nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase trong sản xuất carrageenan từ rong sụn (kappaphycus alvarezii (doty) doty)

Thành phần hoá học chủ yếu của rong sụn là carrageenan, chiếm 40 - 55% trọng lượng rong khô.Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về rong sụn chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nuôi trồng v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về rong sụn 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của rong sụn 5

1.1.3 Thành phần hóa học của rong sụn 6

1.2 Giới thiệu về carrageenan 7

1.3 Quy trình sản xuất carrageenan 18

1.4 Tổng quan về chế phẩm enzyme thủy phân polysaccharirde 20

1.4.1 Viscozyme – L 20

1.4.2 Chế phẩm Pectinex Ultra SP – L 22

1.5 Tổng quan công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng enzyme polysaccharase 24

CHƯƠNG II : NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu 27

2.2.2 Phương pháp phân tích 27

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28

2.2.3.1 Quy trình dự kiến cho việc thu nhận carrgeenan 28

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết 31

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 39

2.3 Các hóa chất và thiết bị chủ yếu đã sử dụng 39

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ XỬ LÝ RONG BẰNG CHẾ PHẨM ENZYME POLYSACCHARASE 40

3.1.1 Xác định tỷ lệ enzyme/rong thích hợp cho quá trình xử lý rong 40

3.1.2 Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình xử lý 47

3.1.3 Kết quả xác định pH thích hợp cho quá trình xử lý rong 52

3.1.4 Tối ưu hóa quá trình xử lý rong 57

3.2 XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ NẤU CHIẾT RONG 66

3.2.1 Xác định thời gian nấu thích hợp 66

3.2.1 Xác định tỷ lệ nước/rong thích hợp cho quá trình nấu rong 68

3.3 Đề xuất quy trình sản xuất carrageenan 70

Phân tích tính khả thi của quy trình 73

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 74

1 KẾT LUẬN 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 30

Phụ lục 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 30

Phụ lục 2: CÁC KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 34

Phụ lục 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM TỐI ƯU HÓA CHẾ ĐỘ XỬ LÝ RONG 41

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững có ý nghĩa quyết định đến sự phát triển ngành thủy sản, một ngành kinh tế mũi nhọn và có vai trò quan trọng trong cơ cấu các ngành kinh tế của đất nước Trong ngành nuôi trồng thủy sản, bên cạnh phát triển nuôi tôm, cá, nhuyễn thể thì lĩnh vực nuôi trồng rong biển tại các vùng ven biển với chiều dài hàng ngàn cây số và các vùng biển đảo của đất nước có một vai trò vô cùng quan trọng không chỉ vì phát triển kinh tế mà còn vì để khẳng định chủ quyền biển đảo Trước đây, Việt Nam đã nuôi trồng một số loài rong truyền thống có giá trị kinh tế cao như: rong câu, rong mơ, Hiện nay, các nhà khoa học Việt Nam đã tuyển chọn, di nhập một số loại rong mới để nuôi trồng thử nghiệm và phát triển thành nghề mới cho ngư dân nhằm khai thác tiềm năng mặt nước biển và đa dạng hóa nguồn nguyên liệu thuỷ sản Trong số các loài rong mới được du nhập và phát triển vào Việt

Nam, rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loại rong có giá trị kinh tế cao và

phát triển tốt ở nhiều vùng biển tại Việt Nam Nuôi trồng rong sụn đã nhanh chóng phát triển thành một nghề của ngư dân các tỉnh như Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Kiên Giang Tuy nhiên, công nghệ chế biến rong sụn và carrageenan từ rong sụn ở Việt Nam còn hạn chế nên rong sụn khô nguyên liệu ít được tiêu thụ trong nước mà chỉ thuần túy xuất khẩu nguyên liệu thô Chính vì vậy, nghề nuôi trồng rong phát triển không bền vững, dễ lâm vào tình trạng khủng hoảng giống như việc phát triển nuôi tôm sú hay cá tra một cách tự phát tại nước ta trong thời gian qua Mặt khác, giá trị gia tăng do việc chế biến rong và ứng dụng carrageenan ở trong nước còn thấp, thường trong tình trạng khai thác và xuất khẩu rong nguyên liệu

Rong sụn là nguyên liệu để sản xuất carrageenan một loại polysaccarid được biết

và sử dụng từ lâu Thành phần hoá học chủ yếu của rong sụn là carrageenan, chiếm 40

- 55% trọng lượng rong khô.Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về rong sụn chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nuôi trồng và thu nhận carrageenan từ rong sụn theo quy trình xử

lý rong bằng acid hay kiềm Phương pháp xử lý này sản xuất ra carrageenan có nhược điểm

là carrageenan thu được thường lẫn với hóa chất nên quá trình tinh chế gặp nhiều khó khăn

Do vậy tôi tiến hành “Nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase trong sản xuất carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty)”

Mục tiêu của đề tài

Đánh giá khả năng sử dụng enzyme polysaccharase thay thế cho việc dùng acid

và kiềm trong quá trình xử lý rong để sản xuất carrageenan từ rong sụn K alvarezii

nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường do công nghệ sản xuất truyền thống gây ra

Nội dung đề tài

1) Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase (trong số: Viscozyme L và Pectinex Ultra SP) phù hợp cho mục đích xử lý rong sụn để thu nhận carrageenan 2) Xác định các thông số thích hợp cho quy trình công nghệ sử dụng enzyme polysaccharase đã lựa chọn để xử lý rong sụn thu nhận carrageenan: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian xử lý, pH, thời gian nấu chiết và tỷ lệ nước/nguyên liệu

3) Đề xuất quy trình công nghệ sử dụng enzyme polysaccharase đã lựa chọn để

xử lý rong sụn sản xuất carrageenan

4) Đánh giá chất lượng carrageenan sản xuất theo phương pháp enzyme so với phương pháp sử dụng hóa chất

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đây là một trong những nghiên cứu mới trong nước về sản xuất carragenan bằng phương pháp enzyme

- Kết quả đề tài góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về enzyme polysaccharase và khả năng ứng dụng của nó trong quy trình sản xuất carrageenan từ

lớn nhất

Rong sụn được Doty lần đầu tiên phát hiện ở Creagh Reef - vùng biển phía Nam

của Semporna, Sabah, Malaysia và đặt tên là Eucheuma alvarezii Doty 1985 Năm

1987, Silva, Meñez và Moe tìm thấy rong sụn ở Philippine Vì vậy, người ta gọi loài

này là Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P C Silva Ngày nay, người ta tiến hành

nuôi trồng rong sụn ở nhiều nước trên thế giới [19]

Hình 1.1 Hình ảnh về rong sụn tươi

Hiện nay, rong sụn được triển khai nuôi trồng ở nhiều quốc gia khác trên thế giới Có thể nói, Philippine là một trong số các quốc gia đi đầu trong việc phát triển nghề nuôi trồng rong sụn Philippine cũng nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất nhiều sản phẩm mới từ rong sụn và carrageenan thu nhận từ rong sụn để ứng dụng trong đời sống, sản xuất và xuất khẩu Nhiều cơ sở chế biến rong sụn đã được xây dựng ở Philippine và nghề trồng rong sụn cũng như công nghiệp chế biến rong sụn trở thành một ngành sản xuất mới phát đạt trong những năm qua tại đảo quốc này [9]

Từ sự thành công của Philippine, rong sụn được phát triển sang các nước lân cận Tại Indonesia, người ta cũng thử nghiệm nuôi trồng rong sụn và nhận thấy rong sụn có thể phát triển tốt ở đây do có điều kiện tự nhiên tương tự Philippine Ở Đông

Nam Á, Thái Lan cũng đang tiến hành trồng thử nghiệm rong sụn tại vùng biển Phuket Trung Quốc đã chú trọng đầu tư nghiên cứu nuôi trồng và chế biến rong sụn Tại Châu Phi, Kenya là quốc gia đầu tiên thử nghiệm nuôi trồng rong sụn nhưng Tanzania lại là quốc gia nuôi trồng rong sụn có sản lượng lớn Ngoài ra, nhiều nước khác cũng quan tâm phát triển nuôi trồng và chế biến rong sụn Năm 2003 tổng sản lượng trên thế giới (chủ yếu là Philippine, Indonesia, Tanzania) đạt khoảng 150.000 tấn khô Vì thế nhiều nhà khoa học xếp rong sụn vào thực đơn quan trọng của con người của thế kỷ 21 [6], [19]

