Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp vi gói bằng Natri Alginate lên số lượng và hoạt tính Probiotic của Lactobacillus casei trong quá trình tạo bột sữa chua

LỜI MỞ ĐẦU Từ rất lâu trong lịch sử loài ngƣời, chúng ta đã biết đến một nguồn thực phẩm rất giàu dinh dƣỡng đó là sữa. Sữa là nguồn thực phẩm dành cho các loài động vật có vú còn non mới sinh chƣa thể sử dụng các loại thực phẩm khác. Trong sữa có chứa nhiều chất dinh dƣỡng nhƣ glucid, protein, lipid, khoáng, vitamin, … Những hợp chất này rất có lợi, cần thiết cho sức khỏe và sự tăng trƣởng, phát triển của con ngƣời và các loài động vật. Là nguồn thực phẩm quan trọng, nên các sản phẩm từ sữa đã đƣợc đa dạng hóa nhƣ phô mai, bơ, sữa chua lên men, kefir là các sản phẩm truyền thống đã có từ rất lâu trƣớc đây cho đến các sản phẩm hiện đại đƣợc sản xuất theo dây chuyền công nghiệp nhƣ sữa tƣơi thanh trùng, tiệt trùng, sữa nguyên kem, …Tất cả nhằm nâng cao chất dinh dƣỡng, đa dạng hóa sản phẩm và bảo quản sữa tốt hơn. Sữa chua là một trong những sản phẩm nổi tiếng nhất của các loại thực phẩm có chứa men vi sinh sống (probiotic). Các loài vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng đã tạo nên đặc tính chuyên biệt của sản phẩm về hƣơng và vị. Nhiều bằng chứng cho thấy rằng các loài vi khuẩn sử dụng trong quá trình lên men sữa chua cho thấy khả năng hữu hiệu giúp con ngƣời kháng lại sự gây nhiễm và gây viêm ở ruột [37]. Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic đƣợc duy trì với một số lƣợng lớn khi đi qua đƣờng tiêu hóa của ngƣời vẫn còn là một thách thức lớn đối với việc phân phối hiệu quả những vi khuẩn có lợi này [8]. Bởi vì nhiều vi khuẩn probiotic khó có thể tồn tại trong môi trƣờng có nồng độ acid thấp và muối mật của đƣờng tiêu hóa [16], [88]. Bên cạnh đó, thời hạn sử dụng của sữa chua rất ngắn, khoảng 1 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng (25-30 0 C) và khoảng 5 ngày ở 7 0 C hoặc 10 ngày ở 4 C và đây là mối quan tâm cho việc phát triển các sản phẩm có chứa các vi sinh vật có hoạt tính sinh học [43]. 0Phƣơng pháp sấy phun hiện nay đƣợc nghiên cứu và sử dụng phổ biến vì phƣơng pháp này có thể loại bỏ độ ẩm ở tỷ lệ cao, chi phí thấp và rút ngắn quá trình sản xuất . Một đặc tính quan trọng của phƣơng pháp này là vẫn giữ đƣợc tính ổn định của sản phẩm và có thể thực hiện đƣợc ở qui mô sản xuất lớn [79]. Với phƣơng pháp sấy phun, không những giúp cho quá trình lƣu trữ và bảo quản sữa chua đƣợc lâu dài mà vẫn giữ đƣợc mật độ vi sinh vật nhất định trong sản phẩm. Vấn đề lớn đặt ra cho việc ứng dụng phƣơng pháp sấy phun sữa chua là việc bảo tồn khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trong và sau khi sấy khô. Bởi vì các vi khuẩn lactic khá nhạy cảm với nhiệt. Hiện nay, kỹ thuật bao vi gói vi sinh vật có thể bảo vệ tốt tế bào vi sinh vật ở môi trƣờng cực đoan nhƣ hệ tiêu hóa (môi trƣờng acid ở dạ dày, muối mật ở ruột non) [22]. Tuy nhiên, khi sấy phun ở nhiệt độ cao, bao vi gói có thể bảo vệ hữu hiệu tế bào vi khuẩn hay không? Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ―Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp vi gói bằng Natri alginate lên số lƣợng và hoạt tính probiotic của Lactobacillus casei trong quá trình tạo bột sữa chua‖ với mục tiêu nhằm: bảo vệ tế bào vi khuẩn Lactobacillus casei trong quá trình sấy phun ở nhiệt độ cao đồng thời vẫn giữ đƣợc đặc tính probiotic của vi khuẩn này trong sản phẩm bột sữa chua. Nội dung nghiên cứu chính của đề tài bao gồm:  Khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus casei: đặc tính sinh học, đặc tính probiotic và khả năng chịu nhiệt độ cao.  Khảo sát hiệu quả vi gói tế bào với Natri alginate nhằm chọn đƣợc nồng độ và phƣơng thức vi gói thích hợp để bảo vệ tế bào trong các điều kiện cực đoan của hệ tiêu hóa và điều kiện kỹ thuật.  Khảo sát các chế độ sấy phun sữa chua kết hợp với chất vi gói bảo vệ vi sinh vật.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



