khảo sát dư lượng một số thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong trà thuốc

TÓM TẮT ĐỀ TÀI Đề tài Khảo sát dư lượng một số thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong trà thuốc nhằm góp phần vào công tác giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe của người sử dụng

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Đề tài Khảo sát dư lượng một số thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong trà thuốc nhằm

góp phần vào công tác giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe của người

sử dụng trà thuốc Ba loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ được khảo sát trong đề tài này là diazinon, chlorpyrifos và phosalon Chúng tôi đã xây dựng được quy trình chiết xuất đồng thời diazinon, chlorpyrifos và phosalon trên các mẫu trà Sau đó áp dụng phương pháp sắc ký khí để khảo sát 3 loại thuốc trừ sâu này trên 20 mẫu trà thuốc trên thị trường Tuy nhiên, kết quả khảo sát không phát hiện dư lượng của 3 loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ trên

MỤC LỤC

Tóm tắt đề tài I

Mục lục II

Danh sách các chữ viết tắt IV Danh sách hình VI Danh sách bảng VIII Bảng quyết toán IX Bảng dự trù kinh phí giai đoạn II X PHẦN MỞ ĐẦU - 1

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 4

1.1-Tình hình nghiên cứu ngoài nước - 4

1.2-Tình hình nghiên cứu trong nước - 4

1.3- Tính cần thiết, phạm vi nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu của đề tài - 4

1.4-Ý nghĩa khoa học của đề tài - 10

CHƯƠNG II- NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - 11

2.1- Khảo sát điều tra cơ bản các sản phẩm trà thuốc trên thị trường TP.HCM - 11

2.2-Xây dựng quy trình chiết đồng thời diazinon, chlorpyrifos và phosalon từ trà Actisô và trà đắng - 11

2.3-Xác định hiệu suất chiết -

2.4-Phương pháp lấy mẫu -14

2.5-Xây dựng quy trình định lượng -14

2.6-Ứng dụng phương pháp đã chọn khảo sát dư lượng diazinon, chlorpyrifos, phosalon trong một số chế phẩm trà - 15

CHƯƠNG III- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 16

3.1- Khảo sát điều tra cơ bản các sản phẩm trà thuốc trên thị trường TP.HCM - 16

3.3- Thăm dò điều kiện triển khai sắc ký – khối phổ phân tích đồng thời diazinon,

chlorpyrifos và phosalon - 20

3.4- Xây dựng quy trình định lượng - 23

3.4.1- Khảo sát tính tương thích hệ thống - 23

3.4.2- Thẩm định quy trình - 25

3.4.3- Công thức tính kết quả - 31

3.4.4- Quy trình xác định dư lượng Diazinon, Chlorpyrifos và Phosalon - 32

3.5-Ứng dụng phương pháp đã chọn khảo sát dư lượng Diazinon, Chlorpyrifos, Phosalon trong một số chế phẩm trà thuốc có chứa Actisô - 32

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - 53

PHỤ LỤC - 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 67

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT THUẬT NGỮ TIẾNG ANH

ADI liều dung nạp mỗi ngày có thể

chấp nhận được

Acceptable Daily Intake

BVTV Bảo vệ thực vật

EC Ủy ban Châu Aâu European Commission

EEC Cộng đồng kinh tế Châu Aâu European Economic

Commission

EI Ion hóa bằng va chạm điện tử Electron impact

FAO Tổ chức lương nông thế giới Food & Agricultural

organization

IUPAC Danh pháp quốc tế International Union of Pure

and Applied Chemistry

LD50 Liều gây chết 50% súc vật

thử nghiệm

Lethal dose 50

LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection

LOQ Giới hạn định lượng Limit of quantitation

LPME vi chiết pha lỏng Liquid Phase Microextraction MSD Đầu dị chọn lọc khối phổ Mass Selective Detector

PA loại tinh khiết dùng cho phân tích pour analyse

SPE NP chiết pha rắn pha thuận Normal phase SPE

SPE RP chiết pha rắn pha đảo Reverse phase SPE

WHO Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization

DANH SÁCH HÌNH

2.1 Quy trình chiết Diazinon, Chlorpyrifos, Phosalon bằng dung môi

hữu cơ và làm sạch dịch chiết qua cột silicasel

12

2.2 Sơ đồ khảo sát hiệu suất thu hồi của Diazinon, Chlorpyrifos,

3.1 Sắc ký đồ mẫu dược liệu chiết không qua SPE 20

3.2 Sắc ký đồ của mẫu dược liệu chiết được làm sạch qua 20

3.3 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 21

3.5 Sắc ký đồ Chlorpyrifos chuẩn 22

3.7 Đường biểu diễn phương trình hồi quy Diazinon chuẩn 25

3.8 Đường biểu diễn phương trình hồi quy Chlorpyrifos chuẩn 26

3.9 Đường biểu diễn phương trình hồi quy Phosalon chuẩn 26

3.10 Sơ đồ quy trình được sử dụng để chiết dư lượng thuốc trừ sâu

3.22 Sắc ký đồ trà đắng TĐ3 44 3.23 Sắc ký đồ trà đắng TĐ4 45 3.24 Sắc ký đồ trà đắng TĐ5 46 3.25 Sắc ký đồ trà đắng TĐ6 47

DANH SÁCH BẢNG

2.2 Chuẩn bị mẫu thử thuốc trừ sâu đã phun trên dược liệu 13

2.3 Chuẩn bị mẫu thuốc trừ sâu không qua dược liệu 13

3.1 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của chuẩn không qua dược liệu 16

