể vật chủ, vi khuẩn Salmonella hình thành

các không bào có ái lực mạnh với sắt (Siderophores) Siderophores ñược tổng hợp bên trong bế bào vi khuẩn rồi bài xuất ra ngoài dịch thể mô bào vật chủ Tại ñây chúng thu nhập sắt rồi ñược hấp thu trở lại qua các receptors protein ñặc hiệu màng ngoài tế bào vi khuẩn Sắt từ phức hợp Sắt-Siderophores sẽ ñược vi khuẩn sử dụng cho hoạt ñộng sống của chúng (Clarke và cs., 1988)[46]; (Gyles and Dela, 1993)[56]

Salmonella cholerae suis có khả năng khử sắt từ huyết thanh, từ transferin

ñẻ ñáp ứng nhu cầu sắt của chúng trong ñiều kiện môi trường bên trong tế bào có hàm lượng sắt thấp

Theo Gyles và Thoen, vi khuẩn Salmonella có khả năng ñề kháng với hầu

hết với các loại kháng sinh ñang ñược sử dụng hiện nay như: Streptomycin,

Tetracyclin, Sulfonamid Một tỷ lệ cao các chủng Salmonella phân lập ñược có

khả năng kháng lại với Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenycol, Gentamycin, Sulfamethoxazole và Trimethoprim

Tại Trung tâm Thí nghiệm Thú y thuộc Bộ Nông nghiệp Mỹ, từ năm 1988

ñến năm 1991, người ta ñã phân lập ñược 98 chủng Salmonella từ gà - gà tây, từ

trứng, từ chất ñộn chuồng và từ chim hoang ở Mỹ và châu Âu có khả năng

kháng lại các kháng sinh acid nalidicic (quinolone); có 27 chủng Salmonella

phân lập có ký hiệu là L20 ñến L25; L33 ñến L49; L89 ñến L91 và L112 có khả

năng kháng lại một số kháng sinh thông thường, trong ñó có Ciprofloxacin (Grigg và cs, 1994 )[54]

Ở Việt Nam, khi nghiên cứu tính kháng thuốc của 98 chủng Salmonella, các tác giả ñã cho biết: 100% số chủng Salmonella ñề kháng với penicillin và Sulphonamid; chưa có chủng Salmonella nào kháng lại Furazolidon; có 01 chủng Salmonella duy nhất trong 98 chủng kháng lại Neomycin… (Phạm Khắc

Hiếu và Bùi Thị Tho, 1999) [15]

Tuy nhiên khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và của

Salmonella nói riêng, luôn thay ñổi; nó phụ thuộc vào từng ñịa phương, từng

loài ñộng vật, và thời ñiểm làm kháng sinh ñồ khác nhau thì cho kết quả cũng khác nhau

Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chia ra các loại sau:

- Kháng tự nhiên: vi khuẩn có sẵn các loại men hoặc các chất chống lại kháng sinh

- Kháng thu ñược: là tính kháng thuốc mà vi khuẩn có ñược do vi khuẩn tiếp xúc nhiều lần với các loại kháng sinh; hoặc do truyền từ vi khuẩn này sang

vi khuẩn khác theo con ñường tiếp hợp kháng thu ñược có hai trường hợp là kháng thuốc ñột biến và kháng thuốc tràn lan

Kháng thuốc ñột biến là do ñột biến trong hệ gen của tế bào vi khuẩn, vi khuẩn trở nên có khả năng di truyền tính kháng thuốc này

Kháng thuốc tràn lan là do nhân tố di truyền plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể trong plasma của vi khuẩn Phần lớn tính kháng thuốc của vi khuẩn là do truyền ngang và truyền dọc bằng plasmid – R, thông qua tiếp hợp giới tính, vi khuẩn di truyền khả năng kháng thuốc cho thế hệ mai sau

Ngoài ra, có một số chủng Salmonell có khả năng nhận tính kháng thuốc

từ E.Coli rất nhanh, nhất là kháng với Ampicillin, Streptomycin, Sulphonamid

1.2.4.2 Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố

Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố (toxin) của Salmonella bao gồm các yếu tố

chính là: nội ñộc tố (endotoxin), ngoại ñộc tố ñường ruột (enterotoxins) và ñộc tố

tế bào (cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988)[48]