Bảng 1.1 Sản lượng rong sụn của một số nước trên thế giới (2001) [24]

(km)

Tổng sản lượng (tấn khô/năm)

Rong sụn được Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang di nhập từ Philippines về Việt Nam tháng 3 năm 1993, đến tháng 11 năm 1993 lần đầu tiên rong sụn được trồng thử nghiệm tại đầm Sơn Hải Kết quả thật bất ngờ, từ 5 kg rong giống ban đầu sau 8 tháng trồng đã phát triển 20 tấn, phơi ra 2,5 tấn rong khô bán với giá 10.000 đồng/kg, sau khi trừ chi phí còn lãi gần 15 triệu đồng Năm 2002, người dân thử nghiệm đưa rong sụn ra trồng trực tiếp trên biển thành công, để từ đó đến nay diện tích không ngừng gia tăng Đến năm 2005, sản lượng rong sụn của Ninh Thuận đã đạt 1.320 tấn khô, chiếm 40% sản lượng rong khô cả nước Năm 2007, rong sụn tại Ninh Thuận bước đầu xuất khẩu sang một số nước châu Âu như Pháp, Canada, … [3]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của rong sụn [6]

Rong sụn là loài sinh trưởng phát triển nhanh, từ 100 gram rong giống ban đầu sau sau một năm nuôi trồng có thể tăng trưởng thành bụi rong nặng tới 14 – 16 kg Thân rong dạng hình trụ tròn, đường kính thân chính khi phát triển cực đại có thể đạt tới 20mm Thân chứa nhánh phân bố không theo quy luật Khi đang sinh trưởng trong nước biển thân rong hơi nhớt, có màu xanh nâu, thân rong giòn, dễ gãy Rong sụn tươi thường có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu do trong ronng có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll Sau khi thu hoạch, phơi khô rong sụn thường có màu vàng nâu, thể tích giảm đến ¾ so với khi ở trong nước biển và có trạng thái rắn chắc

Nhiệt độ thích hợp nhất cho rong sụn sinh trưởng và phát triển là từ 250C -

280C Nhiệt độ cao hơn 300C và thấp hơn 200C sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng của rong Nếu nhiệt độ thấp hơn 180C thỉ rong sẽ ngừng phát triển

Rong sụn là loại ưa mặn, chúng chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở nơi có độ mặn cao (28 – 320/00), ở độ thấp (18 – 200/00) rong sụn chỉ tồn tại trong thời gian ngắn (5 – 7 ngày) và nếu kéo dài nhiều ngày rong sẽ ngừng phát triển, có hiện tượng đứt gãy

và dẫn đến lụi tàn

Rong sụn thuộc ngành tảo đỏ Rhodophyta có chứa sắc tố chlorophyll và

phycobline nên rong sụn chỉ thích nghi với ánh sáng có bước sóng ngắn với cường độ ánh sáng không cao, từ 12.000 – 15.000 lux, thích hợp nhất từ 30.000 – 50.000 lux Ánh sáng quá thấp hoặc quá cao thì đều ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của rong Rong sụn phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển (tạo ra do dòng chảy, dòng triều hay sóng bề mặt), đây là yếu tố cực kỳ quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và phát triển cũng như chất lượng của rong sụn Trong điều kiện nhiệt độ không quá cao, nước được trao đổi thường xuyên, rong sụn hầu như không đòi hỏi nhiều về các chất dinh dưỡng có sẵn trong nước đủ cung cấp cho rong sụn phát triển Tốc độ tăng trưởng của rong sụn cao nhất vào khoảng tuần thứ 2 đến tuần thứ 4, khi kích thước rong ở 200 – 700g/cụm Khi rong đạt trung bình trên 1000g/cụm (ở tuần thứ 5 hoặc thứ 6) tốc độ sinh trưởng của rong giảm dần, hàm lượng kappa- carrageenan càng cao khi kéo dài thời gian trồng Do đó để đảm bảo

cho việc nuôi trồng rong sụn có năng suất và chất lượng cao, thời gian thu hoạch rong

ít nhất sau 2 tháng trồng là hợp lý

Rong sụn và đa số các loài rong khác co mùi tanh đặc trưng, mùi của rong sụn

là yếu tố phức tạp được cấu thành bởi nhiều yếu tố trong đó có sự tham gia đáng kể của bihenic acid, là loại acid do vi khuẩn sống trên thân rong sinh ra Các vi khuẩn này

có rất nhiều trong nước biển Để khử mùi rong sụn, người ta có thể phơi rửa rong nhiều lần bằng nước sạch hoặc ngâm trong nước gạo, dấm ăn, nước trà,…

1.1.3 Thành phần hóa học của rong sụn

Thành phần chính của rong sụn là carrageenan Hàm lượng carrageenan có thể chiếm đến 40% trọng lượng khô của rong Trong đó, carrageenan tan chiếm khoảng 33% và carrageenan không tan chiếm 7% Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn nguyên liệu thu hoạch ở biển , phơi nắng đến độ ẩm khoảng 20% rửa sạch bằng nước sinh hoạt và sấy khô ở 400C - 500C để đạt trở lại độ ẩm 19 – 20% thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của rong sụn [6]

Thành phần Hàm

lượng

Đơn vị tính Thành phần Hàm lượng Đơn vị tính

Rong sụn có chứa hàm lượng tro rất đáng kể Khi xử lý chế biến rong thành phẩm thì hàm lượng tro còn lại so với lúc chưa xử lý là 6/10 (khoảng 16% chất khô) Như vậy, sau khi xử lý lượng khoáng bám ở lớp bên ngoài rong đã bị giảm đi khá nhiều Nhưng trong rong sụn sau xử lý vẫn chứa nhiều loại nguyên tố vi lượng như:

Fe, Cu, Mg, Zn, Ca, Na, K…và các chất phi kim loại như I, S, P…đây là các chất cần thiết cho cơ thể con người Ngoài ra, trong rong nuôi ở môi trường ô nhiễm có thể chứa các ion kim loại nặng như: Hg, As, Pb, Cd…Nhưng nhiều nghiên cứu về rong sụn cho thấy hàm lượng các chất này đều ở dưới mức độ cho phép của tiêu chuẩn bộ Y

Tác hại của quá trình biến đổi này là làm cho chất lượng keo rong giảm cụ thể

là độ nhớt của keo rong giảm do kích thước phân tử keo rong ngắn hơn

1.2 Giới thiệu về carrageenan [12] [17], [19]

Carrageenan là một loại polysaccaride tìm thấy trong các loài rong đỏ như:

Chondrus, Gigartina, Eucheuma, Furcellaria, Phyllophora,… từ những năm 1837 Stanford (1862) đã đặt tên lọai polysaccaride được chiết bằng nước từ loài Chondrus crispus là “carrageenin” Việc tinh sạch chúng bằng phương pháp kết tủa cồn đã được

thực hiện vào năm 1871 Tên gọi “carrageenan” được đề nghị và được Ủy Ban Danh pháp carbohydrate của Hội Hóa học Mỹ thông qua Nhưng việc sản xuất carrageenan

chỉ thực sự được quan tâm trong những thập niên 1930 khi một số công ty ở bờ biển phía Tây nước Mỹ phát hiện ra carrageenan có độ nhớt cao và có khả năng tạo gel Hiện nay, các nước sản xuất carrageenan chủ yếu là: Mỹ, Đan Mạch, Pháp, Nhật, Tây Ban Nha, Trung Quốc, Hàn Quốc, Brazil, Philippine,… [3], [17]

Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu sản xuất carrageenan từ những năm 1970 Ban

đầu họ dùng loại rong Eucheuma gelatinae có ở đảo Hải Nam làm nguyên liệu tách chiết và sau đó loại rong Hypnea sp

