2.2.6. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được.
2.2.7. Xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn
Salmonella phân lập được.
2.2.7.1. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột (enterotoxin); 2.2.7.2. Xác định khả năng xâm nhập.
2.2.8. Kiểm tra sự mẫn cảm với một số thuốc kháng sinh và hĩa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được. của vi khuẩn Salmonella phân lập được.
2.2.9. Điều trị thử nghiệm và đề xuất một số phác đồ điều trị hội chứng tiêu chảy ở chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột. tiêu chảy ở chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chọn mẫu, lấy mẫu
hoặc lấy ngay khi con vật vừa thải phân; được ghi số hiệu và các thơng tin cần thiết về vật nuơi: địa chỉ, tuổi, tình trạng sức khoẻ; phỏng vấn trực tiếp gia chủ về tình hình tiêm phịng, tẩy trừ ký sinh trùng …
Để đảm bảo yêu cầu nhanh chĩng trong việc lấy mẫu, chúng tơi sử dụng kỹ thuật kích thích hậu mơn của chĩ.
Mẫu sau khi lấy, được bảo quản trong thùng lạnh chuyển về phịng thí nghiệm khoa Chăn nuơi Thú y trường Đại học Tây nguyên; Labo vi sinh Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên để tiến hành làm các xét nghiệm.
2.3.1.2. Phương pháp chọn mẫu
Mẫu nghiên cứu được chọn lấy tại 01 phường trung tâm, 01 phường vùng ven và 01 xã vùng xa thuộc địa bàn thành phố Buơn Ma Thuột theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng;
Tiến hành điều tra thử, sơ bộ xác định tỷ lệ nhiễm, sử dụng phần mềm WinEpiscope 2.0 tính tốn xác định dung lượng mẫu cần lấy.
2.3.2. Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột
Thu thập số liệu thứ cấp và trực tiếp điều tra, phỏng vấn các chủ hộ nuơi chĩ, nhân viên kỹ thuật của Bệnh xá Thú y - Chi cục Thú y, cán bộ nhân viên trạm Thú y và các phịng khám, điều trị bệnh cho động vật cảnh trên địa bàn thành phố Buơn Ma Thuột.
2.3.3. Phương pháp phân lập, giám định vi khuẩn
Trong đề tài này, chúng tơi sử dụng các phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật xét nghiệm theo tiêu chuẩn của phịng nghiên cứu vi sinh vật thuộc Viện vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên và phịng thí nghiệm của bộ mơn Thú y - Khoa Chăn nuơi Thú y - Trường Đại học Tây Nguyên.
Việc phân lập giám định Salmonella được áp dụng theo thường qui của các tác giả: (Nguyễn Phú Quý, Phùng Đắc Cam, Lương Ngọc Trâm, 1991) [28]; (Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 1997) [31]; (Nguyễn Như Thanh, Phùng Quốc Chướng, 2006)[32].
2.3.4. Xác định độc lực vi khuẩn
Theo phương pháp của Carter G.R. và cs. 1995 [45]
Mỗi chủng vi khuẩn Salmonella tiêm cho 4 chuột, liều 0,5 ml canh trùng nuơi cấy 24 giờ/370c vào phúc mạc. Theo dõi số chuột nhắt trắng chết và thời gian giết chết chuột của chủng vi khuẩn trong 7 ngày. Chuột chết mổ khám xem bệnh tích, nuơi cấy phân lập lại vi khuẩn.
2.3.5. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột (enterotoxin)
Bằng phương pháp phân đoạn ruột lợn.
Các chủng Salmonella được nuơi cấy trong mơi trường nước thịt ở 370C trong 24 giờ, ly tâm 3000 vịng/phút trong 15 phút, chắt lấy phần nước trong để làm thí nghiệm. Dùng lợn 30 – 45 ngày tuổi, trọng lượng 10 đến 12kg, khoẻ mạnh và được tẩy ký sinh trùng đường tiêu hố; trước khi tiến hành thí nghiệm, cho lợn nhịn đĩi 18 – 24 giờ.