1.2.4.2.1 Nội ñộc tố - Edotoxin

Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella

nói riêng, ñược cấu tạo bởi thành phần cơ bản là Lypopolysaccharide (viết tắt là LPS) LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các ñặc tính và chức năng riêngg biệt: vùng ưa nước, vùng lỏi và vùng lipit A

Vùng ưa nước bao gồm 1 chuỗi polisaccharide chứa các ñơn vị cấu trúc kháng nguyên O Vùng lỏi có bản chất là acidic heterooligosaccharide, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với cùng lipit A Vùng lipit A ñảm nhận chức năng nội ñộc tố của vi khuẩn Cấu trúc nội ñộc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O Cấu trúc nội ñộc tố biến ñổi sẽ dẫn ñến sự thay ñổi ñộc lực của

Salmonella Các ñột biến gen ở vùng lỏi, vùng chuỗi ña ñường (vùng ưa nước),

làm cho Salmonella không còn ñộc lực

Lipit A có ái lực với màng tế bào, với các lipit khác và với protein Điều

ñó chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt ñộng nội ñộc tố của LPS Vùng ña ñường polysaccharide, mặc dù có khả năng hoạt ñộng sinh học giống như endotoxin, nhưng chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hoà tan (Bradley, 1979)[42]

Nội ñộc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) ñược phóng ra từ vách

tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hện ñộc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào ñại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan, lách

Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác ñộng của nội ñộc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hoá và hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu o xy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn,…

- Nội ñộc tố tác ñộng trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể

- LPS tác ñộng lên các tế bào tiểu cầu, gây nên sốc nội ñộc tố,theo cơ chế: + Giải phóng các chất hoạt ñộng thành mạch như: Histamine, Serotonia + Ngưng kết các tiểu cầu nội mạch

+ Đông vốn, tắc các mạch quản

- LPS kích thích quá trình phân bào của tế bào lâm ba dưới tác dụng nâng cao mức GMP vòng nội bào, tăng cường quá trình hấp thu aminoacids và các ion như ion Ca+2

- LPS tác ñộng ñến quá trình biệt hoá của các tế bào lympho B, dẫn ñến hiện tượng tăng cường số lượng các tế bào tổng hợp globulin miễn dịch, bao gồm IgM và IgG Nội ñộc tố còn tác ñộng làm tăng cường chức năng của lâm

ba cầu T và các tế bào tham gia miễn dịch trung gian tế bào

- LPS tác ñộng lên quá trình trao ñổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt lực của các men phân giải glucoz (men pyruvatkinaza), các men phân giải glycogen (men photphorylaza); làm giảm hoạt lực của các men tham gia qua trình tổng hợp glycogen (men photphoenolpyruvat carboxylkinaza, glycogensynthaza, fructo - 1-6- diphosphataza và glucoz -6-photphataza Sau khi tiêm LPS, hàm lượng ñường trong máu bắt ñầu tăng và ñạt giá trị cực ñại sau 2 giờ; sau ñó giảm dần và dẫn tới tình trạng giảm ñường huyết; ñồng thời xuất hiện hiện tượng suy kiệt nguồn glycogen dự trữ ở gan, tăng lactate, giảm pyruvat trong máu và mô bào, ức chế hoạt ñộng của men succinate dehydrogenasa ở cơ và gan (Bradley, 1979)[42]

- LPS tác ñộng ñến bào quan lysosomes: nội ñộc tố LPS tác ñộng lên lysosomes theo cơ chế: Sau khi bám lên receptors ñặc hiệu, LPS ñược hấp thu theo cơ chế hấp thu nội bào rồi ñược vận chuyển vào trong nguyên sinh chất tế bào Tại ñây, chúng kết hợp với lysosomes hình thành dạng lysosome thứ cấp Quá trình kết hợp này làm phá vỡ lysosomes giải phóng các enzymes Đồng thời

các lysosomes thứ cấp tác ñộng lên nhân tế bào gây hiện tượng phân bào, tăng cường tổng hợp mARN dẫn tới tăng lượng enzymes lysosomes Những enzymes này gây nên hịên tượng tiêu hoá nội bào, dẫn ñến phá huỷ mitochondria và các bào quan khác