3.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của chuẩn qua mẫu trà Actisô 17

3.3 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của chuẩn qua mẫu trà đắng 17

3.4 Kết quả so sánh hiệu suất thu hồi Diazinon, Chlorpyrifos, Phosalon

không qua và có qua dược liệu Actisô 18 3.5 Kết quả so sánh hiệu suất thu hồi Diazinon, Chlorpyrifos,

Phosalon không qua và có qua dược liệu Trà đắng

19

3.6 Kết quả xử lý tính tương thích hệ thống 24

3.7 Nồng độ và diện tích đỉnh tương đối của Diazinon chuẩn 25

3.8 Nồng độ và diện tích đỉnh tương đối của Chlorpyrifos chuẩn 25

3.9 Nồng độ và diện tích đỉnh tương đối của Phosalon chuẩn 26

3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của chuẩn qua trà Actisô 27

3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại của chuẩn qua Trà đắng 27

3.12 Khảo sát độ đúng của Diazinon trên mẫu trà Actisô 28

3.13 Khảo sát độ đúng của Chlorpyrifos trên mẫu trà Actisô 28

3.14 Khảo sát độ đúng của Phosalon trên mẫu trà Actisô 29

3.15 Khảo sát độ đúng của Diazinon trên mẫu trà đắng 29

3.16 Khảo sát độ đúng của Chlorpyrifos trên mẫu trà đắng 30

3.17 Khảo sát độ đúng của Phosalon trên mẫu trà đắng 30

3.18 Một số loại trà túi lọc Actisô nghiên cứu 33 3.19 Một số loại trà đắng nghiên cứu 33 3.20 Một số loại trà túi lọc giảm cân nghiên cứu 33

QUYẾT TOÁN KINH PHÍ

Đề tài: Khảo sát dư lượng một số thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong trà thuốc

Chủ nhiệm đề tài: TS.Trần Thanh Nhãn

ThS Nguyễn Đăng Tiến

Cơ quan chủ trì: Đại Học Y Dược TP HCM

Thời gian đăng ký trong hợp đồng : 12 tháng

Tổng kinh phí được duyệt: 190.000.000 đồng

Kinh phí cấp giai đọan 1: 120.000.000 đồng (đợt 1) theo HĐ NCKH và Phát triển công nghệ số: 183/HĐ-SKHCN ngày 12/12/2006

Kinh phí cấp giai đọan 2: (Theo số: /TB-SKHCN ngày )

Kinh phí được cấp trong năm

Kinh phí quyết toán trong năm

Công chất xám

Công thuê khoán

Nguyên, nhiên, vật liệu, dụng cụ,

phụ tùng, văn phòng phẩm

Thiết bị

Quản lý phí cơ quan quản lý

Hội nghị, hội thảo

Đánh máy tài liệu

Giao thông liên lạc

Tiết kiệm 5%

Kinh phí chuyển sang năm sau

120.000.000 167.000.000

85.000.00079.000.000

3.000.000

120.000.000120.000.000 Tạm ứng

DỰ TRÙ KINH PHÍ GIAI ĐOẠN II

Công chất xám, nguyên vật liệu

Hội nghị, hội thảo chuyên đề

Viết tham luận, báo cáo

Giám định, nghiệm thu

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tên đề tài: KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ SÂU LÂN HỮU

CƠ TRONG TRÀ THUỐC

Chủ nhiệm đề tài: TS.Trần Thanh Nhãn

ThS Nguyễn Đăng Tiến

Cơ quan chủ trì: Đại Học Y Dược TP HCM

Thời gian thực hiện đề tài:12 tháng

Kinh phí được duyệt: 190.000.000 đồng

Kinh phí đã cấp: 120.000.000 đồng (đợt 1) theo HĐ NCKH và Phát triển công nghệ số: 183/HĐ-SKHCN ngày 12/12/2006

2 Mục tiêu:

-Xác định dư lượng 3 loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ thường được sử dụng là Diazinon, Chlopyriphos, Phosalone trên một số chế phẩm trà thuốc hiện đang lưu hành trên thị trường TP HCM bằng phương pháp sắc ký khí

-Đề xuất phương pháp chiết xuất và kiểm nghiệm dư lượng các thuốc bảo vệ thực vật này trên các chế phẩm trà thuốc

-Đề xuất về giới hạn dư lượng các loại thuốc bảo vệ thực vật này trong khi xây dựng các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẫm đối với các loại trà thuốc

3 Nội dung nghiên cứu

-Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong việc trồng một số dược liệu được sử dụng trong việc sản xuất trà thuốc, sản phẩm trà thuốc trên thị trường tp.HCM

-Thiết lập quy trình cụ thể xác định dư lượng diazinon, chlopyriphos, phosalon bằng phương pháp sắc ký khí (GC)

-Xây dựng quy trình chiết diazinon, chlopyriphos, phosalon trên các mẫu nghiên cứu

và tinh khiết mẫu phân tích

-Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để khảo sát dư lượng của 3 loại thuốc bảo vệ thực vật này trên một số chế phẩm trà thuốc hiện đang lưu hành trên thị trường Tp.Hồ Chí Minh

-Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng thuốc

trừ sâu lân hữu cơ trong việc trồng một số

dược liệu được sử dụng trong việc sản

xuất trà thuốc, sản phẩm trà thuốc trên thị

trường tp.HCM

-Thiết lập quy trình cụ thể xác định dư

lượng diazinon, chlopyriphos, phosalon

bằng phương pháp sắc ký khí (GC)