Cố định lợn, gây mê bằng Zoletin, sát trùng vùng bụng, mổ bộc lộ ruột non. Trên ruột non dùng chỉ vơ trùng thắt từng đoạn ruột, mỗi đoạn dài 3cm cách nhau 5cm; trên mỗi đoạn ruột 3cm, tiêm 1ml dung dịch nước trong (thu được sau khi ly tâm cách khuẩn ở trên), đoạn cuối cùng tiêm nước muối sinh lý làm đối chứng. Sau đĩ đưa tồn bộ ruột vào xoang bụng khâu kín lại.
Sau 24 giờ, mổ bộc lộ ruột, hút lượng dịch trong từng đoạn ruột 3cm và tính kết quả theo cơng thức sau:
Kết quả dương tính = Lượng dung dịch trong từng đoạn ruột (ml) > 1,5 Độ dài đoạn ruột (cm)
2.3.6. Xác định khả năng xâm nhập
Bằng phản ứng Sereny test, 1955 (trích theo Nguyễn Thị Oanh, 2003)[25].
Vi khuẩn Salmonella phân lập được, nuơi cấy trong mơi trường nước thịt để tủ ấm 24 giờ, lấy làm canh khuẩn thí nghiệm.
Động vật thí nghiệm là chuột lang khỏe mạnh, khối lượng 250 – 300g, thân nhiệt 37,80C – 39,50C; trước thí nghiệm nuơi chuột trong 3 ngày cho thích nghi, loại những chuột cĩ mắt khơng bình thường.
- Dùng micropipet với đầu riêng biệt vơ trùng hút và nhỏ vào màng tiếp hợp mắt của chuột lang 2 giọt canh khuẩn, mắt cịn lại làm đối chứng. Hằng ngày kiểm tra thân nhiệt vào buổi sáng và triệu chứng viêm mắt chuột (2 lần/ngày sáng và chiều). Qua biểu hiện ở mắt chuột lang, đánh giá 4 mức độ viêm: (+); (++); (++); (++++).
(-): Mắt khơng thay đổi;
(+): Mắt đỏ cĩ nước mắt chảy ướt xung quanh; (++): Mắt đỏ, cĩ dử ở khĩe mắt;
(+++): Mắt đỏ cĩ nhiều dử ở xung quanh; (++++): Mắt đỏ, dử mắt rất nhiều, dính 2 mí mắt.
Sau khi nhỏ mắt canh khuẩn, theo dõi chuột trong 2 tuần liền.
2.3.7. Kiểm tra tính mẫn cảm của Salmonella phân lập được với
một số thuốc kháng sinh và hố dược
Bằng phương pháp làm kháng sinh đồ (theo Bauer - Kirby, 1990). - Cấy các chủng Salmonella vào mơi trường BHI, bồi dưỡng ở 370C/8- 10 giờ.
- Đĩa thạch trước khi sử dụng để tủ ấm 370C trong 10-30 phút để làm khơ bề mặt thạch và cĩ nhiệt độ thích hợp.
- Hút 0,5 ml canh khuẩn 370C/8-10 giờ nhỏ lên bề mặt đĩa thạch, láng đều cho canh khuẩn phủ kín bề mặt thạch, nếu canh trùng cịn thừa thì dùng pipet hút hết, để tủ ấm 370C trong 15 phút cho khơ.
- Dùng pine gắp từng khoanh giấy đã tẩm kháng sinh đặt lên bề mặt thạch sao cho cách đều nhau và ấn nhẹ cho các khoanh giấy tẩm kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Lật ngược đĩa thạch, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ.
Đọc kết quả: Đường kính của vịng vơ khuẩn được đo bằng thước đo từ phía sau mặt đĩa. Nếu cạnh của vịng vơ khuẩn khơng rõ nét, phải đọc khu vực ức chế xấp xỉ 80% vi khuẩn khơng mọc. Đường kính vịng vơ khuẩn được tính bằng mm. Kết quả được so sánh với bảng chuẩn do nhà cung cấp khoanh giấy tẩm kháng sinh quy định.