- LPS tác ñộng ñến mitochondria: Sau khi ñược vận chuyển qua màng vào nguyên sinh chất tế bào, LPS bám lên màng ngoài motochondria, rồi ñược vận chuyển vào màng trong Tại ñây chúng làm thay ñổi cấu trúc và chức năng của màng này, dẫn ñến tăng hoạt ñộng của ATP -aza Do ATP - aza tăng cường hoạt ñộng, nên gây ra hiện tượng tích luỹ ADP và photpho hữu cơ trong nguyên sinh chất tế bào, từ ñó làm tăng cường phân giải glucoza Do tác ñộng gữa mitochodria với nội ñộc tố LPS, dẫn ñến tăng cường bài xuất H2O2 và O2, phá huỷ màng các bào quan khác

1.2.4.2.2 Độc tố ñường ruột - Enterotoxin

Về cơ chế miễn dịch và di truyền, các Enterotoxin của Salmonella có quan

hệ gần gũi với Choleratoxin like enterotoxin (CT) Còn về ñặc tính sinh học,

Enter- otoxin của Salmonella không chỉ giống của CT, mà còn giống với Enterptoxin của E.coli (Clarke và cs, 1988 )[46]

Độc tố ñường ruột của Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm

xuất nhanh (Rapid Permeability factor - RPF) và ñộc tố thẩm xuất chậm (Delayde permeability factor - DPF)

- Độc tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô

của ruột, nó thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1 - 2 giờ và kéo dài 48 giờ, làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) Độc tố thẩm xuất nhanh có

cấu trúc và thành phần giống như ñộc tố chịu nhiệt của E.coli, nên ñược gọi là ñộc tố chịu nhiệt của Salmonella (Heat Stable Toxin - ST) Độc tố thẩm xuất

nhanh có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt ñộ thấp, có thể bảo quản ở âm 200C Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide

Độc tố thẩm xuất nhanh kích thích co bóp nhu ñộng ruột, làm tăng sự

thẩm thấu thành mạch, phá huỷ tổ chức tế bào biểu mô, giúp vi khuẩn

Salmonella xâm nhập vào tế bào và phát triển tăng nhanh về số lượng Vi khuẩn

trực tiếp tăng cường sản sinh ñộc tố, làm rối loạn cân bằng trao ñổi muối, nước

và chất ñiện giải Quá trình bệnh lý ñường ruột và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng

- Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống ñộc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E.coli, nên ñược gọi là ñộc tố không chịu nhiệt của Salmonella (Heat Lable Toxin - LT) Độc tố thẩm xuất chậm nó thực

hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18 -24 giờ, có thể kéo dài 36 - 48 giờ Độc tố thẩm xuất chậm bị phá huỷ ở nhiệt ñộ 700C trong vòng 30 phút và ở 560C trong vòng 4 giờ Độc tố thẩm xuất chậm có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptide

Độc tố thẩm xuất chậm làm thay ñổi quá trình trao ñổi nước và chất ñiện giải, dẫn ñến tăng cường bài nước và chất ñiện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hoá lớp tế bào vili của thành ruột, gây tiêu chảy

1.2.4.2.3 Độc tố tế bào - Cytoxin

Khi cơ thể người và ñộng vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất nước và mất chất ñiện giải là hiện tượng hàng loạt tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị tổn thương ở những mức ñộ khác nhau Sự phá huỷ hay tổn thương

ñó là do ñộc tố tế bào của Salmonella gây nên, theo cơ chế chung là: Ức chế

tổng hợp protein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào CHO (Clarke và cs., (1988)[46]

Có ít nhất 3 dạng ñộc tố tế bào:

- Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt ñộ và mẫn cảm với trypsin

Dạng này ñược phát hiện thấy ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng

phân tử trong khoảng từ 56 ñến 78 kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng ñộc tố Shigellatoxin hoặc Shigella-like toxin Độc tố dạng này tác ñộng theo chơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào

Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein ngoài tế bào vi khuẩn; có cấu trúc

và chức năng gần giống với các dạng ñộc tố tế bào do Shigella và các chủng

Entero Toxigenic E.Coli (ETEC) sản sinh ra Dạng ñộc tố này cũng phổ biến ở

hầu hết các serovar Salmonell gây bệnh

- Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ với ñộc

tố Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác ñộng Dạng ñộc

tố này tác ñộng lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào Theo Rahman và cs: Trong phòng thí nghiệm, ñộc tố dạng này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO

1.3 Đặc ñiểm dịch tễ học của Salmonella

Con ñường phân-miệng là quan trọng nhất cho sự lây nhiễm Salmonella ở

ñộng vật Tuy nhiên vòng truyền bệnh còn phức tạp hơn nhiều ở một số loại vật ñông ñúc, ví dụ: ở gia cầm bệnh có thể xảy ra theo con ñường phân-miệng hoặc

từ trứng ñến gà con trong lò ấp Ở từng giai ñoạn khác nhau thì có một tỷ lệ ñộng vật mang trùng và chuồng trại mang mầm bệnh (James và cs., 1981)[59]

Ở mỗi loại vật chủ thì có Salmonella ký sinh và Salmonella không ký sinh Các Salmonella ký sinh ít gây bệnh cho các vật khác hơn vật chủ chính, vì chúng ñã thích nghi Salmonella dublin ký sinh thường xuyên trên trâu, bò;

nhưng cũng có thể thấy trên lợn ở một số vùng (McErlean, 1968)[61]; (Tamnock and Smith, 1972)[72]

Động vật non dễ nhiễm Salmonella hơn ñộng vật trưởng thành Thiếu ăn,

chất ñộn, thời tiết khắc nghiệt, stress khi phẫu thuật, sinh ñẻ, ký sinh trùng, vận chuyển, luyện tập quá nhiều, bị các bệnh do virus là tất cả các yếu tố dẫn ñến

Salmonellosis ở ñộng vật; rất nhiều loài vật bị bệnh suốt ñời Điều này ñặc biệt ñúng khi thức ăn của chó là loại thức ăn có chứa nhiều Salmonella

Động vật ñuợc nuôi bằng thức ăn bổ sung protein thường bị nhiễm các

serotype Salmonella (Pomeroy and Grady, 1961)[66] Bột thịt, bột xương, bột cá

và bột ñậu tương thường ô nhiễm nặng Salmonella nhiễm các loại vật liệu trên

trong hoặc sau chế biến Trong trường hợp ñối với bột thịt, bột xương, ở giai ñoạn ngâm chiết tách mỡ sau khi nấu là giai ñoạn quan trọng cho sự ô nhiễm: vi khuẩn duy trì và nhân lên trong vật liệu khi làm nguội

Salmonella có thể tồn tại một thời gian dài trong phân, chất ñộn chuồng,

bùn ở suối, ao hồ (Hendricks, 1971)[57]

Chim hoang dại và các loại gậm nhấm như: chuột đồng, chuột nhắt… cũng là nguồn gây nhiễm cho động vật qua phân nhiễm vào thức ăn hay chuồng trại (James và cs., 1981)[59]

1.4 Cách sinh bệnh của Salmonella

Salmonellosis thường gây nên viêm ruột và đơi khi gây nên hiện tượng mang trùng cấp tính và lan sang các cơ quan, tổ chức khác trong cơ thể Sẩy thai

và viêm não là hai biểu hiện ít thấy

Bệnh lý Salmonella gây viêm ruột thường chia làm 3 giai đoạn: Xâm nhập

vào ruột - Xâm nhiễm vào tế bào biểu mơ - Kích thích tiết dịch

a- Xâm nhập vào ruột: vi khuẩn xâm nhập vào đoạn giữa của ruột non Đây là bước đầu cần thiết cho sinh bệnh viêm ruột ở Salmonellosis Các vi khuẩn hình thoi cĩ sẵn trong biểu mơ ruột già thường xuyên tiết ra các loại axit

hữu cơ bay hơi kiềm hãm sự phát triển của Salmonella (Hentges and Maier,

1970)[58] Các yếu tố làm phá vỡ khu hệ vi khuẩn đường ruột như: kháng sinh dùng trong thức ăn và điều trị, sự mất nước; làm tăng tính mẫn cảm của cơ thể đối với bệnh thể viêm ruột và nhiễm trùng huyết (Nelson, 1974)[64]; Tamnock and Smith, 1972)[72]; Timoney và cs., 1978)[73]; Timoney và cs., 1988)[74]