-Xây dựng quy trình chiết diazinon,

chlopyriphos, phosalon trên các mẫu

nghiên cứu và tinh khiết mẫu phân tích

MS Tuy nhiên, quy trình mới định lượng được diazinon, chlorpyrifos, phosalon ở mức giới hạn phát hiện (0,15 mg/kg, 0,4mg/kg và 2 mg/kg trà tương ứng)

- Xây dựng được quy trình chiết xuất đồng thời diazinon, chlorpyrifos và phosalon trên các mẫu trà Actisô và mẫu trà đắng

và tinh khiết mẫu phân tích Do đó, có thể ứng dụng quy trình chiết này trên các mẫu trà thuốc khác

- Quy trình định lượng đồng thời diazinon, chlorpyrifos và phosalon đều đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ chính xác, độ đúng, độ tuyến tính, giới

và phosalon trên 9 mẫu trà Actisô, 6 mẫu trà đắng và 5 mẫu trà hỗ trợ giảm cân đang lưu hành trên thị trường Tp.HCM, kết quả khảo sát cho thấy cả 20 mẫu trà đều không phát hiện dư lượng của 3 loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ nghiên cứu ở trên

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nhiều công trình nghiên cứu ở một số nước trên thế giới đã khảo sát về dư lượng các thuốc trừ sâu trên các chế phẩm trà thuốc [6], [10], [13], [17], [27], như: Dư lượng thuốc trừ sâu ở trà đen [15], Xác định dư lượng buprofezin, methamidophos, acephate, triazophos trong các mẫu trà Trung Quốc bằng phương pháp Sắc ký khí [28], Xác định

dư lượng thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ bằng phương pháp sắc ký khí [29], …

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:

Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này, cũng như chưa có một tiêu chuẩn

về giới hạn của các loại thuốc bảo vệ thực vật đối với các chế phẩm trà thuốc hiện đang lưu hành trên thị trường trong khi danh mục các chế phẩm trà thuốc ngày càng gia tăng

và rất phong phú [4]

Một số công trình về vấn đề này đã được khảo sát như: Xây dựng qui trình xác định dư

lượng Diazinon và Chlorpyriphos bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc

ký khí [24], Khảo sát dư lượng Diazinon trong một số chế phẩm trà thuốc trên thị

trường bang phương pháp sắc ký khí [7], Khảo sát và nghiên cứu phân tích dư lượng một số hóa chất BVTV trong dược liệu [23]

Việc nghiên cứu dư lượng thuốc trừ sâu lân hữu cơ trên trà thuốc là chưa được đề cập 1.3 Tính cần thiết, phạm vi nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu của đề tài

- Hiện nay, tình hình kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu trong dược liệu nói chung vẫn còn hạn chế[14], [15], [25], đặc biệt là những dược liệu được sử dụng để vừa làm thuốc vừa có tác dụng như một loại thực phẩm chức năng được dùng thường xuyên hằng ngày dưới dạng trà thuốc Chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này, cũng như chưa có một tiêu chuẩn về giới hạn của các loại thuốc bảo vệ thực vật đối với các chế phẩm trà thuốc

hiện đang lưu hành trên thị trường [25] Đề tài nghiên cứu Khảo sát dư lượng một số thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong trà thuốc là một nhu cầu cần thiết hiện nay của xã hội

quan tâm và trong tình hình hội nhập kinh tế Quốc tế

- Đối tượng nghiên cứu của đề tài là xác định dư lượng 3 loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ thường được sử dụng là diazinon, chlopyriphos, phosalon trên một số chế phẩm trà thuốc hiện đang lưu hành trên thị trường TP HCM bằng phương pháp sắc ký khí

1.3.1 Các thuốc trừ sâu lân hữu cơ nghiên cứu:

Các thuốc lân hữu cơ được dùng để loại trừ côn trùng có gốc là hợp chất hữu cơ có chứa phospho Đây là nhóm thuộc thế hệ thứ hai sau nhóm Clor hữu cơ Nhóm này có độc tính khá cao và do lưu tồn trong môi trường khá lâu nên nhiều loại đã bị hạn chế hoặc cấm sử dụng

Trong danh mục các loại thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng tại Việt Nam [4] có

189 thuốc trừ sâu, trong đó thuốc trừ sâu thuộc gốc lân hữu cơ chiếm khoảng 37,5% Ngoài ra còn có các loại thuốc hạn chế sử dụng vẫn còn lưu hành trên thị trường

Diazinon, Chlopyriphos (thuộc nhóm phosphorothioat) và Phosalone (thuộc nhóm phosphorodithioat) là các thuốc trừ sâu gốc lân điển hình đang được sử dụng tại Việt Nam Đặc biệt hầu hết các thuốc trừ sâu gốc Lân đang được lưu hành ở Việt Nam đều thuộc nhóm phosphorothioat

1.3.1.1 Cấu tạo hóa học và tính chất của diazinon

- Công thức hóa học: C12H21N2O3PS Trọng lượng phân tử: 304,3

- Tên hóa học (theo IUPAC):

O,O-diethyl O-2 isopropyl-6-metyl pyrimidin-4-yl Phosphorothioate

- Công thức cấu tạo:

- Các tên thông dụng khác: diazinon 10H, Basudin 10H, Basudin 50ND, Vibasu 10H, Vibasu 50ND, Sarolex, Neocidol, Basudin (Ciba), Diazol.[4]

-Tính chất: Dạng lỏng màu vàng nâu, tỷ trọng 1,116-1,118, tan ít trong nước (60mg/L

ở 200 C), tan trong etanol, aceton, ethyl acetat, ete etylic, toluen và các loại dầu hỏa