Carrageenan có nhiều tính chất ưu viêt hơn agar nên hiện được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm Do khả năng ứng dụng của carrageenan trong lĩnh vực chế biến sữa và công nghệ sinh học tốt hơn agar nên việc sản xuất carrageenan tăng lên khá nhanh và gần đây đã vượt qua agar Sản lượng carrageenan sản xuất hàng năm trên thế giới khoảng 50.000 tấn (năm 2009) trong đó, Trung Quốc chiếm khoảng 600 tấn

Carrageenan là một polyme mạch thẳng, chứa khoảng 25.000 phân tử galactose, với liên kết luân phiên của các phân tử βD-galactose pyranose qua liên kết 1,3 và α D-galactose pyranose qua liên kết 1,4 (Hình 1.2) [19]

Hình 1.2 Cấu tạo của carrageenan với các liên kết luân phiênβD-galactose

pyranose và α D-galactose pyranose

Carrageenan là một polysaccharid của galactose gọi là galactan Đơn vị cấu trúc của carrageenan (Car) là một disaccharid, được cấu tạo bởi hai hợp phần Đơn vị hợp phần thứ nhất có thể là vòng α (1-3)-D-galactose (đơn vị G), vòng β(1-4)-D-galactose (đơn vị D) hoặc vòng β(1-4)-3,6-anhydro-D-galactose (đơn vị DA) xen kẽ luân phiên nhau bằng các liên kết α(1-3) và β(1-4) Đơn vị cấu trúc của carrageenan được trình bày trên hình 1.3 và hình 1.4 Carrageenan là một galactan sulphate Ngoài mạch polysaccharid chính còn có thể có các nhóm sulphate được gắn vào carrageenan ở những vị trí và số lượng khác nhau Các carrageenan có mức độ sulphate hóa khác nhau và phụ thuộc vào mức độ sulphate, các carrageenan có ký hiệu riêng Ví dụ: κ -

carrageenan (25% sulphate), ι - carrageenan (32% sulphate), λ– carrageenan (35% sulphate) [19]

Theo “Đơn vị cấu trúc” có thể chia Carrageen thành 2 nhóm:

- Carrageenan (G, D): nhóm carrageenan không có liên kết 3,6 Galactose có đơn vị cấu trúc (G, D) như µ- Carrageenan (Hình 1.3)

-anhydro-D Carrageenan (G, DA): nhóm carrageenan có liên kết 3,6-anhydro-D anhydro-anhydro-D D-anhydro-D Galactose có đơn vị cấu trúc (G, DA) như κ- Carrageenan (Hình 1.4) [19]

Hình 1.3 Đơn vị cấu trúc của Hình 1.4 Đơn vị cấu trúc của

µµµ- Carrageenan (G, D) κκκ- Carrageenan (G, DA)

Trong quá trình chiết tách, do tác động của môi trường kiềm các carrageenan có đơn vị cấu trúc (G, D) dễ chuyển thành các carrageenan có đơn vị cấu trúc (G, DA) Các µ-, ν-, λ- carrageenan dễ chuyển hóa thành κ-, ι, θ- carrageenan tương ứng

Các Car có phân tử lượng từ 500 - 1000 kDa, trong đó chúng có thể chứa tới 25% thành phần với phân tử lượng nhỏ dưới 100 kDa

Cấu tạo của carrageenan phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và các điều kiện tách chiết Các liên kết ở vị trí số 3 xuất hiện ở các gốc có sulphate ở vị trí 2 và 4 hoặc không có sulphate trong khi liên kết ở vị trí số 4 ở các gốc có sulphate ở vị trí số 2: gốc 2,6 disulphate, gốc 2,6 anhydro và 3,6 anhydro -2-sulphate Người ta không gặp các loại carrageenan có gốc sulphate ở vị trí số 3 Người ta cũng gặp gốc pyruvat ở

carrageenan tách chiết từ rong Gigartina Các loại carrageenan có gốc pyruvat được

gọi là Pi-carrageenan Nhóm methoxyl cũng có trong các polysaccharide sulphate hóa

từ các loài rong thuộc giống Grateloupiaceae

Trong hai thập niên 60 và 70, đã có các công trình nghiên cứu cho thấy carrageenan có nhiều dạng cấu trúc khác nhau Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sulphate hóa, vị trí sulphate hóa, mức độ hydrate hóa Chẳng hạn mu và nu được xem

là các chất ban đầu để tổng hợp nên kappa và iota Do vậy, các nhà nghiên cứu đã chia

carrageenan thành các loại sau: mu, kappa, nu, iota, lambda, theta và xi - carrageenan Một số dạng cơ bản của carrageenan như sau:

- κ- carrageenan (kappa-carrageenan) là một loại carrageenan được dùng thông dụng nhất Tính chất quan trọng nhất của chúng là sức tạo gel cao và tương tác mạnh với protein sữa Trên thế giới, carrageenan được sản xuất chủ yếu là dạng kappa - carrageenan, dạng này chiếm khoảng 70% tổng sản lượng trên carrageenan thế giới

Hình 1.5 κ-carrageenan được tạo ra từ µ-carrageenan [19]

- µ-carrageenan là lọai carrageenan sau khi xử lý kiềm thì chuyển thành carrageenan µ-Carrageenan hầu hết được tách chiết từ rong biển nhiệt đới

kappa-Kappaphycus alvarezii

- Iota-carrageenan là một loại carrageenan có lượng sulphate nằm trung gian giữa kappa và lambda - carrageenan Iota-carrageenan hình thành gel đàn hồi với những tính chất đông, tan giá và chữa vết thương tốt ν -carrageenan sau khi được xử lý kiềm thì được chuyển thành iota-carrageenan ν -carrageenan hầu hết được tách chiết từ

rong biển (Eucheuma denticulatum) có ở Philippine

Hình 1.6 ι -carrageenan được tạo ra từ ν -carrageenan [19]

- carrageenan là một loại carrageenan có mức sulphate cao carrageenan không tạo gel Về phương diện thương mại, carrageenan được tách chiết

Lambda-từ rong biển dưới dạng một hỗn hợp kappa/lambda

Lambda-carrageenan (phần lớn được tách chiết từ Gigartina pistillata hoặc Chondrus crispus) sau khi xử lý kiềm thì được chuyển thành θ-carrageenan (theta-carrageenan), nhưng ở một tốc độ chậm hơn so với những nguyên nhân tạo ra ι -carrageenan và κ-carrageenan [12]

Hình 1.7 λ-carrageenan chuyển thành θ-carrageenan

nó tan trong nước ở điều kiện bất kỳ

Độ nhớt

Độ nhớt của các dung dịch carrageenan phụ thuộc vào nhiệt độ, dạng, trọng lượng phân tử và sự hiện diện của các ion khác trong dung dịch Khi nhiệt độ và lực ion của dung dịch tăng thì độ nhớt của dung dịch giảm Các carrageenan tạo thành dung dịch có

độ nhớt từ 25 – 500 Pa.s, riêng κ–carrageenan có thể tạo dung dịch có độ nhớt tới 2000 Pa.s

Tương tác giữa carrageenan với protein

Tương tác giữa carrageenan với protein là một trong những tính chất quan trọng của carrageenan và cũng là đặc trưng cho tất cả các chất tạo gel cũng như các chất

1không tạo gel là xuất hiện phản ứng với protein Sự cân bằng của tương tác giữa Car và Car-protein xác định lực của gel Phản ứng giữa Car và protein xảy ra nhờ các cation có mặt trong các nhóm protein tác dụng với nhóm sulphate mang điện âm của carrageenan và có tính quyết định đến độ bền cơ học của gel Vi cấu trúc của carrageenan và protein được quan sát bằng kính hiển vi điên tử quét [19]

Car-Hình 1.8 Tương tác tĩnh điện giữa các nhóm sulphat của carrageenan và protein