Gia súc bị stress do vận chuyển sẽ làm tăng nhanh sự xâm nhiễm của Salmonella

(Williams, Newell, 1968) [79]

b- Sự xâm nhiễm vào tế bào biểu mơ ruột: Sự xâm nhiễm xảy ra ở nhung mao hồi tràng và kết tràng Riềm bàn chải là nơi vi khuẩn xâm nhập vào tế bào, nhưng chưa phá huỷ tế bào, chưa làm tế bào thay đổi hình dạng đến khi bệnh xuất hiện Vi khuẩn nhân lên và lan sang các tế bào xung quanh Ở đây vi khuẩn tiếp tục nhân lên và bị thực bào trong các hạch lâm ba

c- Kích thích tiết dịch: Cĩ những dấu hiệu của sự viêm hạch với sự tích nước, các ion HCO3- và Cl- (Grainello và cs., 1975)[53] Biểu hiện viêm hạch

cĩ thể là hệ quả của sự đáp ứng sự xâm nhiễm của Salmonella Tuy nhiên, một vài dịng của Salmonella typhimurium sinh ra nội độc tố (Sedlock và cs.,

1978)[68] Viêm ruột phát triển nhanh ở hồi tràng và kết tràng Tế bào bị hoại tử bong ra; sự cĩ mặt của chúng trong phân cĩ giá trị chẩn đốn Giai đoạn nhiễm

ñộc huyết trong Salmonellosis xuất hiện có liên quan ñến sự giải phóng nội ñộc

tố từ tế bào vi khuẩn Nội ñộc tố tác ñộng gây sốt, xuất huyết niêm mạc, tụ máu

ở gan và giảm glycogen, sự phân huỷ glycogen kéo dài dẫn ñến con vật bị sốc Cuối cùng là con vật chết

1.5 Miễn dịch chống Salmonella

Có sự thừa thận rằng: miễn dịch trung gian tế bào có tầm quan trọng hơn miễn dịch dịch thể trong việc chống lại Salmonellosis Wilcock và cs., 1992)[78] ñề nghị xem xét lại một cách nghiêm túc vấn ñề còn tranh cãi này Miễn dịch trung gian tế bào dựa trên cơ sở sự tăng hoạt ñộng diệt khuẩn của

tế bào vật chủ, không ñặc hiệu với serotype nào Miễn dịch dịch thể có tác dụng trung hoà vi khuẩn mang tính chất ñặc hiệu Miễn dịch cục bộ trong ñường ruột chưa ñược hiểu biết ñầy ñủ, nhưng sự ñáp ứng trung gian tế bào thể hiện ít quan trọng sự bảo vệ ñường ruột; kháng thể lipit A không có khả năng chống lại ñộc tố (Mullan và cs., 1974) [62] trừ khi yếu tố bổ thể xuất hiện quá mức (Galanos,…1977)[50]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chó ñược nuôi tại các hộ gia ñình trên ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột là ñối tượng nghiên cứu; bao gồm chó có nguồn gốc, ñộ tuổi khác nhau, khoẻ mạnh và mắc hội chứng tiêu chảy

Chó khoẻ mạnh là những con linh hoạt không có triệu chứng bệnh, thân nhiệt bình thường và ñặc biệt không tiêu chảy; chó mắc chứng tiêu chảy là những con bị tiêu chảy ñột ngột, ñi ỉa nhiều lần trong ngày và phân lỏng do có nhiều nước

Ở chó, tiêu chảy theo nghĩa hẹp là phân có lẫn nước Song trong thực tế ñịnh nghĩa này rộng hơn, bao gồm phân nhão hơn bình thường; có khi phân lẫn rất nhiều nước; phân rất lỏng; phân có màu sắc khác thường; cũng có khi

là dạng bánh như phân bò “cow pie” (David Mc Clugage, D.V.A.,C.V.A 2005)[47]

2.1.1 Địa ñiểm lấy mẫu

- Các hộ dân nuôi chó trên ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột;

- Chó từ 7 tháng tuổi: Tất cả các răng vĩnh viễn ñều mọc cao bằng nhau;

- Chó ñược 12 tháng tuổi: Các răng có hình hoa huệ màu trắng bóng;

- Chó trên 24 tháng: Bề mặt răng cửa của hàm dưới mòn bằng, răng cửa hàm trên bắt ñầu mòn

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để ñạt mục tiêu của ñề tài, chúng tôi nghiên cứu các nội dung sau: 2.2.1 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở ñàn chó nuôi trên ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột

2.2.1.1 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chó theo lứa tuổi; 2.2.1.2 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chó theo giống

2.2.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở ñàn chó nuôi trên ñịa bàn thành phố

Buôn Ma Thuột

2.2.3- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng

tiêu chảy nuôi trên ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột

2.2.3.1 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng tiêu chảy theo lứa tuổi;