Trong môi trường nước, diazinon bị thủy phân chậm tạo thành hydroxypyrimidine ít độc hơn Thời gian bán hủy ở môi trường acid (pH 3,14) là 0,5 ngày, trong môi trường kiềm (pH 10,9) là 6 ngày và ở môi trường trung tính (pH 7,14)

có khả năng ức chế cholinesterase là diazoxon, hydroxydiazinon, isohydroxydiazinon

và propylenediazinon Tuy nhiên, phần lớn diazinon được đào thải qua đường tiểu dưới dạng chất chuyển hóa không độc

-Dư lượng tối đa cho phép trong trà là 0,05 mg/kg (theo EU và Đức) [5]

-ADI (liều dung nạp mỗi ngày có thể chấp nhận được) là 0,002 mg/kg /ngày (theo FAO

và WHO)

-MAC (nồng độ tối đa chấp nhận được) trong nước uống là 0,02 mg /L

- Thời gian cách ly là 14 ngày với lúa, 21 ngày với cây ăn quả, cây công nghiệp

1.3.1.2- Cấu tạo hóa học và tính chất của phosalon [9]

- Công thức hóa học: C12H15ClNO4PS2 Trọng lượng phân tử: 367,81

-Tên hóa học (IUPAC): S-6-chloro-2,3-dihydro-2-oxo-1,3-benzoxazol-3-yl methyl

O,O-diethyl phosphorodithioate

- Công thức cấu tạo:

- Tên thông dụng khác: Azophen, Zolon, Rubitox, Phosalon 25ND, Zolone 35EC, Darton Ransbeek, Taxylon

- Tính chất: Tinh thể không màu, mùi tỏi nhẹ, nhiệt độ nóng chảy là 45-480C Tan nhiều trong etyl acetat, aceton, acetonitril, benzen, cloroform, metylen clorid, cyclohexan, dioxan, metyl etyl keton, toluen, xylen Khó tan trong nước (1,4 mg/L ở

200C) Thời gian bán hủy ở môi trường trung tính là 321 ngày Ở môi trường kiềm pH

9, pPhosalon bị thủy phân thành AE0941954 benzoxazol-3-ylmethyl) và AE F054014 (6-chloro-2(3H)-benzoxazolone)

(S-6-chloro-2,3-dihydro-2-oxo Độc tính: Thuốc độc vừa với người và gia súc, thuộc nhóm II Liều độc cấp tính LD50

qua đường uống của chuột là 120 mg/ kg Qua da thỏ LD50 là 1530 mg/ kg Thời gian cách ly 2-3 tuần Phosalon có thể gây độc tính cấp qua đường uống, có hại cho cơ thể khi bị nhiễm do xông hít hoặc tiếp xúc qua da Phosalon có thể gây kích ứng mắt và da (làm mắt và da bị đỏ) Trong trái cây, Phosalon bị chuyển hóa thành oxophosalon có độc tính; trong điều kiện hiếu khí, bị phân hủy nhanh chóng trong đất

- Dư lượng tối đa cho phép trong trà là 0,1 mg/kg (theo Codex), 0,05 mg/kg (theo EC

và Đức ) [5]

-ADI là 0,01 mg/kg/ngày

- Chế phẩm: Pyxolone 35 EC, Saliphos 35 EC dùng để diệt sâu cuốn lá hại lúa, sâu keo hại ngô, rệp sáp hại cà phê, bọ xít muỗi hại điều, rệp hại chuối

1.3.1.3- Cấu tạo hóa học và tính chất của chlorpyriphos

-Công thức hóa học: C9H11Cl3NO3PS Trọng lượng phân tử: 350,6

-Tên hóa học (theo IUPAC): O,O-diethyl O-3,5,6-trichloro-2-pyridyl phosphorothioate -Công thức cấu tạo:

- Chlorpyriphos là thuốc trừ sâu lân hữu cơ thuộc nhóm phosphorothioate, dùng để diệt côn trùng, sâu bọ

-Tính chất: tinh thể màu trắng, tan ít trong nước (1,4 mg/L ở 200C), tan trong isooctan, metanol, xylen, benzen; nóng chảy ở 430C, có tính không phân cực Thời gian bán hủy ở môi trường trung tính là 117 ngày

-Chlorpyriphos thuộc nhóm độc 2, là chất độc thần kinh và có thể gây rối loạn nội tiết,

có tác dụng tiếp xúc, vị độc và xông hơi mạnh Chlorpyrifos thường xâm nhập qua đường hô hấp và được hấp thu nhanh chóng ở đường tiêu hóa (ở người khoảng 70% liều uống)

Quá trình chuyển hóa chlorpyrifos xảy ra ở gan Đầu tiên, hệ thống enzym cytochrome

P450 oxy hóa cầu nối P=S chuyển thành P=O để tạo ra sản phẩm độc là oxon Sau đó, các enzyme esterases sẽ khử độc chlorpyrifos và chlorpyrifos-oxon bằng cách thủy phân các liên kết ester phosphat của các chất này tạo ra 3,5,6-trichloro-2-pyridinol và diethyl thiophosphate (từ chlorpyrifos), diethylphosphate (từ chlorpyrifos oxon) Các chất chuyển hóa của chlorpyrifos được bài tiết chủ yếu trong nước tiểu -Mức dư lượng cho phép đối với các loại rau là 0,2ppm

chlorpyrifos Dư lượng tối đa cho phép trong trà (theo EC/EEC) là 0,1 mg/kg [5]