Trong công nghiệp sữa, nhờ vào tính chất liên kết với các protein trong sữa mà carrageenan được sử dụng (với nồng độ 0,015 – 0,025 %) làm tác nhân để ngăn chặn

sự tách lỏng và làm ổn định các hạt coca trong sữa sôcôla Protein có mặt trong sữa bao gồm hai dạng chính: casein chiếm 80% và các dạng hòa tan 20% Khả năng hiệp lực liên quan đến tương tác của các Car tích điện âm với amino axit tích điện dương tại

bề mặt mixell của casein, ví dụ như giữa κ- Car và κ- casein

Trong dung dịch sữa loãng, κ- Car tạo phức với các mixell casein gây kết tủa chỉ khi nó có mặt ở dạng xoắn lò xo Sự tạo gel của hỗn hợp κ- Car và sữa bao gồm t-ương tác của mixell casein của sữa với một phần của phân tử Car

Tương tác hiệp lực của carrageenan với các polysaccharide khác [19]

Ngoài tương tác với protein, κ- carrageenan còn tương tác với các polysaccharid khác, thí dụ như với galactomannan gum, đặc biệt với locust bean gum (LBG) Cơ chế của tương tác trên được giả thiết là xuất hiện các liên kết của vùng khung xương của galactomanan với tập hợp xoắn kép của κ- carrageenan (hình 1.9)

Việc thêm galactomanan vào gel κ- carrageenan làm thay đổi hình thái và tính chất cơ học của gel từ cứng, dễ vỡ thành gel đàn hồi, đồng thời làm tăng đáng kể cường độ gel Vai trò của cation cũng rất quan trọng trong sự tương tác và hiệp lực để tạo gel của hệ κ- carrageenan/LBG Sự tạo gel của hệ này chỉ xuất hiện khi κ-

carrageenan ở dạng muối K+, còn khi κ- carrageenan ở dạng muối Na+ và Ca2+ thì hệ không có khả năng tạo gel mà các cation này chỉ làm tăng độ nhớt [19]

Hình 1.9 Tương tác giữa carrageenan và galactomannan

Sự tạo gel của hệ κ-Car/LBG tương tự như sự tạo gel của κ-Car nguyên chất nhưng ở nồng độ không nhỏ hơn 0,2M KCl thì sự hiệp lực của hệ biến mất Khả năng hiệp lực của hệ κ-Car/LBG phụ thuộc vào các yếu tố sau: nồng độ của κ-Car, LBG, dạng

và nồng độ của cation và tỷ lệ mannan : galactose trong phân tử LBG (hay nói cách khác phụ thuộc vào mức độ thay thế của D-galactose theo dọc khung xương galactomannan)

Tỷ lệ này bằng 3-5 là thích hợp nhất đối với quá trình tạo gel Tỷ lệ tối ưu của κ-Car/LBG

là 4/1 trong môi trường KCl

Ngoài ra, Car cũng có sự tương tác với gelatin Tương tác tĩnh điện của hệ ιCar gelatin sẽ dẫn đến sự ổn định của mạng lưới ι-Car Ngoài các tính chất nêu trên, gel của Car có tính chất lưu biến khi thay đổi nhiệt độ, tức là có thể thay đổi cấu hình Như vậy, nhiệt độ là yếu tố vô cùng quan trọng trong quá trình tạo gel

-Tính chất tạo gel của Carrageenan

Vì có liên kết 3,6-anhydro (như một cầu vồng trên mặt galactose), mà carrageenan có một tính chất vô cùng quan trọng là có khả năng tạo gel ở nồng độ thấp (<0,5 %) Ở dạng gel, các mạch polysacharid xoắn vòng như lò xo và cũng có thể xoắn với nhau tạo thành khung xương không gian 3 chiều vững chắc và có thể chứa nhiều phân tử nước (dung môi) bên trong (hình 9) Từ dạng dung dịch chuyển sang dạng gel

là do sự tương tác giữa các phân tử polymer hoà tan với các phân tử dung môi ở bên trong Do tương tác ấy mà gel tạo thành có độ bền cơ học đáng kể Phần xoắn vòng lò

xo chính là những mầm tạo gel, chúng lôi kéo các phân tử dung môi vào vùng liên kết

Hình 1.10 Cơ chế chuyển đổi từ dung dịch sang gel ở nhiệt độ thấp [19]

Liên kết 3,6-anhydro là yếu tố chính của quá trình tạo gel Do có cầu nối 3,6 anhydro trong vòng 4-α-D- galactose và có hàm lượng ion sunfat ít hơn, nên trong dung dịch κ- và ι- Carrageenan có dạng cấu hình là lò xo và gel Dạng λ-, µ-, ν- Carrageenan không có cấu trúc cầu nối 3,6 - anhydro trong vòng 4-α-D- galactose với cấu hình 4C1 là nguyên nhân bẻ gãy chuỗi thông thường và ngăn chặn sự hình thành các bộ phận xoắn lò xo, do đó nó cản trở sự hình thành xoắn kép, như vậy là các dạng này không trải qua các trật tự thích hợp nên vì thế không có tính chất tạo gel, mà chỉ

có tính chất nhớt, làm đông tụ nói chung

Cấu trúc hoá học và nồng độ polyme cũng là những yếu tố quan trọng của quá trình tạo gel Do đó, từng dạng Carrageenan tạo gel với tính chất khác nhau và nồng độ polymer cần thiết để tạo gel cũng khác nhau Ngoài ra, quá trình tạo gel còn phụ thuộc vào một số điều kiện khác nữa như: bản chất các cation thêm vào và đặc biệt là nồng

độ ion sulphate Khả năng tạo gel của các carrageenan tỉ lệ thuận với nồng độ nhóm 3,6-anhydro, tỷ lệ nghịch với nồng độ ion sulphat

Nhiệt độ là yếu tố vô cùng quan trọng đối với quá trình tạo gel cuả carrageenan Trên 600C, κ-carrageenan luôn ở dạng cuộn ngẫu nhiên và phụ thuộc vào cấu trúc hoá học chi tiết của κ-Carrageenan và hệ Nhiệt độ chuyển đổi điển hình trong nước và sữa xấp xỉ 38 0C Trong sự có mặt của ion kali (K+), kali tác động như keo giữa các phân

tử bằng việc hình thành các tương tác tĩnh điện với nhóm este sunphate và oxy nguyên

tử ở cầu nối anhydro của κ-Carrageenan

Dung dịch carrageenan có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở một bước sóng nhất định phụ thuộc vào loại và thành phần của carrageenan Dựa vào tính chất này người ta có thể phân biệt được carrageenan thuộc loại: kappa, iota, hay lambda,… Các loại polysaccharide thường có khả năng hấp thụ ánh sáng với bước sóng ở vùng hồng ngoại trong khoảng 1000 – 1100 cm-1 Các loại carrageenan tạo gel thì đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 1065 cm-1, loại không tạo gel có đỉnh hấp thu ở vùng 1020 cm-1

Carrageenan có tính chất tạo gel đông giống như agar nhưng sức đông kém hơn

vì ảnh hưởng bởi lực tĩnh điện của các nhóm -SO3 Tuy nhiên, trong môi trường có canxi thì sức đông tăng lên rất lớn (1000g/cm2) do có sự tạo thành cầu nối liên kết canxisulphate giữa các phân tử carrageenan trong dung dịch Carrageenan có thể hòa tan trong nước, rượu và độ tan tùy thuộc vào loại carrageenan

Trong môi trường acid yếu, carrageenan chuyển thành carrageenic acid ROSO3H Trong môi trường kiềm, carrageenan bị khử các gốc -SO3 và hình thành liên kết anhydro

Tại Philippine, người ta sản xuất và cung cấp ra thị trường sản phẩm carrageenan chất lượng cao có ký hiệu PNG (Philippine natural grade carrageenan)

Từ năm 1991, PNG được FDA công nhận đạt chất lượng tương đương với carrageenan tinh khiết và cho phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm, từ năm 1994 được JECFA (Join Expert Committee on Food Additives) và CCFAC (Code Committee on Food Additives and Contaminants) công nhận là một phụ gia thực phẩm an toàn và cấp mã

số cho sản phẩm này là E-407a Trên thị trường, các sản phẩm carrageenan thường được tiệu thụ ở dạng bột mịn hoặc bản mỏng, đóng gói trong bao bì PE hoặc bao bì thủy tinh

Một số ứng dụng của carrageenan [1], [6], [9], [19]

Nhờ có các tính chất vật lý và hoá học đặc biệt mà carrageenan được sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và phi thực phẩm để làm chất tạo sự đồng nhất, ổn định, tạo gel, tạo độ nhớt, tạo kết cấu,… Carrageenan là một trong những phụ gia rất tốt trong công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác Ứng dụng của carrageenan vô cùng lớn, có thể tóm tắt lại như sau:

Bảng 1.3 Cơ cấu thị trường tiêu thụ carrageenan năm 2001

(Nguồn: H Porse, CP Kelco ApS, 2002, pers.comm.)