2.2.3.2 Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chó khoẻ mạnh và chó mắc hội chứng tiêu chảy theo giống

2.2.4 Xác ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng Salmonella

phân lập ñược ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột

2.2.5 Xác ñịnh các serotype vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

2.2.6 Kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

2.2.7 Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược

2.2.7.1 Xác ñịnh khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột (enterotoxin); 2.2.7.2 Xác ñịnh khả năng xâm nhập

2.2.8 Kiểm tra sự mẫn cảm với một số thuốc kháng sinh và hóa dược

của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược

2.2.9 Điều trị thử nghiệm và ñề xuất một số phác ñồ ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chọn mẫu, lấy mẫu

2.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu: Phân ñược lấy trực tiếp từ trực tràng

hoặc lấy ngay khi con vật vừa thải phân; ñược ghi số hiệu và các thông tin cần thiết về vật nuôi: ñịa chỉ, tuổi, tình trạng sức khoẻ; phỏng vấn trực tiếp gia chủ về tình hình tiêm phòng, tẩy trừ ký sinh trùng …

Để ñảm bảo yêu cầu nhanh chóng trong việc lấy mẫu, chúng tôi sử dụng kỹ thuật kích thích hậu môn của chó

Mẫu sau khi lấy, ñược bảo quản trong thùng lạnh chuyển về phòng thí nghiệm khoa Chăn nuôi Thú y trường Đại học Tây nguyên; Labo vi sinh Viện

Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên ñể tiến hành làm các xét nghiệm

2.3.1.2 Phương pháp chọn mẫu

Mẫu nghiên cứu ñược chọn lấy tại 01 phường trung tâm, 01 phường vùng ven và 01 xã vùng xa thuộc ñịa bàn thành phố Buôn Ma Thuột theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng;

Tiến hành ñiều tra thử, sơ bộ xác ñịnh tỷ lệ nhiễm, sử dụng phần mềm WinEpiscope 2.0 tính toán xác ñịnh dung lượng mẫu cần lấy

2.3.2 Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chó nuôi tại thành phố Buôn Ma Thuột

Thu thập số liệu thứ cấp và trực tiếp ñiều tra, phỏng vấn các chủ hộ nuôi chó, nhân viên kỹ thuật của Bệnh xá Thú y - Chi cục Thú y, cán bộ nhân viên trạm Thú y và các phòng khám, ñiều trị bệnh cho ñộng vật cảnh trên ñịa

bàn thành phố Buôn Ma Thuột

2.3.3 Phương pháp phân lập, giám ñịnh vi khuẩn

Trong ñề tài này, chúng tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật xét nghiệm theo tiêu chuẩn của phòng nghiên cứu vi sinh vật thuộc Viện

vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên và phòng thí nghiệm của bộ môn Thú y - Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Tây Nguyên

Việc phân lập giám ñịnh Salmonella ñược áp dụng theo thường qui của

các tác giả: (Nguyễn Phú Quý, Phùng Đắc Cam, Lương Ngọc Trâm, 1991) [28]; (Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 1997) [31]; (Nguyễn Như Thanh, Phùng Quốc Chướng, 2006)[32]

2.3.4 Xác ñịnh ñộc lực vi khuẩn

Theo phương pháp của Carter G.R và cs 1995 [45]

Mỗi chủng vi khuẩn Salmonella tiêm cho 4 chuột, liều 0,5 ml canh

trùng nuôi cấy 24 giờ/370c vào phúc mạc Theo dõi số chuột nhắt trắng chết

và thời gian giết chết chuột của chủng vi khuẩn trong 7 ngày Chuột chết mổ khám xem bệnh tích, nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn

2.3.5 Xác ñịnh khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột (enterotoxin)

Bằng phương pháp phân ñoạn ruột lợn

Các chủng Salmonella ñược nuôi cấy trong môi trường nước thịt ở 370C trong 24 giờ, ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút, chắt lấy phần nước trong

ñể làm thí nghiệm Dùng lợn 30 – 45 ngày tuổi, trọng lượng 10 ñến 12kg, khoẻ mạnh và ñược tẩy ký sinh trùng ñường tiêu hoá; trước khi tiến hành thí nghiệm, cho lợn nhịn ñói 18 – 24 giờ