ĐÀO THỊ MINH CHÂU

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP VI GÓI BẰNG NATRI ALGINATE LÊN SỐ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH

PROBIOTIC CỦA LACTOBACILLUS CASEI TRONG QUÁ

TRÌNH TẠO BỘT SỮA CHUA

Con (em) xin cảm ơn Ba Mẹ, anh chị trong gia đình, đã luôn luôn quan tâm và

là nguồn động viên rất lớn về mọi mặt

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn các Cô: Tiên, Ly Tao, Trúc Thanh trong

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Bách Khoa đã tạo mọi điều kiện cho tôi triển khai thí nghiệm thành công Cám ơn các Thầy, Cô trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã giảng dạy tôi suốt quá trình học Thạc Sĩ

Cám ơn tất cả các bạn học viên phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 trường Đại Học Bách Khoa, TP Hồ Chí Minh đã cho tôi những giây phút chia sẽ Đặc biệt, cho tôi gửi lời cảm ơn đến các bạn Thanh Phương, Kim Cúc, Phú Hoài, Minh Khoa, là những người bạn thật sự giúp đỡ tôi rất nhiều trong giai đoạn thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn các bạn Lan Anh, Tú, Cường của lớp Cao Học Vi Sinh K20, là những người bạn luôn chia sẽ với tôi những kinh nghiệm, thông tin quí báu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp CNSH k29, trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là Giang, Dung, Thắng, Nhân, Phụng, Vân, là những người bạn luôn

ở bên cạnh tôi vào những giây phút khó khăn trong giai đoạn vừa qua

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Mục lục

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG DẠ DÀY – RUỘT Ở NGƯỜI 4

1.2 ĐỊNH NGHĨA, VAI TRÕ VÀ CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA PROBIOTIC 7

1.2.1 Định nghĩa của probiotic 7

1.2.2 Vai trò của probiotic 8

1.2.2.1 Không dung nạp Lactose 8

1.2.2.2 Chống nhiễm đường tiết niệu 9

1.2.2.3 Bệnh viêm ruột 9

1.2.2.4 Ung thư ruột kết 10

1.2.2.5 Ngăn ngừa và điều trị bệnh do nhiễm Helicobacter pylori 11

1.2.2.6 Giảm cholesterol 11

1.2.3 Một số cơ chế phân tử liên quan đến hoạt động của Probiotic 11

1.2.3.1 Sự tồn tại và sống sót của probiotic trong đường dạ dày-ruột 12

1.2.3.2 Probiotic điều chỉnh chức năng của tế bào chủ 13

1.3 LACTOBACILLUS CASEI 16

L casei 16

1.3.2 Đặc điểm sinh lý của L casei và nơi phân bố 16

1.3.3 Vai trò của L casei đối với hệ tiêu hóa 17

1.4 KỸ THUẬT BAO VI GÓI 19

1.4.1 Định nghĩa bao vi gói 19

1.4.2 Bao vi gói tế bào vi sinh vật 19

1.4.3 Cấu trúc hạt vi gói 19

1.4.4 Nguyên vật liệu cho vi gói 20

1.4.4.1 Cấu tạo của alginate 21

1.4.4.2 Tính chất của alginate 21

1.4.5 Các phương pháp vi gói 22

1.4.5.1 Phương pháp nhỏ giọt (nén ép) 23

1.4.5.2 Phương pháp nhũ tương hóa 23

1.4.5.3 Ưu nhược điểm của hai phương pháp vi gói 24

1.4.6 Vai trò của vi gói 25

1.4.7 Nghiên cứu khả năng bảo vệ vi sinh vật của phương pháp vi gói bằng

alginate 26

1.4.7.1 Nghiên cứu trong nước 26

1.4.7.2 Nghiên cứu ngoài nước 26

1.5 BỘT SỮA CHUA VÀ PHƯƠNG PHÁP SẤY PHUN 28

1.5.1 Bột sữa chua 28

1.5.2 Sấy phun 30

1.5.2.1 Ưu và nhược điểm của sấy phun 31

1.5.2.2 Các yếu tố gây chết tế bào vi sinh vật bởi sấy phun 32

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 35

2.2 VẬT LIỆU 35

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.2.2 Vật liệu và hóa chất 35