Bảng 2.1. Đường kính vịng vơ khuẩn chuẩn của các loại kháng sinh Kháng sinh Hàm lượng Đường kính vịng vơ khuẩn chuẩn (mm)
Ampicilin (Am) 10 µg 16 – 22 Bactrim (Bt) 25 µg 23 – 29 Ciprofloxacin (Ci) 5 µg 30 – 40 Colistin (Co) 10 µg 11 – 15 Kanamycin (Kn) 30 µg 17 – 25 Neomycine (Ne) 30 µg 17 – 23 Tetracycline (Te) 30 µg 18 – 25 Stretomycin (Sm) 10 µg 12 – 20
Bactrim (Bt) cịn gọi là Trimazon, là sự phối hợp giữa 2 loại Sulfamid: Trimethoprim và Sulfamethoxazol theo tỷ lệ 1/5. (Phan Sỹ Lăng, Lê Thị Tài 1999) [19].
Đánh giá sự mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng cách so sánh đường kính vịng vơ khuẩn với bảng quy định đường kính chuẩn. Trong nghiên
cứu này, chúng tơi sử dụng các khoanh giấy tẩm kháng sinh do Cơng ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, Q.7, Tp Hồ Chí Minh) sản xuất, được cơng nhận đạt chất lượng theo tiêu chuẩn NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard). Dùng 8 loại kháng sinh hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường để làm thí nghiệm, với đường kính vịng vơ khuẩn chuẩn của các loại kháng sinh.
2.3.8. Xác định serotype vi khuẩn Salmonella
Các serotype Salmonella phân lập được bằng hệ thống định danh vi
khuẩn Vitex-2.
2.3.9. Thực nghiệm điều trị hội chứng tiêu chảy ở chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột bằng thuốc kháng sinh thành phố Buơn Ma Thuột bằng thuốc kháng sinh
Trên cơ sở kết quả kiểm tra sự mẫn cảm của Salmonella với thuốc kháng sinh, hố dược, chúng tơi xây dựng các phác đồ và tiến hành điều trị các ca bệnh tiêu chảy ở chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột.
2.4. Xử lý các số liệu
Xác định dung lượng mẫu nghiên cứu bằng phần mềm Win Episcope 2.0; Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel/2003 để tính: X%; Χ ±SE (Data Analysis/ Descriptive Statistics: Mean, Standard EEross);
So sánh sự sai khác giữa các tỷ lệ nhiễm bằng phép thử 2
χ của phần mềm Minitab 14.0 (Stat/ Tables/ Cross Tabulation and Chi-Square…).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở đàn chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột phố Buơn Ma Thuột
Bệnh viêm ruột tiêu chảy là bệnh phổ biến ở chĩ, bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường thấy nhiều vào mùa hè và mùa thu khi thời tiết ẩm nĩng và mưa ẩm ướt.
Chĩ là lồi vật nuơi sống gần gũi với con người; tuy nhiên phần lớn lồi vật nuơi này chưa được người nuơi chúng quan tâm đúng mức trong vấn đề chăm sĩc, nuơi dưỡng. Cĩ thể nĩi chĩ là một loại động vật ăn tạp nhất so với những lồi vật nuơi khác, đây là điều kiện để các lồi vi khuẩn cĩ cơ hội xâm nhập theo con đường thức ăn, nước uống gây nên hội chứng tiêu chảy ở lồi vật nuơi này.