Cố ñịnh lợn, gây mê bằng Zoletin, sát trùng vùng bụng, mổ bộc lộ ruột non Trên ruột non dùng chỉ vô trùng thắt từng ñoạn ruột, mỗi ñoạn dài 3cm cách nhau 5cm; trên mỗi ñoạn ruột 3cm, tiêm 1ml dung dịch nước trong (thu ñược sau khi ly tâm cách khuẩn ở trên), ñoạn cuối cùng tiêm nước muối sinh

lý làm ñối chứng Sau ñó ñưa toàn bộ ruột vào xoang bụng khâu kín lại

Sau 24 giờ, mổ bộc lộ ruột, hút lượng dịch trong từng ñoạn ruột 3cm và tính kết quả theo công thức sau:

Kết quả dương tính = Lượng dung dịch trong từng ñoạn ruột (ml) > 1,5

Độ dài ñoạn ruột (cm)

2.3.6 Xác ñịnh khả năng xâm nhập

Bằng phản ứng Sereny test, 1955 (trích theo Nguyễn Thị Oanh, 2003)[25]

Vi khuẩn Salmonella phân lập ñược, nuôi cấy trong môi trường nước thịt

ñể tủ ấm 24 giờ, lấy làm canh khuẩn thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột lang khỏe mạnh, khối lượng 250 – 300g, thân nhiệt 37,80C – 39,50C; trước thí nghiệm nuôi chuột trong 3 ngày cho thích nghi, loại những chuột có mắt không bình thường

- Dùng micropipet với ñầu riêng biệt vô trùng hút và nhỏ vào màng tiếp hợp mắt của chuột lang 2 giọt canh khuẩn, mắt còn lại làm ñối chứng Hằng ngày kiểm tra thân nhiệt vào buổi sáng và triệu chứng viêm mắt chuột (2 lần/ngày sáng và chiều) Qua biểu hiện ở mắt chuột lang, ñánh giá 4 mức ñộ viêm: (+); (++); (++); (++++)

(-): Mắt không thay ñổi;

(+): Mắt ñỏ có nước mắt chảy ướt xung quanh;

(++): Mắt ñỏ, có dử ở khóe mắt;

(+++): Mắt ñỏ có nhiều dử ở xung quanh;

(++++): Mắt ñỏ, dử mắt rất nhiều, dính 2 mí mắt

Sau khi nhỏ mắt canh khuẩn, theo dõi chuột trong 2 tuần liền

2.3.7 Kiểm tra tính mẫn cảm của Salmonella phân lập ñược với

một số thuốc kháng sinh và hoá dược

Bằng phương pháp làm kháng sinh ñồ (theo Bauer - Kirby, 1990)

- Cấy các chủng Salmonella vào môi trường BHI, bồi dưỡng ở 370

C/8-10 giờ

- Đĩa thạch trước khi sử dụng ñể tủ ấm 370C trong 10-30 phút ñể làm khô bề mặt thạch và có nhiệt ñộ thích hợp

- Hút 0,5 ml canh khuẩn 370C/8-10 giờ nhỏ lên bề mặt ñĩa thạch, láng ñều cho canh khuẩn phủ kín bề mặt thạch, nếu canh trùng còn thừa thì dùng pipet hút hết, ñể tủ ấm 370C trong 15 phút cho khô

- Dùng pine gắp từng khoanh giấy ñã tẩm kháng sinh ñặt lên bề mặt thạch sao cho cách ñều nhau và ấn nhẹ cho các khoanh giấy tẩm kháng sinh tiếp xúc ñều với mặt thạch Lật ngược ñĩa thạch, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ

Đọc kết quả: Đường kính của vòng vô khuẩn ñược ño bằng thước ño từ phía sau mặt ñĩa Nếu cạnh của vòng vô khuẩn không rõ nét, phải ñọc khu vực

ức chế xấp xỉ 80% vi khuẩn không mọc Đường kính vòng vô khuẩn ñược tính bằng mm Kết quả ñược so sánh với bảng chuẩn do nhà cung cấp khoanh giấy tẩm kháng sinh quy ñịnh

Bảng 2.1 Đường kính vòng vô khuẩn chuẩn của các loại kháng sinh

Kháng sinh Hàm lượng Đường kính vòng vô khuẩn chuẩn (mm)

Đánh giá sự mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng cách so sánh ñường kính vòng vô khuẩn với bảng quy ñịnh ñường kính chuẩn Trong nghiên