2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 35

2.2.2.2 Hóa chất 36

2.2.2.3 Môi trường 37

2.3 PHƯƠNG PHÁP 38

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1.1 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn L casei 40

2.3.1.2 Vi gói vi khuẩn L casei với Natri alginate 44

2.3.1.3 Sấy phun tạo bột sữa chua probiotic 48

2.3.1.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm bột sữa chua 51

2.3.2 Các phương pháp phân tích thu nhận kết quả nghiên cứu 53

2.3.2.1 Các phương pháp phân tích vi sinh 53

2.3.2.2 Phân tích hóa sinh 53

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá cảm quan 54

54

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN L CASEI 55

3.1.1 Kiểm tra đặc tính sinh học của L casei 55

55

L casei 55

3.1.1.3 Khả năng lên men acid lactic của L casei 57

3.1.2 Khảo sát đặc tính probiotic của vi khuẩn L casei 58

3.1.2.1 Khả năng chịu pH thấp của dịch dạ dày 58

3.1.2.2 Khả năng chịu muối mật 60

3.1.2.3 Khả năng khử cholesterol 62

3.1.2.4 Khả năng sinh bacteriocin và các hợp chất tương tự bacteriocin 64

3.1.2.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao của L casei 65

3.2 VI GÓI VI KHUẨN L CASEI 68

3.2.1 Cấu trúc hạt vi gói 68

3.2.2 Hiệu suất vi gói L casei 69

3.2.3 Chọn nồng độ chất vi gói và phương pháp vi gói thích hợp 71

3.2.3.1 Khảo sát khả năng sống sót của L casei vi gói trong môi trường

SGJ pH 2 71

3.2.3.2 Khảo sát khả năng sống sót của L casei vi gói ở nhiệt độ cao 74

3.3 KHẢO SÁT TỈ LỆ PHỐI TRỘN MALTODEXTRIN VÀ CÁC THÔNG

SỐ KỸ THUẬT CỦA QUÁ TRÌNH SẤY PHUN TẠO BỘT SỮA CHUA PROBIOTIC VỚI CHẾ PHẨM VI GÓI L CASEI 77

3.3.1 Khảo sát tỉ lệ phối trộn Maltodextrin 77

3.3.2 Khảo sát nhiệt độ không khí đầu vào 79

3.3.3 Khảo sát thông số lưu lượng dịch phun 81

3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN CỦA PHƯƠNG PHÁP VI GÓI

TÍNH PROBIOTIC CỦA L CASEI TRONG QUÁ TRÌNH TẠO SẢN PHẨM

BỘT SỮA CHUA 83

3.4.1 So sánh khả năng sống sót của vi khuẩn L casei dạng tự do và vi gói

ngay sau quá trình sấy phun 83

3.4.2 Vai trò bảo vệ của phương pháp vi bao tế bào lên tỷ lệ sống sót của L casei trong môi trường SGJ pH 2 qua các giai đoạn 86

3.4.3 Khả năng sống sót trong môi trường muối mật (0.3%) qua các giai đoạn 88

3.4.4 Khả năng bảo toàn đặc tính probiotic của vi khuẩn L casei qua các giai

đoạn 90

3.4.4.1 Khả năng sinh các hợp chất bacteriocin và các hợp chất kháng khuẩn

tương tự bateriocin 90

3.4.4.2 Khả năng khử cholesterol 90

3.5 SẢN PHẨM BỘT SỮA CHUA PROBIOTIC 91

3.5.1 Khảo sát tỉ lệ hoàn nguyên bột sữa chua 91

3.5.2 Theo dõi thời gian bảo quản sản phẩm 93

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 95

4.2 ĐỀ NGHỊ 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… i

PHỤ LỤC ……… xiii

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

từ rất lâu trước đây cho đến các sản phẩm hiện đại được sản xuất theo dây chuyền công nghiệp như sữa tươi thanh trùng, tiệt trùng, sữa nguyên kem, …Tất cả nhằm nâng cao chất dinh dưỡng, đa dạng hóa sản phẩm và bảo quản sữa tốt hơn