Ngày nay trên thị trường có khoảng 4.000 sản phẩm hàng hoá có sử dụng carrageenan, trong đó công nghệ thực phẩm sử dụng nhiều nhất Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người ngày càng khám phá ra nhiều ứng dụng mới của carrageenan đặc biệt là trong thực phẩm và y dược Carrageenan có một số ứng dụng:

•

• Trong công nghệ thực phẩm:

+ Carrageenan là phụ gia quan trọng để tăng tính mềm dẻo, đồng nhất cho sản phẩm

và cho điểm đóng băng thấp

+ Trong sản xuất bánh mì, bánh qui, bánh cuốn, carrageenan tạo cho sản phẩm có cấu trúc xốp và mềm

+ Trong sản xuất sữa, chocolate: carrageenan được sử dụng nhằm làm cho sản phẩm

có độ đồng nhất, tính ổn định và độ đặc nhất định

+ Trong sản xuất đồ hộp thịt (thịt gà, thịt lợn, xúc xích ) và trong các sản phẩm đông lạnh: carrageenan được sử dụng để tăng tính ổn định, tạo trạng thái lỏng sánh cho nước sốt, hạn chế sự phân tầng [1]

•

• Trong y dược và dược phẩm: với sự có mặt của carageenan, con người đã nghiên

cứu và thử nghiệm để tạo ra nhiều dạng lọai thuốc mới mà cách sử dụng thích hợp, tiện lợi cho quá trình điều trị bệnh cho con người

+ Ứng dụng để sản xuất thuốc dạng nhờn, nhũ tương để thoa lên các vết thương rất hữu hiệu, sản xuất các loại thực phẩm chức năng hỗ trợ chống loét dạ dày, thuốc nhuận tràng…

• Trong mỹ phẩm: carrageenan được sử dụng trong sản xuất các loại kem dưỡng

da, kem giữ ẩm,… Ngoài ra, carrageenan còn được sử dụng làm các món ăn có tác dụng giảm cân, làm nước hoa

•

• Trong nghiên cứu

+ Carrageenan dùng làm môi trường nuôi cấy các vi sinh vật, nuôi cấy mô tế bào + Carrageenan cũng được dùng như một chất làm mềm dẻo hay chất ổn định cho

1.3 Quy trình sản xuất carrageenan [6]

- Quy trình sản xuất carrageenan từ rong sụn(kappaphycus alvarezii) của

Trần Thị Luyến

- Quy trình này đề xuất sản xuất carrageenan theo 3 cách thức khác nhau: + Thu carrageenan mà không sử dụng bất kỳ hóa chất nào, theo phương pháp này thu được carrageen không lẫn hóa chất nhưng hiệu suất thu hồi thấp

+ Thu carrageenan bằng cách kết tủa cồn (96%), tuy nhiên phương pháp này ít được sử dụng

+ Thu carrageenan bằng cách bổ sung KCl (1,5%), sẽ thu được carrageenan có sức đông cao

Rong nguyên liệu

Rửa

Để ráo nước

Phơi hoặc sấy khô

- Đào Trọng Hiếu nghiên cứu tối ưu hóa quy trình công nghệ tách chiết

carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) [2]

Quy trình đưa ra các thông số kỹ thuật tối ưu cho công đoạn xử lý rong bằng kiềm và công đoạn tách chiết carrageenan từ rong sụn Carrageenan được sản xuất theo quy trình này cho chất lượng như sau:

+ Sức đông: 1020 g/cm2

+ Màu sắc: trắng sáng

+ Hiệu suất thu hồi 33 – 35%

+ Các chỉ tiêu về hoá học, vi sinh đều nằm trong giới hạn cho phép làm phụ gia thực phẩm

1.4 Tổng quan về chế phẩm enzyme thủy phân polysaccharirde

1.4.1 Viscozyme – L

Viscozyme L là một phức hợp đa enzyme thủy phân polysaccharide Trong phòng thí nghiệm chế phẩm này còn được dùng để tạo tế bào trần

Viscozyme được sản xuất bởi chủng nấm Aspergilus aculeatus Nó được sử

dụng trong ngành công nghiệp, đặc biệt trong việc tách bóc lớp vỏ cà phê, chế biến các loại ngũ cốc và rau quả Ngoài ra, sử dụng chế phẩm này trong nguyên liệu thực vật còn có tác dụng làm giảm độ nhớt, cải thiện tính chất của nguyên liệu và giúp tăng hiệu suất quá trình tách chiết những thành phần mong muốn của thực vật

Chế phẩm Viscozyme L chứa nhiều loại polysaccharase như cellulase, beta – glucanase, hemixenlulase và xylanase Các điều kiện thích hợp cho chế phẩm enzyme này hoạt động: pH 3,3 – 5,5 và nhiệt độ 50 – 550C

Bảo quản: Viscozyme L nên được bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ 3 – 50C, tại nhiệt

độ này chế phẩm có thể giữ được hoạt độ ít nhất trong một năm, nếu bảo quản ở 250C thì hoạt độ có thể duy trì trong 3 tháng

a Enzyme hemicellulase

Hemicellulase là một hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm: xylan β-xylosidase, EC 3.2.1.32 ; xylan 1,4- β-xylosidase, EC 3.2.1.37; và α-L-arabinofuranosidase ; EC 3.2.1.55 Hemicellulase hoạt động tốt ở pH 4,5 – 5,5 và nhiệt

endo-1,3-độ dưới 500C

Hemicellulase là enzyme thủy phân hemicellulose Hemicellulose là một dạng của polyshaccarides, hemicellulose có mặt ở thành tế bào, kém bền, có thể bị thủy phân bởi dung dịch acid hay kiềm yếu

Hemicellulase là hỗn hợp enzyme có thể thủy phân những thành phần khó tiêu hóa của mô thực vật Nó sẽ tấn công vào hemicellulose và giải phóng ra những phân tử

có trọng lượng nhỏ hơn

Ngoài ra, hemicellulase được ứng dụng nhiều trong xử lý phế liệu rau quả vì hemicellulose trong rau quả chủ yếu là cellulose, hemicellulase sẽ thủy phân cellulose tạo thành những phân tử đường có khối lượng thấp hơn, giúp cơ thể sinh vật hấp thụ tốt hơn

Hiện nay hemicellulase còn được ứng dụng trong sản xuất dầu dừa tinh khiết trong điều kiện pH 7, nhiệt độ 500C, thời gian 6 ngày với cơ chất là cơm dừa và phôi dừa

Trong công nghiệp sản xuất bia, nếu dùng nguồn nguyên liệu tinh bột thay thế malt với tỷ lệ cao sẽ bổ sung thêm enzyme này nhằm đường hóa các tinh bột

Hemicellulase được ứng dụng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp tạo thành các hợp chất đơn giản dễ tiêu hóa

b Enzyme cellulase

Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose

và cuối cùng là glucose Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:

Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…

Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen…

Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:

Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…

Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pulmilus…

Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột

Vì thế, việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật

Tuy nhiên, việc bổ sung một số enzym như cellulase, hemicelluase sẽ phá hủy

tế bào, giúp tăng lượng đường tạo thành và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi sẽ tăng

+ Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp gen:

Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần (protoplast), có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tế bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố mẹ

PG là enzyme xúc tác sự phân cắt các liên kết glucoside 1-4 ở trong các mạch của hợp chất pectine PG ít gặp ở trong cây và nếu có gặp thì cũng không nhiều PG chủ yếu có ở các vi sinh vật đặt biệt ở nẩm mốc và vi khuẩn

Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng trên cơ chất, H Deuel và E Stuti (1958) đã chia ra các kiểu polygalacturonase:

1 Enzyme tác dụng trên acid polygalacturonic đã được metoxye hóa (tức là pectine) gọi là polymetylgalacturonase (PMG) Enzyme này thường có tên hệ thống là poly- α-1-4 galacturonic-metylesterglucanohydrolase và có mã số EC 3.2.1.41

2 Enzyme tác dụng trên acid pectin hoặc pectinic gọi là polygalacturonase Polygalacturonase chia làm hai nhóm nhỏ endo-PG và exo-PG

pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc nguồn thu nhận

và cơ chất

Chẳng hạn phân giải dịch hóa khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu là 4 – 5,5 Còn PG đường hóa, khi tác dụng trên pectin có pH tối ưu là 3 -4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu là 4,4 – 4,6 Các PG chủ yếu bền vững trong vùng

pH từ 4 - 6

PG đường hóa từ Aspergillus niger được hoạt hóa bằng Hg thì có thể bền vững

khi pH = 2,5 nhiệt độ tối ưu của đa số PG là 40 – 450C

Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các cation của kim loại kiềm

Enzyme polygalacturonase (PG) tham gia quá trình thủy phân liên kết α 1,4 glucoside của acid pectic và các polygalacturonic khác, tách các gốc acid D – galacturonic thành các phân tử D – galacturonic tự do

Cơ chế quá trình thủy phân của polygalacturonase này được chia thành 2 kiểu + Endo – polygalacturonase: tham gia thủy phân những liên kết bên trong, phân hủy những phân tử polygalaturonic thành những chuỗi ngắn hơn Trong một số trường hợp chúng tạo thành diacid và monogalacturonic acid

+ Exo – polygalacturonic: tham gia thủy phân liên kết glucoside ở hai đầu của chuỗi polygalacturonate α 1,4 acid galacturonic Kết quả dạng đường hóa cuối cùng tạo nên acid monogalacturonic

Chế phẩm Pectinex Ultra SP – L được sản xuất từ quá trình lên men chìm bởi

chủng nấm Aspergilus aculeatus Sau đó, thu chế phẩm enzyme nhờ quá trình tinh

sạch

Việc sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP – L ngày càng rộng rãi, nó được sử dụng trong việc phá vỡ thành tế bào thực vật để tăng hiệu suất tách chiết các thành phần mong nuốn của thực vật

+ Ứng dụng của pectinase [7], [16]

Trong công nghệ thực phẩm người ta thường sử dụng pectinase ở dạng tinh khiết Tỷ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên nguyên liệu đem chế biến thường từ 0,05 – 0,1%

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp sau :

- Sản xuất rượi vang

- Sản xuất nước quả và đồ uống không cồn

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: mứt quả, mứt nhừ, mứt đông

- Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan

- Sản xuất đồ uống

Trong sản xuất rượu vang cũng như đồ uống không cồn đều có thể sử dụng pectinase rất hiệu quả Nhờ có pectinase mà quá trình ép, lọc và làm trong dịch quả đạt hiệu quả cao Chẳng hạn pectinase đưa vào quá trình nghiền quả, sau khi nghiền có thể

tăng hiệu suất lên 15 – 25 % và pectinase còn làm tăng quá trình chiết rút chất màu, tanin và các chất hòa tan làm tăng chất lượng dịch quả

1.5 Tổng quan công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng enzyme polysaccharase

a Các nghiên cứu trong nước [15], 18], [20]

Ngô Xuân Mạnh, Trần Thị Lan Hương (2005) đã nghiên cứu ứng dụng các chế

phẩm enzyme Pectinex để nâng cao hiệu suất trích ly và chất lượng nước dứa (Ananas comosus) tự nhiên Nghiên cứu cho thấy chế độ xử lý enzyme Pectinex Ultra SP – L như sau:

Lượng chế phẩm Pectinex Ultra SP – L cho 100 g thịt quả dứa: 0,022ml Nhiệt độ tối thích: 300C

Thời gian xử lý enzyme: 60 phút pH: 3,5 (như pH dịch dứa) Khi tiến hành trích ly dịch dứa với các thông số trên thì hiệu quả trích ly có thể đạt được 91,4% [7]

Lê Thị Tưởng (2007), đã nghiên cứu sản xuất olygosaccharide bằng enzyme hemicellulase Hemicellulase có khả năng thủy phân chitosan có độ deacetyl trên 22% trong điều kiện pH 4,5 ở nhiệt độ 370C với thời gian 6 ngày Sản phẩm thu được là (C6H11O4)n với n = 1,2,3,4,5,6,7 Sản phẩm có khả năng hòa tan tốt trong nước và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ thực phẩm, y học và nông nghiệp [20]

Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng (2009), đã nghiên cứu enzyme Cellulase và Pectinase từ chủng Trichoderma viride và Aspergillus niger nhằm xử lý

nhanh vỏ cà phê Vỏ cà phê là một phế phẩm không thể tránh khỏi trong quá trình sản xuất cà phê Trong thành phần của nó chứa nhiều hợp chất khó phân hủy tự nhiên

Bằng việc sử dụng 2 chủng nấm mốc Trichoderma viride và Aspergillus niger để sinh

tổng hợp cellulase và pectinase làm cho quá trình phân hủy diễn ra nhanh hơn Nghiên cứu đã xác định các điều kiên ảnh hưởng đến quá trình sản xuất hai enzyme này Điều

kiện tối ưu sản xuất enzyme pectinase của Aspergillus niger là: 2 ngày, độ ẩm 62%, giống 8% Điều kiện tối ưu sản xuất enzyme cellulase của Trichoderma viride là: 4

ngày, độ ẩm 58%, giống 8% [15]

Lưu Thị Lệ Thủy và các cộng sự (2008) đã nghiên cứu quy trình sản xuất dầu

từ hạt bí đỏ bằng phương pháp sử dụng chế phẩm enzyme Nghiên cứu đã chỉ ra rằng:

lựa chọn được 2 loại enzym phù hợp (Alcalase và Viscozyme) để thủy phân bột hạt bí

Đỗ Văn Ninh, Bùi Huy Chích (2009) đã nghiên cứu thủy phân Car từ rong sụn

Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty bằng enzyme amylase

Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng (2009), đã nghiên cứu enzyme Cellulase và Pectinase từ chủng Trichoderma viride và Aspergillus niger nhằm xử lý

nhanh vỏ cà phê Vỏ cà phê là một phế phẩm không thể tránh khỏi trong quá trình sản xuất cà phê Trong thành phần của nó chứa nhiều hợp chất khó phân hủy tự nhiên

Bằng việc sử dụng 2 chủng nấm mốc Trichoderma viride và Aspergillus niger để sinh

tổng hợp cellulase và pectinase làm cho quá trình phân hủy diễn ra nhanh hơn Nghiên cứu đã xác định các điều kiên ảnh hưởng đến quá trình sản xuất hai enzyme này Điều

kiện tối ưu sản xuất enzyme pectinase của Aspergillus niger là: 2 ngày, độ ẩm 62%, giống 8% Điều kiện tối ưu sản xuất enzyme cellulase của Trichoderma viride là: 4

ngày, độ ẩm 58%, giống 8% [15]

b Các công trình nghiên cứu ngoài nước

Soovendran A/l Varadarajan, Nazaruddin Ramli, Arbakariya Ariff, Mamot Said, Suhaimi Md Yasir (2009) đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất thu hồi carrageenan

từ rong sụn Eucheuma Cotonii bằng enzyme cellulase và chủng nấm mốc Aspergillus niger Nghiên cứu đã cho thấy rằng khi sử dụng enzyme cellulase thu nhận

carrageenan đạt cao nhất 45% trong khi đó dùng chủng nấm Aspergillus niger cho

hiệu suất đạt 37% Điều kiện tối ưu để thu nhận carrageenan khi sử dụng cellulase là: ở

nhiệt độ 45-50°C thời gian 3 giờ với tỷ lệ enzyme/rong là 2% [28]