-ADI là 0,01 mg/kg/ngày

-Trong thực vật và đậu nành, chlorpyriphos có 3 chất chuyển hóa chính là Isopropyl 4-hydroxy-3 chlorophenylcarbamate, Isopropyl N-5-chloro-2-hydroxy phenylcarbamate

N-và 1-hydroxy-2-propyl-3’- chlorolcarbanilat

1.3 1.4 Độc tính của thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ:[21][23]

Cơ chế tác dụng chính là ức chế men acetylcholinesterase, làm cho acetylcholin không được phân giải nên bị tích lũy lại và gây nhiễm độc Các ester lân hữu cơ dễ dàng xâm

nhập cơ thể qua đường hô hấp, đường da, đường tiêu hóa,… gây nhiễm độc cấp tính hay mãn tính, đặc biệt tiếp xúc qua da thường gây nhiễm độc bất ngờ

1.3.2 Khái niệm trà thuốc

Trà thuốc là những chế phẩm trong đó thường có trà và các dược liệu khác thường để dùng làm thức uống thường ngày có tác dụng điều trị hoặc hổ trợ trong việc điều trị một số bệnh Tùy theo tính chất của nguyên liệu người ta có thể sử dụng các phương pháp sau đây : hòa tan trực tiếp, ngâm lạnh, chế sôi, nấu-hầm, sắc…

1.3.3 Sắc ký khí, GC-MS

- Sắc ký khí (GC) [10] [11] [18] là một kỹ thuật tách các chất dễ bay hơi, bay hơi khi gia nhiệt tạo thành các dẫn chất có thể bay hơi Nguyên tắc hoạt động của GC là dựa trên hai quá trình hấp phụ và giải hấp liên tục giữa hai pha:một pha tĩnh rắn hoặc lỏng

và một pha tĩnh khí GC có nhiều ưu điểm: phát hiện chất ngay khi ra khỏi cột, phân tích liên tục mẫu; thời gian phân tích mẫu nhanh dưới 1 giờ; phân tích mẫu với lượng nhỏ (picogram)…

GC thường được áp dụng để phân tích dư lượng các thuốc trừ sâu do độ nhạy cao của phương pháp

- GC-MS: Dựa trên nguyên tắc bẻ gãy phân tử chất phân tích thành các mảnh ion có tỷ

số m/z xác định và đặc trưng cho chất phân tích

Có nhiều kỹ thuật ion hóa, nhưng phổ biến nhất là kỹ thuật ion hóa bằng va chạm điện

tử (EI: electron ionisation) EI là kỹ thuật ion hóa mạnh, sử dụng chùm tia electron bắn phá mẫu, dẫn đến mẫu bị phân mảnh Kỹ thuật này hầu như chỉ tạo ra các ion dương (M+), sau đó các ion M+ sẽ bị bẻ gãy thành các mảnh ion có khối lượng nhỏ hơn Các

kỹ thuật ion hóa khác như: ion hóa bằng hóa học (chemical ionisation), ion hóa bằng hóa học tạo ion âm (negative chemical ionisation), bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment)

Sau khi ion tạo thành đã được tách, detector (thường là bộ nhận điện tử loại dynod liên tục), được sử dụng để đếm các ion, hình thành phổ khối Thiết bị phân tích khối điển hình trong GC-MS là bộ tứ cực (quadrupole) hoặc bẫy ion (ion trap)

Sắc ký đồ GC-MS Được ghi theo hai chế độ:

- TIC (Total ion current Mode): dò tất cả các ion

- SIM (Selective ion Mode): dò một vài ion chọn lọc

1.4 Ý nghĩa khoa học của đề tài:

1.4.1 Đối với lĩnh vực khoa học có liên quan

Có thể mở rộng nguyên lý của phương pháp nghiên cứu, cách tiếp cận vấn đề của nghiên cứu này trong lĩnh vực y học, nông nghiệp, thực phẩm

1.4.2 Đối với kinh tế – xã hội

Góp phần cảnh báo về vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đối với các chế phẩm trà thuốc trên thị trường TP.HCM nói riêng và cả nước nói chung, như vậy sẽ góp phần làm giảm được tình trạng ngộ độc cấp tính hoặc ngộ độc mãn tính khi cơ thể hấp thụ phải một lượng nhỏ thuốc trừ sâu trong thời gian dài dẫn đến sự tích lũy trong cơ thể, từ đó sẽ giảm được đáng kể chi phí điều trị

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Khảo sát điều tra cơ bản các sản phẩm trà thuốc trên thị trường TP.HCM

Điều tra điều tra cơ bản các sản phẩm trà thuốc trên thị trường TP.HCM dưới hình thức hỏi, phỏng vấn (trực tiếp hoặc qua điện thọai)

2.2 Xây dựng quy trình chiết đồng thời diazinon, chlorpyrifos và phosalon từ trà Actisô và trà đắng [18], [19], [20], [21], [23], [26]

-Chất chuẩn đối chiếu: Diazinon, Chlorpyrifos và Phosalon chuẩn

-Chất chuẩn nội: Triphenyl phosphat

Bảng 2.1 Chất chuẩn làm việc đã sử dụng

(%)

Diazinon Chlorpyrifos Phosalon Triphenyl phosphat

21-3- 2008 21-9-2008 8-2008 10-2008

97,4%

97.8%

99%

99%

Nơi lấy Phòng QA-Công ty VIPESCO

-Dung môi chiết: aceton

-Làm sạch dịch chiết: SPE pha thuận

-Dung môi rửa giải: n-hexan : aceton (1:1)

Chúng tơi đã chọn qui trình sử dụng aceton để tiến hành chiết xuất trong đề tài

Trà + hỗn hợp chuẩn Trà + hỗn hợp chuẩn

(Bình nĩn)