Sữa chua là một trong những sản phẩm nổi tiếng nhất của các loại thực phẩm có chứa men vi sinh sống (probiotic) Các loài vi khuẩn lactic được sử dụng đã tạo nên đặc tính chuyên biệt của sản phẩm về hương và vị Nhiều bằng chứng cho thấy rằng các loài vi khuẩn sử dụng trong quá trình lên men sữa chua cho thấy khả năng hữu hiệu giúp con người kháng lại sự gây nhiễm và gây viêm ở ruột [37]

Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic được duy trì với một số lượng lớn khi đi qua đường tiêu hóa của người vẫn còn là một thách thức lớn đối với việc phân phối hiệu quả những vi khuẩn có lợi này [8] Bởi vì nhiều vi khuẩn probiotic khó có thể tồn tại trong môi trường có nồng độ acid thấp và muối mật của đường tiêu hóa [16], [88]

Bên cạnh đó, thời hạn sử dụng của sữa chua rất ngắn, khoảng 1 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng (25-300C) và khoảng 5 ngày ở 70C hoặc 10 ngày ở 40C và đây là mối quan tâm cho việc phát triển các sản phẩm có chứa các vi sinh vật có hoạt tính sinh học [43]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

Phương pháp sấy phun hiện nay được nghiên cứu và sử dụng phổ biến vì phương pháp này có thể loại bỏ độ ẩm ở tỷ lệ cao, chi phí thấp và rút ngắn quá trình sản xuất Một đặc tính quan trọng của phương pháp này là vẫn giữ được tính ổn định của sản phẩm và có thể thực hiện được ở qui mô sản xuất lớn [79]

Với phương pháp sấy phun, không những giúp cho quá trình lưu trữ và bảo quản sữa chua được lâu dài mà vẫn giữ được mật độ vi sinh vật nhất định trong sản phẩm Vấn đề lớn đặt ra cho việc ứng dụng phương pháp sấy phun sữa chua là việc bảo tồn khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trong và sau khi sấy khô Bởi vì các vi khuẩn lactic khá nhạy cảm với nhiệt

Hiện nay, kỹ thuật bao vi gói vi sinh vật có thể bảo vệ tốt tế bào vi sinh vật ở môi trường cực đoan như hệ tiêu hóa (môi trường acid ở dạ dày, muối mật ở ruột non) [22] Tuy nhiên, khi sấy phun ở nhiệt độ cao, bao vi gói có thể bảo vệ hữu hiệu tế bào

vi khuẩn hay không?

Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ―Khảo sát ảnh

hưởng của phương pháp vi gói bằng Natri alginate lên số lượng và hoạt tính

probiotic của Lactobacillus casei trong quá trình tạo bột sữa chua‖ với mục tiêu

nhằm: bảo vệ tế bào vi khuẩn Lactobacillus casei trong quá trình sấy phun ở nhiệt độ

cao đồng thời vẫn giữ được đặc tính probiotic của vi khuẩn này trong sản phẩm bột sữa chua

Nội dung nghiên cứu chính của đề tài bao gồm:

 Khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus casei: đặc tính sinh học,

đặc tính probiotic và khả năng chịu nhiệt độ cao

 Khảo sát hiệu quả vi gói tế bào với Natri alginate nhằm chọn được nồng độ và phương thức vi gói thích hợp để bảo vệ tế bào trong các điều kiện cực đoan của

hệ tiêu hóa và điều kiện kỹ thuật

 Khảo sát các chế độ sấy phun sữa chua kết hợp với chất vi gói bảo vệ vi sinh vật

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

 Tái khảo sát đặc tính probiotic của vi khuẩn Lactobacillus casei trong bột sữa

chua sau sấy phun và thời gian bảo quản sản phẩm

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1.1 HỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG DẠ DÀY – RUỘT Ở NGƯỜI

Hệ tiêu hóa của người gồm: dạ dày, ruột non và ruột già Với pH của dịch bên trong thấp (khoảng pH 2), dạ dày được xem là hàng rào hóa học chống lại sự xâm nhập của các vi khuẩn lạ vào đường ruột Người ta thấy rằng số lượng vi khuẩn ở dạ dày nói chung rất thấp, mật độ cao nhất khoảng 104 tế bào/ml dịch ruột Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự tồn tại của lactobacilli và streptococci tại vị trí này Tuy nhiên, không tồn tại bất cứ hệ vi sinh vật nào nổi bật [61]