Để đánh giá, tình hình bệnh xảy ra ở đàn chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột, chúng tơi tiến hành điều tra và kết quả như sau:
3.1.1. Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ theo lứa tuổi
Để tìm hiểu đàn chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột ở các độ tuổi khác nhau cĩ ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong do hội chứng tiêu chảy; chúng tơi tiến hành điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ theo lứa tuổi. Kết quả được trình bày tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ theo
lứa tuổi
Lứa tuổi
(tháng)
Số con điều tra
Bị tiêu chảy Chết do tiêu chảy
Số con Tỷ lệ mắc (%) Số con Tỷ lệ tử vong (%) < 2th 180 68 37,78 38 55,88 2 - < 4th 176 114 64,77 47 41,23 4 – 6th 192 94 48,96 35 37,23 > 6th 194 110 56,70 32 29,09 Tổng hợp 742 386 52,02 152 39,38
Biểu đồ 3.1. Tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ theo lứa tuổi 37.78 55.88 64.77 41.23 48.96 37.23 56.7 29.09 0 10 20 30 40 50 60 70 Tỷ lệ (%) < 2 tháng 2- <4 tháng 4 - 6 tháng > 6 tháng Tuổi B tiêu chy Cht do tiêu chy
Kết quả tại bảng 3.1 cho thấy: chĩ ở độ tuổi 2 - < 4 tháng cĩ tỷ lệ mắc cao nhất là 64,77%; tiếp đến chĩ ở độ tuổi > 6 tháng với tỷ lệ mắc 56,70%, chĩ ở độ tuổi 4 – 6 tháng cĩ tỷ lệ mắc 48,96% và thấp nhất là chĩ ở độ tuổi <2 tháng với tỷ lệ mắc là 37,78%.
Như vậy, chĩ ở các độ tuổi khác nhau thì tỷ lệ mắc hội chứng tiêu chảy cũng khác nhau (p = 0,000 < 0,05).
Theo chúng tơi, chĩ 2 - < 4 tháng, ở độ tuổi này chĩ vừa bú sữa mẹ vừa ăn thêm thức ăn do con người cung cấp hoặc tự tìm kiếm ở mơi trường; mặt khác ở độ tuổi này hệ thống tiêu hố của chĩ chưa hồn chỉnh, các răng sữa bắt đầu rụng và dần được thay bằng các răng vĩnh viễn nên chúng rất thích gặm, cắn và tha đi các vật dụng. Chính những đặc điểm này đã tạo nhiều cơ hội cho mầm bệnh từ bên ngồi xâm nhập vào bên trong cơ thể chĩ theo đường tiêu hố làm cho tỷ lệ mắc ở chĩ từ 2 - < 4 tháng tuổi là cao nhất.
Ngược lại chĩ ở độ tuổi < 2 tháng, giai đoạn chĩ theo mẹ, nguồn thức ăn chính là sữa mẹ nên chúng được tiếp thu một nguồn dinh dưỡng tốt và một lượng lớn kháng thể từ sữa mẹ. Mặt khác, ở độ tuổi này phạm vi hoạt động hẹp, ít tiếp xúc với mơi trường ngồi, điều kiện để gặp gỡ mầm bệnh là thấp
nhất do đĩ chĩ < 2 tháng tuổi tỷ lệ mắc hội chứng tiêu chảy là thấp nhất. Kết quả tại biểu 3.1 cũng cho thấy: tỷ lệ tử vong ở chĩ mắc hội chứng tiêu chảy giảm dần khi độ tuổi chĩ tăng; giảm từ 55,88% ở chĩ < 2 tháng đến 41,23% ở chĩ 2 - < 4 tháng đến 37,23% ở chĩ 4 – 6 tháng và 29,09% là tỷ lệ thấp nhất ở chĩ > 6 tháng tuổi.
Khi mắc hội chứng tiêu chảy, tỷ lệ tử vong cũng cĩ sự khác biệt ở chĩ các độ tuổi khác nhau (p = 0,005 < 0,05).