100 ml n-hexanLắc kỹ

Để yên 30 phút Siêu âm 30 phút Lọc qua giấy lọc Lọc qua giấy lọc

Rửa bình nón, phễu

3 lần x 10 ml n-hexan Rửa bình nón, phễu3 lần x 10 ml acetonDịch lọc n-hexan Dịch lọc aceton

Cô quay không quá 400 C Cắn

Hòa trong 5 ml

n-hexan: aceton (1:1)

Hòa với 1 ml n-hexan: aceton (1:1) Thổi khô đến cắn

SPE Silicagel

Mẫu tự tao

100 ml acetonLắc kỹ

Để yên 30 phút Siêu âm 30 phút

Cô quay không quá 400 C Cắn

Hòa với 1 ml n-hexan: aceton (1:1) Thổi khô đến cắn

Hòa trong 5 ml n-hexan: aceton (1:1)

SPE Silicagel

Hình 2.1 Quy trình chiết diazinon, chlorpyrifos, phosalon bằng dung mơi hữu

cơ và làm sạch dịch chiết qua cột silicagel

2.3 Xác định hiệu suất chiết

Các bước tiến hành:

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu qua cột SPE

Dung dịch chuẩn: diazinon (1 ppm), chlorpyrifos (2 ppm), phosalon (10 ppm)

Bảng 2.2 Chuẩn bị mẫu thử thuốc trừ sâu đã phun trên dược liệu

10 ml Aceton x 3 lần

Cô quay dịch chiết ở nhiệt độ không quá 40 0 C gần đến cắn Hòa cắn trong 1 ml n-Hexan:Aceton (1:1)

Làm bay hơi dung môi Hòa cắn trong 5 ml n-Hexan:Aceton (1:1)

Bảng 2.3 Chuẩn bị mẫu thuốc trừ sâu không qua dược liệu

Bình

1 2 3 4 5 6

Aceton (ml) 100 100 100 100 100 100

Cô quay dịch chiết ở nhiệt độ không quá 40 0 C gần đến cắn Hòa cắn trong 1 ml n-Hexan:Aceton (1:1)

Làm bay hơi dung môi đến cắn khô Hòa cắn trong 5 ml n-Hexan:Aceton (1:1)

2.3.2 Hoạt hóa cột Silicagel:

Cho 6 ml n-Hexan : Aceton (1:1) chảy tự nhiên qua cột

2.3.3 Nạp mẫu và rửa giải

Lần lượt cho mẫu chảy qua cột SPE silica 6 ml

Rửa giải bằng dung môi thích hợp

2.3.4 Chuẩn bị mẫu chiết để bơm vào máy

Bay hơi dịch rửa giải ở nhiệt độ < 40 0C đến cắn

Hịa tan cắn vào 1 ml dung dịch nội chuẩn, lọc, đem phân tích trên máy sắc ký khí

Thermo Finnigan 2003 – DSQ, cột mao quản DB5-MS, detector khối phổ (MS)

Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát hiệu suất thu hồi của diazinon, chlorpyriphos, phosalon

2.4 Phương pháp lấy mẫu [3], [20]

-Cách lấy mẫu: Bao bì ít hơn 1 kg, trộn đều và lấy đủ lượng mẫu để phân tích Bao bì

từ 1- 5 kg, lấy lượng chế phẩm tương đương và đủ để phân tích ở 3 vị trí trên, giữa và cuối bao bì Trộn đều và lấy lượng mẫu đủ để phân tích Bao bì lớn hơn 5 kg, lấy mẫu khơng ít hơn 250 g ở 3 vị trí trên, giữa và cuối bao bì, trộn đều và lấy lượng mẫu đủ để phân tích

-Số lượng mẫu: Nếu như số bao bì (n) ít hơn hoặc bằng 3, lấy mẫu ở mỗi bao bì theo phương pháp nêu trên Nếu số bao bì lớn hơn 3, số mẫu cần lấy sẽ là √n +1

Trong phần thực nghiệm này, đối với mỗi loại trà của một cơ sở sản xuất, chúng tơi lấy

3 đơn vị bao bì (gĩi, túi), trộn đều và lấy lượng mẫu đủ để phân tích

2.5- Xây dựng quy trình định lượng [1], [2], [8], [9], [10], [11], 12], [19], [20], [21],

[23]

2.5.1 Khảo sát tính tương thích

Lọc Bơm vào máy

Cho qua Trà Không cho qua trà

Dịch chiết pha trong 1 ml dung dịch nội chuẩn Dịch chiết pha trong 1 ml dung dịch nội chuẩn

LOD = 3 x S / N

LOQ = 10 x S / N

Pha dung dịch chuẩn có nồng độ diazinon 1ppm, chlorpyrifos 2 ppm, phosalon 10 ppm

và triphenyl phosphat (10 ppm), tiến hành sắc ký khí 6 lần với điều kiện phân tích đã chọn

Tính tương thích của máy được khảo sát với các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh, hiệu lực cột, hệ số phân giải, hệ số bất đối

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử được xác định dựa vào tỷ lệ giữa diện tích đỉnh tương đối của mẫu thử và mẫu chuẩn

2.5.2 Thẩm định quy trình

- Khảo sát tính đặc hiệu

- Khảo sát tính tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ

- Khảo sát độ lặp lại (độ chính xác) trên quy trình [19]

- Khảo sát độ đúng

- Khảo sát giới hạn phát hiện

Hàm lượng càng thấp có thể nhận biết được thì độ nhạy càng cao Giới hạn phát hiện được xác định:

S (Signal): Độ lớn tín hiệu đầu ra của detector

N (Noise): Mức nhiễu

- Khảo sát giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng được xác định

2.6 Ứng dụng phương pháp đã chọn khảo sát dư lượng diazinon, chlorpyrifos và phosalon trong một số chế phẩm trà

Nhận thấy 3 loại trà hiện nay được sử dụng nhiều là trà actisô, trà đắng và trà giảm cân

Do đó, chúng tôi chọn 3 loại trà này làm đối tượng nghiên cứu chính trong đề tài

Diện tích đỉnh thành phần Diện tích tương đối =

Diện tích chuẩn nội

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát điều tra cơ bản các sản phẩm trà thuốc trên thị trường TP.HCM

Qua quá trình khảo sát các loại trà thuốc, chúng tôi nhận thấy, hiện nay trên thị trường

có khoảng 30 loại trà thuốc Tuy nhiên, nhóm trà được dùng nhiều nhất là các loại trà không chỉ để uống giải khát hàng ngày mà còn có tác dụng phòng chữa bệnh như mát gan, giải độc, giảm cholesterol… Trong đó, 3 loại trà được bán nhiều trên thị trường là trà actisô, trà đắng và trà giảm cân Do đó, chúng tôi chọn 3 loại trà này làm đối tượng nghiên cứu chính trong đề tài

3.2- Xác định hiệu suất chiết

3.2.1 Hiệu suất thu hồi của chuẩn khi chưa qua dược liệu

Bảng 3.1- Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của chuẩn không qua dược liệu

Hiệu suất thu hồi (%)

82,01 91,10 75,68 76,20 72,12 75,83

51,35 65,89 68,60 71,82 52,98 55,36 Trung bình

SD

RSD (%)

ε

82,81 8,33 10,05

± 3,40

78,82 6,80 8,63

± 2,78

60,99 8,81 14,38

± 3,95

3.2.2 Hiệu suất thu hồi của chuẩn khi qua mẫu trà Actisô:

Bảng 3.2- Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của chuẩn qua mẫu trà Actisô

Hiệu suất thu hồi (%)

76,47 71,34 78,70 82,97 70,01 72,02

60,32 57,49 50,83 62,45 50,74 54,83 Trung bình

SD

RSD

ε

78,34 3,26 4,16

± 1,33

75,25 5,02 6,67

± 2,05

56,11 4,86 8,66

± 1,98

3.2.3 Hiệu suất thu hồi của chuẩn khi qua mẫu Trà đắng:

Bảng 3.3- Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của chuẩn qua mẫu Trà đắng

Hiệu suất thu hồi (%)

71,20 79,73 69,35 85,62 83,14 72,02

56,50 59,03 64,53 56,31 61,45 55,13 Trung bình

SD

RSD

ε

79,88 5,30 6,64

± 2,16

76,84 6,87 8,94

± 2,80

58,83 3,60 6,13

± 1,47

3.2.5 So sánh hiệu suất thu hồi của diazinon, chlorpyrifos, phosalon khi không qua

dược liệu và có qua dược liệu

-Sử dụng thống kê để tính F-test nhằm xác định 2 phương sai có khác nhau không

- Sử dụng t-test two samples equal variances hoặc unequal variances để đánh giá sự khác biệt của 2 phương pháp có ý nghĩa hay không

Bảng 3.4- Kết quả so sánh hiệu suất thu hồi diazinon, chlorpyrifos, phosalon không

qua và có qua trà Actisô

Hiệu suất thu hồi diazinon (%)

Hiệu suất thu hồi chlorpyrifos (%)

Hiệu suất thu hồi phosalon

(%)

n

Không qua dược liệu

Qua dược liệu

Không qua dược liệu

Qua dược liệu

Không qua dược liệu

Qua dược liệu

Kết quả giá trị trung bình của diazinon, chlorpyrifos và phosalon khi qua và không qua dược liệu đều khác nhau không có ý nghĩa thống kê (t < t0,05)

Kết luận: diazinon, chlorpyrifos và phosalon không bị dược liệu giữ lại

Bảng 3.5- Kết quả so sánh hiệu suất thu hồi diazinon, chlorpyrifos, phosalon không

Qua dược liệu

Không qua dược liệu

Qua dược liệu

Không qua dược liệu

Qua dược liệu

Nhận xét: Kết quả kiểm định Fisher cho thấy phương sai giữa hai phương pháp khi

định lượng diazinon và chlorpyrifos khác nhau không có ý nghĩa thống kê (Ft < F0,05), phosalon khác nhau có ý nghĩa thống kê (Ft > F0,05)

Kết quả giá trị trung bình của diazinon, chlorpyrifos và phosalon khi qua và không qua dược liệu đều khác nhau không có ý nghĩa thống kê (t < t0,05)

Kết luận: diazinon, chlorpyrifos và phosalon không bị dược liệu giữ lại

Hình 3.1- Sắc ký đồ mẫu dược liệu chiết không qua SPE

Hình 3.2- Sắc ký đồ của mẫu dược liệu chiết được làm sạch qua SPE

3.3 Thăm dị điều kiện triển khai sắc ký – khối phổ phân tích đồng thời diazinon, chlorpyrifos và phosalon

- Cột phân tích: Cột mao quản DB5-MS, dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, bề dày lớp phim 0,25 µ m

- Nhiệt độ buồng tiêm: 2600 C

- Nhiệt độ buồng ion: 2600 C

- Chương trình nhiệt độ: ban đầu 600 C, tiếp tục tăng lên 150 C mỗi phút đến 1400 C, tiếp tục tăng lên 120 C mỗi phút đến 2600 C giữ trong 10 phút