J Sineiro và các cộng sự (1998) đã nghiên cứu sử dụng enzyme Celluclast 1,5L trong chiết xuất dầu từ hạt hướng dương bằng nước Hạt hướng dương được nghiền nhỏ và sàng để phân loại kích thước từ 0,75 – 1 mm Sau đó được huyền phù trong đệm citrate 0,05M, pH 4,8 Tại giá trị pH này protein trở nên không hòa tan và được thu nhận ở dạng cô đặc trong pha rắn, giải phóng dầu và các phenol trong pha nước

Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt tìm được giá trị tối ưu của quy trình: kết quả

nước/cơ chất: khoảng 7,8 – 8g/g, tỷ lệ E/S: 1,25g/100g và thời gian thủy phân là 2 giờ cho hiệu suất cao nhất (>30%) [26]

Năm 2003, Beatriz P.M Sant’Anna và cộng sự đánh giá hiệu suất thu nhận dầu

và protein từ cơm dừa bằng phương pháp tách chiết enzyme Nghiên cứu này sử dụng enzyme sau: Celluclast, Termamyl, Viscozyme, Neutrase và Protease Các thí nghiệm

sơ bộ ban đầu được thực hiện để lựa chọn loại enzyme phù hợp, nồng độ enzyme và thời gian ủ Để xác định ảnh hưởng của pH và tỷ lệ enzyme/cơ chất nhóm tác giả sử dụng đáp phương pháp đáp ứng bề mặt tối ưu hóa Kết quả cho thấy pH là thông số có

ý nghĩa quan trọng nhất đến hiệu suất thu nhận dầu và protein với mức ý nghĩa > 90%

Xử lý enzyme Viscozyme L nồng độ 0,6 %, sau đó tiếp tục bổ sung Neutrase 1,5 MG nồng độ 0,3%, tổng thời gian thủy phân là 60 phút, tỷ lệ S/W là 1/6, pH khoảng 7 cho hiệu suất thu hồi cao > 83% [21]

CHƯƠNG II : NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Rong sụn: rong sụn tươi Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty nuôi trồng tại

Cam Ranh, Khánh Hòa Việt Nam

Hình 2.1 Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty tươi

- Rong sụn khô: Rong sụn khô được thu mua vào tháng khoảng tháng 4 đến

tháng 9 năm 2011, có độ ẩm 31% – 32%, không lẫn các loại rong khác,, không có màu hoặc mùi lạ

- Các enzyme: Visozyme –L 100 FBG/g, Pectinex Ultra SP-L 3800 PGNU/ml

của hãng Novozymes, Công ty Nam Giang - 133/7 Hồ Văn Huê, Phường 9, Phú Nhuận, TP Hồ Chí Minh

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu: TCVN 5276 – 90

2.2.2 Phương pháp phân tích

- Xác định hàm ẩm: bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo tiêu

chuẩn TCVN 3700-90

- Xác định hiệu suất thu hồi carrageenan (trình bày ở phụ lục 1)

- Xác định đường tổng số bằng phương pháp Dubois (Dubois, 1956), (trình bày

chi tiết ở phụ lục 1)

- Xác định hàm lượng 3,6- anhydro-galactose bằng phương pháp Yaphe (Yaphe,

1965), (trình bày chi tiết ở phụ lục 1)

- Xác định hàm lượng sulphat bằng phương pháp Terho (Terho, 1971), (trình bày

chi tiết ở phụ lục 1)

- Xác định độ nhớt theo Craigle (Craig1e, 1978), (trình bày chi tiết ở phụ lục 1)

- Xác định độ bền gel theo Craigle (Craig1e, 1978), (trình bày chi tiết ở phụ lục 1) 2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.3.1 Quy trình dự kiến cho việc thu nhận carrgeenan

Tiến hành nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme polysaccharase để xử lý rong thay cho việc sử dụng kiềm và acid như trước đây Các thí nghiệm nhằm lựa chọn các thông số thích hợp tại mỗi công đoạn của quy trình

Thuyết minh quy trình:

- Rong sụn khô: được nuôi trồng tại Cam Ranh – Khánh Hòa, sau đó được phơi khô, thu mua và chuyển đến phòng thí nghiệm Đại học Nha Trang Do rong sụn lúc này còn chứa nhiều tạp chất và muối với độ ẩm khoảng 30 - 32% nên sẽ được đem

đi rửa sạch và phơi khô để đạt độ ẩm 18 – 20% sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

- Ngâm nước: lấy một lượng rong xác định rồi ngâm nước với thời gian 8 – 10 giờ, quá trình ngâm làm rong hút nước trương nở, giúp các công đoạn tách carrageenan sau này được thuận tiện

- Xử lý enzyme: sử dụng hai loại enzyme polysaccharase Visozyme L và Pectinex Ultra SP-L trong công đoạn xử lý rong Mục đích công đoạn này phá vỡ màng tế bào rong để tách chiết carrageenan hiệu quả

- Nấu chiết: sau khi xử lý rong đem rửa rồi tiến hành nấu chiết ở nhiệt độ

900C, thời gian 60 phút

- Lọc: dung dịch sau nấu chiết được lọc qua lớp vải để loại bỏ tạp chất và các sắc tố của thân rong Dịch lọc sẽ được bổ sung thêm KCl 0,3%, để dung dịch chuyển sang dạng đông đặc Sau đó, tiến hành cắt thỏi với kích thước 10 – 15 mm cho vào tủ đông

- Lạnh đông tan giá: sau khoảng thời gian từ 24 – 36 giờ ta tiến hành rã đông nhanh, quá trình này tách nước ra khỏi carrageenan

- Phơi khô: rong được phơi dưới ánh nắng mặt trời đến khi đạt được độ ẩm 18 – 20% Sau đó lấy các mẫu carrageenan đi kiểm tra chất lượng với các thông số về hiệu suất, sức đông, độ nhớt, hàm lượng sulphate, lượng 3,6- galactose để lựa chọn loại enzyme và các thông số phù hợp với từng công đoạn tách chiết carrageenan

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết

a Xác định các thông số của quá trình xử lý rong bằng chế phẩm polysaccharase

Mục đích thí nghiệm: so sánh sự khác biệt của carrageeenan khi xử lý với kiềm

và enzyme Ngoài ra, xác định tỷ lệ enzyme/rong của từng loại chế phẩm thích hợp khi

xử lý rong

Cách tiến hành: rong khô sau khi được ngâm để trương nở, rửa sạch rồi xử lý

với enzyme tại các tỷ lệ khác nhau Tiến hành 18 mẫu thí nghiệm, khối lượng rong khô

ở mỗi mẫu là 15g (đã ngâm cho trương nở) với lượng nước gấp 20 lần rong khô, xử lý bằng enzyme với hai chế phẩm khác nhau là Visozyme-L và Pectinex Ultra SP-L thời gian 60 phút, ở nhiệt độ 450C, pH = 5 M1.1: mẫu đối chứng xử lý rong bằng NaOH 5%, M1.2: không bổ sung enzyme, M1.3: bổ sung 0,25% enzyme VL ,M1.4: bổ sung 1% enzyme VL, M1.5: bổ sung 0,75% enzyme VL, M1.6: bổ sung 1% enzyme VL, M1.7: bổ sung 1,25% enzyme VL, M1.8: bổ sung 1,5% enzyme VL , M1.9: bổ sung 1,75% enzyme VL , M1.10: bổ sung 2% enzyme VL Mẫu M1.11: bổ sung 0,25 % enzyme PL;

…mẫu M1.18: bổ sung 2% enzyme PL

Sau khi xử lý, nấu chiết ở nhiệt độ 900C, trong thời gian 60 phút, tỷ lệ nước/rong khô là 50 Sau đó, hỗn hợp được lọc qua một lớp vải, rồi bổ sung 0,3% KCl vào dịch lọc, để đông tự nhiên, cắt miếng, cấp đông, rã đông và làm khô thu sản phẩm carrageenan Kết quả đánh giá: hiệu suất thu nhận carrrageenan, 3,6 – anhydro galactose, sức đông, độ nhớt