Ở độ tuổi < 2 tháng, chĩ chưa thích nghi với mơi trường sống, hệ thần kinh của chĩ phát triển chưa hồn thiện, hệ tiêu hố chưa hồn chỉnh (chưa đủ các men tiêu hố, hàm lượng axit HCl tự do ít), với thức ăn là sữa mẹ lại cĩ hàm lượng protein cao; vì thế khi một yếu tố bệnh nguyên nào đĩ tác động làm giảm quá trình tiêu hố và hấp thu, gây rối loạn tiêu hố, thức ăn tích lại trong dạ dày lên men thối rữa protein, tạo mơi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển mạnh tăng cả về số lượng và độc lực. Mặt khác, độc tố do vi khuẩn tiết ra kích thích co bĩp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá huỷ tổ chức tế bào biểu mơ, làm rối loạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải nên khi bị tiêu chảy, con vật bị mất nước trầm trọng; việc bù nước cho chĩ ở độ tuổi này bằng con đường “tĩnh mạch” lại gặp rất nhiều khĩ khăn. Hơn nữa, việc chăm sĩc, nuơi dưỡng chĩ nĩi chung, chĩ < 2 tháng tuổi nĩi riêng phần lớn ở người nuơi chúng chưa thật sự quan tâm; chính những yếu tố trên làm cho tỷ lệ tử vong ở chĩ < 2 tháng tuổi khi mắc hội chứng tiêu chảy là cao nhất.
Ngược lại, chĩ > 6 tháng tuổi đã thích nghi với mơi trường sống, hệ thần kinh, hệ tiêu hố hồn chỉnh, khả năng chống bệnh cao hơn nên khi mắc hội chứng tiêu chảy, hoặc được can thiệp kịp thời hoặc cơ thể điều chỉnh chúng thường tự khỏi bệnh và chuyển dạng miễn dịch mang trùng; nên tỷ lệ tử vong do hội chứng tiêu chảy ở chĩ > 6 tháng tuổi là thấp nhất.
3.1.2. Điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ theo giống
Hiện nay tại thành phố Buơn Ma Thuột, chĩ nuơi cĩ nguồn gốc rất đa dạng nhưng cĩ thể phân chia làm 3 dạng như sau:
*/ Chĩ nội: thường thấy giống chĩ Phú Quốc và giống chĩ vàng của đồng bào M’Nơng.
*/ Chĩ ngoại: thường thấy các giống chĩ kiểng dẫn đường (Chihuahua), chĩ kiểng lơng xù Nhật Bản (Japanese Chin), chĩ kiểng tai bướm (Papillon and Phalene), chĩ xù lùn Bắc Kinh (Pekingese), chĩ xù Tây Ban Nha (Spaniel), chĩ Berger, chĩ Rottweiler, chĩ Fox …
*/ Chĩ lai: là các giống chĩ do quá trình giao phối tự nhiên giữa các giống nội, giống ngoại với nhau tạo nên, cịn gọi là chĩ tạp (giống chĩ này chiếm đa số tại thành phố Buơn Ma Thuột).
Kết quả điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở các giống chĩ được tổng hợp tại bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả điều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở chĩ theo
giống
Giống Số con điều tra
Bị tiêu chảy Chết do tiêu chảy
Số con Tỷ lệ mắc (%) Số con Tỷ lệ tử vong (%)
Chĩ nội 90 37 41,11 9 24,32
Chĩ ngoại 170 62 36,47 38 61,29
Chĩ lai 482 287 59,54 105 36,59
Tổng hợp 742 386 52,02 152 39,38
Kết quả tại bảng 3.2 cho thấy đàn chĩ nuơi tại thành phố Buơn Ma Thuột mắc hội chứng tiêu chảy với tỷ lệ 50,02% và tỷ lệ tử vong do hội chứng tiêu chảy gây nên là 39,38%; tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong do hội chứng tiêu chảy ở các giống chĩ khác nhau cĩ sự sai khác rất rõ (p = 0,000 < 0,05), cụ thể:
Tỷ lệ mắc cao nhất ở giống chĩ lai (59,54%), tiếp đến là giống chĩ nội (41,11%) và thấp nhất (36,47%) là tỷ lệ mắc ở giống chĩ ngoại. Ngược lại, tỷ lệ tử vong do hội chứng tiêu chảy gây nên chiếm tỷ lệ cao nhất ở giống chĩ ngoại với 61,29% và thấp nhất ở giống chĩ nội với tỷ lệ 24,32%.
Biểu đồ 3.2. Tình hình hội chứng tiêu chảy ở các giống chĩ