- Tốc độ dịng khí mang: khí Helium 1ml/ phút

- Thể tích tiêm 2 µ l Tiêm mẫu tự động

Kết quả thu được:

DiazinonChlorpyrifos

Thời gian lưu của chlorpyrifos khoảng 12,23 ± 0,07 phút Thời gian lưu của phosalon khoảng 16,78 ± 0,17 phút Thời gian lưu của nội chuẩn triphenyl phosphat (TPP) khoảng 15,27 ± 0,12 phút

Hình 3.3- Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn

phosalon

TPP Chlorpyrifos

Diazinon

Hình 3.4- Sắc ký đồ diazinon chuẩn

Hình 3.6- Sắc ký đồ phosalon chuẩn

3.4 Xây dựng quy trình định lượng

3.4.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống (độ lặp lại trên máy): 6 lần bơm

Các thông số có độ lặp tốt

-Thời gian lưu: RSD từ 0,033% - 0,065%: đạt yêu cầu

- Diện tích đỉnh: RSD từ 2,747% - 4,249%: đạt yêu cầu

3.4.2 Thẩm định quy trình

3.4.2.1 Khảo sát tính tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ

Bảng 3.7- Nồng độ và diện tích đỉnh tương đối của diazinon chuẩn

y = 1.296x - 0.1768

R2 = 0.9968

0 1 2 3 4 5 6 7

Hình 3.7- Đường biểu diễn phương trình hồi quy diazinon chuẩn

Bảng 3.8- Nồng độ và diện tích đỉnh tương đối của chlorpyrifos chuẩn

y = 0.6212x - 0.1343

R 2 = 0.9974

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Hình 3.8 Đường biểu diễn phương trình hồi quy chlorpyrifos chuẩn

Bảng 3.9- Nồng độ và diện tích đỉnh tương đối của phosalon chuẩn

y = 0.0627x - 0.2883

R 2 = 0.99

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Hình 3.9- Đường biểu diễn phương trình hồi quy phosalon chuẩn

Phương trình hồi quy của diazinon

⎯Y = 1,296X (R2 =0,9968; S =0,161)

Khoảng tuyến tính từ (0,25-5) ppm

Phương trình hồi quy của chlorpyrifos

3.4.2.2 Khảo sát độ lặp lại trên quy trình

Bảng 3.10- Kết quả khảo sát độ lặp lại của chuẩn qua trà Actisô

n Diazinon Chlorpyrifos Phosalon

76,47 71,34 78,70 82,97 70,01 72,02

60,32 57,49 50,83 62,45 50,74 54,83 Trung bình

SD

RSD

ε

78,34 3,26 4,16

± 1,33

75,25 5,02 6,67

± 2,05

56,11 4,86 8,66

± 1,98

Nhận xét: Độ lặp lại của diazinon, chlorpyrifos, phosalon qua dược liệu được làm sạch

qua SPE có RSD lần lượt là 4,16%, 6,67% , 8,66% đạt tiêu chuẩn BP 2007 [19]

Bảng 3.11- Kết quả khảo sát độ lặp lại của chuẩn qua Trà đắng

n Diazinon Chlorpyrifos Phosalon

71,20 79,73 69,35 85,62 83,14 72,02

56,50 59,03 64,53 56,31 61,45 55,13 Trung bình

SD

RSD

ε

79,88 5,30 6,64

± 2,16

76,84 6,87 8,94

± 2,80

58,83 3,60 6,13

± 1,47

Nhận xét: Độ lặp lại của diazinon, chlorpyrifos và phosalon qua dược liệu được làm

sạch qua SPE có RSD lần lượt là 6,64%, 8,94% và 6,13% đạt tiêu chuẩn BP 2007 [19]

3.4.2.3 Khảo sát độ đúng

*Trên mẫu trà Actisô

Bảng 3.12- Khảo sát độ đúng của diazinon trên mẫu trà Actisô

vào (ppm)

diazinon thực tế (ppm)

0,749 0,954 0,832

87,70 111,71 97,42

1,116 1,052 1,059

104,49 98,50 99,16

1,2397 1,3556 1,3793

96,73 105,77 109,02

Bảng 3.13- Khảo sát độ đúng của chlorpyrifos trên mẫu trà Actisô

1,648 1,636 1,557

102,55 101,80 96,88

2,125 1,806 2,156

105,83 89,94 107,37

2,302 2,415 2,325

95,56 100,24 96,52

Bảng 3.14- Khảo sát độ đúng của phosalon trên mẫu trà Actisô

vào (ppm)

phosalon thực tế (ppm)

7,222 8,232 7,354

89,29 101,78 90,93

9,387 9,743 10,288

92,85 96,37 101,76

11,429 12,649 12,090

94,20 104,26 99,65

Kết quả cho thấy tỷ lệ phục hồi của 3 nồng độ 80%, 100%, 120% chuẩn diazinon chlorpyrifos và phosalon thêm vào ba mẫu thử thu được từ 96,79% - 101,17%, có độ sai lệch nhỏ hơn 5%, đạt yêu cầu về độ đúng của một qui trình phân tích định lượng

*Trên mẫu Trà đắng

Bảng 3.15- Khảo sát độ đúng của diazinon trên mẫu trà đắng

vào (ppm)

diazinon thực tế (ppm)

0,818 0,842 0,835

95,78 98,59 97,77

1,158 1,144 1,007

108,43 107,12 94,29

1,1543 1,2714 1,1990

90,07 99,20 93,55