Kết quả thăm dò: tìm được tỷ lệ enzyme/rong thích hợp khi xử lý rong với từng

loại chế phẩm để thu được carrageenan có hiệu suất và chất lượng cao

Xác định nhiệt độ thích hợp cho enzyme đã chọn để xử lý rong sụn

Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ xử lý rong

Mục đích thí nghiệm: đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình xử lý rong

bằng enzyme, lựa chọn nhiệt độ thích hợp khi xử lý rong với từng chế phẩm enzyme

Cách tiến hành: rong khô sau khi được ngâm để trương nở, rửa sạch rồi xử lý

với enzyme tại các nhiệt độ khác nhau Tiến hành 12 mẫu thí nghiệm xử lý rong sụn,

độ khác nhau Ngâm nước 8 -10 h

Xác định hiệu suất, sức đông, độ nhớt, hàm lượng 3,6 – anhdydro galactose, hàm lượng

mỗi mẫu rong khô 15 g (sau khi được ngâm trương nở) với lượng nước gấp 20 lần khối lượng rong khô, xử lý bằng hai chế phẩm enzyme ở pH= 5 trong khoảng thời gian

60 phút với tỷ lệ enzyme/rong là 1% với chế phẩm VL và 1,5% với chế phẩm PL

Mẫu 1: xử lý ở nhiệt độ 350C, pH = 5, tỷ lệ ezyme VL/R đã nghiên cứu, … mẫu 2: ở 400C, mẫu 6 ở 600C, pH = 5, tỷ lệ ezyme VL/R đã nghiên cứu

Mẫu 7: xử lý ở nhiệt độ 350C, pH = 5, tỷ lệ ezyme PL/R đã nghiên cứu;…; mẫu

12 xử lý ở nhiệt độ 600C, pH = 5, tỷ lệ ezyme PL/R đã nghiên cứu

Sau khi xử lý rong, nấu chiết ở 900C, trong thời gian 60 phút, tỷ lệ nước nước nấu là 50 để thu nhận carrageenan Kết quả đánh giá hiệu suất, độ nhớt, sức đông, hàm lượng 3,6 – anhydro galactose

Kết quả: sơ bộ đánh hiệu suất và chất lượng carrageenan khi được xử lý ở nhiệt

độ khác nhau và chế phẩm enzyme khác nhau nhằm lựa chọn nhiệt độ thích hợp để sản xuất carrageenan

Xác định pH thích hợp

Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm xác định pH xử lý rong

Mục đích thí nghiệm: xác định pH thích hợp khi xử lý rong bằng enzyme

Cách tiến hành: Tiến hành 20 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 15 g rong khô (đã

được ngâm trương nở), xử lý bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L và Pectinex Ultra

SP – L, với lượng nước gấp 20 lần rong khô, ở nhiệt độ đã chọn, trong khoảng thời gian 60 phút, tỷ lệ enzyme/rong đã nghiên cứu

Mẫu 1: pH = 4,0; nhiệt độ đã chọn, tỷ lệ enzyme VL/rong đã nghiên cứu; , mẫu 10: pH = 5,8, nhiệt độ đã chọn, tỷ lệ enzyme VL/rong đã nghiên cứu

Mẫu 11: pH = 4,0 nhiệt độ đã chọn, tỷ lệ enzyme PL/rong đã nghiên cứu; , mẫu 20: pH = 5,8; nhiệt độ đã chọn, tỷ lệ enzyme PL/rong đã nghiên cứu

Sau khi xử lý, nấu chiết ở nhiệt độ 900C, trong thời gian 60 phút, tỷ lệ nước nấu

là 50 để thu nhận carrageenan Kết quả đánh giá hiệu suất, sức đông, độ nhớt, 3,6 – anhydro galactose

Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa chế độ xử lý rong bằng chế phẩm đã lựa chọn

Ta có biến đầu vào: - Z1: nồng độ enzyme/rong

- Z2: nhiệt độ xử xử lý rong

- Z3: pH Hàm mục tiêu: - Y1: Sức đông của carrageenan

- Y2 : Hiệu suất thu carrageenan Các yếu tố ảnh hưởng n = 3 và số thí nghiệm N = 2k = 8

Hàm mục tiêu được lựa chọn trong quá trình tối ưu hóa là hàm sức đông (Y1) và hàm hiệu suất thu carrageenan, đây là các chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng cũng như ảnh hưởng lớn đến chi phí sản xuất

Công đoạn xử lý rong

b Xác định các thông số của quá trình nấu chiết

Xác định thời gian nấu chiết thích hợp

Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm xác định thời gian nấu rong

Mục đích thí nghiệm: sau khi lựa chọn được chế phẩm enzyme phù hợp quá trình xử lý rong cần xác định thời gian nấu rong thích hợp để thu carrageenan

Cách tiến hành: tiến hành trên 6 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 15 g rong khô (đã

được ngâm trương nở), sau đó xử lý rong bằng một chế phẩm enzyme đã chọn với tỷ

60

Carrageenan

Xác định hiệu suất, sức đông, độ nhớt

Chọn thời gian nấu phù hợp

Bã Lọc

đã chọn Ngâm nước 8-10h

Nấu chiết với tỷ lệ nước/rong: 50/1, nhiệt độ

900C, thời gian nấu (phút) khác nhau như sau

Rửa

lệ enzyme/rong, pH, thời gian xử lý đã nghiên cứu Sau khi xử lý enzyme, rong được rửa sạch, tiến hành nấu với tỷ lệ nước/ rong là 50/1 Mẫu 1: nấu trong thời gian 60 phút, mẫu 2: thời gian 70 phút….mẫu 6: thời gian 110 phút Sau khi nấu chiết, dung dịch được lọc qua lớp vải rồi bổ sung thêm KCl 0,3%, để đông tự nhiên sau đó cắt thỏi, cấp đông, rã đông và làm khô thu carrageenan Kết quả đánh giá hiệu suất, sức đông, độ nhớt của sản phẩm thu được

Xác định tỷ lệ nước/rong thích hợp trong quá trình nấu

Hình 2.7: Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước/rong

Rong sụn khô

Xử lý bằng enzyme với các thông số thích hợp Ngâm nước 8 -10 h

Nấu chiết với tỷ lệ nước/rong khác nhau như sau

Bã Lọc

Xác định tỷ lệ nước

KCl 0,3%

Mục đích thí nghiệm: tỷ lệ nước/rong khô không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất

thu carrageenan, ảnh hưởng lớn đến giá thành sản xuất nên cần thiết tìm tỷ lệ nước/rong phù hợp

Cách tiến hành: tiến hành 5 mẫu thí nghiệm xử lý 15 g rong khô (đã được ngâm

trương nở) với tỷ lệ enzyme/rong, thời gian ngâm, tại nhiệt độ, pH đã nghiên cứu Sau khi xử lý enzyme, rong được rửa sạch, tiến hành nấu ở nhiệt độ 900C, thời gian nấu đã nghiên cứu, tỷ lệ nước/rong lần lượt là 40/1; 45/1; 50/1; 55/1; 60/1 Sau khi nấu dung dịch được lọc qua lớp vải, rồi bổ sung thêm KCl 0,3%, để đông tự nhiên, cắt thỏi, cấp đông, rã đông và phơi khô thu carrageenan Kết quả đánh giá: hiệu suất, sức đông và

độ nhớt

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm

Số liệu thực nghiệm được tiến hành theo phương pháp thăm dò cổ điển, mốt số công đoạn kết hợp với phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1

2.3 Các hóa chất và thiết bị chủ yếu đã sử dụng

Hóa chất: các hóa chất chủ yếu sử dụng trong đề tài: CH3COOH, NaOH, KCl

là những hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích do trung quốc sản xuất

Thiết bị: đề tài sử dụng các thiết bị chủ yếu có ở phòng thí nghiệm Công nghệ

sinh học như:

- Thiết bị đo độ nhớt Brook field – Viscometer – DV- I Prime của Mỹ

- Thiết bị đo sức đông Sun Rheo Meter CR – 500 DX của Nhật Bản

- Thiết bị ổn nhiệt