Đường ruột gồm ruột non và ruột già Ruột non được chia thành 3 phần: tá tràng (duodenum), hỗng tràng (jejunum) và hồi tràng (ilenum) [45] Tá tràng kế tiếp dạ dày nên bên trong tá tràng pH khá thấp và cũng không có hệ vi sinh vật chiếm ưu thế Từ tá tràng xuống hồi tràng, pH bên trong trở nên ít acid và số lượng vi khuẩn tăng dần, có thể đạt từ 105-107 tế bào/gram vật chất bên trong ruột [61]

Vị trí của ruột già bắt đầu từ manh tràng (cecum), nơi nối với hồi tràng, gắn với kết tràng lên (ascending colon), kết tràng ngang (transverse colon), kết tràng xuống (descending colon), kết tràng xích ma (sigmoid colon) và trực tràng (rectum) [4]

Trong kết tràng, các vi khuẩn hiện diện với số lượng lớn, chúng có thể sử dụng một số sản phẩm của quá trình tiêu hóa thức ăn để làm chất dinh dưỡng và tạo nên môi

trường lên men đặc biệt Các vi khuẩn hiếu khí tùy ý (như Escherichia coli) có thể hiện

diện ở đây nhưng với số lượng thường nhỏ hơn các vi khuẩn khác, thường ít hơn 107 tế bào/gram khối lượng vật chất bên trong ruột Hoạt động của các loài vi khuẩn hiếu khí tùy ý này tiêu thụ khí oxy và tạo nên một môi trường kỵ khí nghiêm ngặt cho ruột già Điều này thuận lợi cho sự phát triển dồi dào các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc gồm:

Clostridium và Bacteroides, khiến cho số lượng của chúng có thể lên đến 1010 – 1011 tế bào/gram khối lượng vật chất bên trong ruột [61] Tại đây, các vi khuẩn này sản sinh một loạt các chất có thể ức chế và kiểm soát sự tăng trưởng của riêng mình, cũng như

sự tăng trưởng của các loài khác Ví dụ, một số vi khuẩn có thể sinh các chất kháng khuẩn (bacteriocin) Một trong những sản phẩm tốt nhất của bacteriocin được biết đến

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

là colicin, được sản xuất từ các chủng Escherichia coli (E coli) Các acid béo chuỗi

ngắn như acid acetic, propionic và butyric cũng có tác dụng ức chế sự tăng sinh của vi khuẩn [69]

Trong ruột người, các vi sinh vật hiện diện ở cả ruột non và ruột già, nhưng phần lớn tập trung ở cuối hồi tràng và kết tràng Người ta cho rằng có khoảng 50 giống

vi khuẩn cư trú ở kết tràng, gồm vài trăm loài vi khuẩn khác nhau Bacteroides là vi

khuẩn kỵ khí hình que, Gram âm và chiếm khoảng 30% tổng số hệ vi sinh phân Những nhóm vi khuẩn ưu thế khác gồm: Bifidobacteria, Lactobacilli, Eubacteria, Clostridia Ngoài ra, Enterococci và Coliforms cũng tồn tại ở đây nhưng với tỷ lệ thấp hơn [30]

Qua các nghiên cứu khoa học, người ta ước tính có hơn 400 loài vi khuẩn cư trú trong ruột người, nhưng chỉ 30-40 loài tạo thành 99% hệ vi sinh vật đường ruột có thể nuôi cấy được Các nhân tố môi trường, những tác động sinh lý và chế độ ăn uống có thể chi phối sự phân bố của hệ vi sinh vật ở ruột Trong đó, chế độ ăn uống là nhân tố chính điều hòa mật độ và tần số xuất hiện của các loài và các nhóm vi sinh vật định cư trong ruột [69]

Cấu trúc của đường dạ dày – ruột người và sự phân bố của các vi sinh vật không gây bệnh chủ yếu được mô tả ở hình 1.1

Gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp tiếp cận mới trong nghiên cứu vi sinh vật, các nhà nghiên cứu nhận thấy các phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống đã bỏ sót một số lượng đáng kể các vi sinh vật trong hệ vi sinh vật đường ruột so với các phương pháp sinh học phân tử như: FISH (fluorescent in situ hybridization), dot-blot Sử dụng những kỹ thuật này, các nhà khoa học đã phát hiện được Bifidobacteria chiếm 109-1010 tế bào/gram trọng lượng khô của phân (Langendijk và c.s., 1995; Harmsen và c.s., 1999) Trước đây, do những đánh giá không chính xác về tổng số vi sinh vật được nuôi cấy, số lượng Bifidobacteria và Lactobacilli trong phân người trưởng thành đã được đánh giá lần lượt khoảng 10% và 2% (Moore và c.s.,

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1974; Mitsuoka, 1992) và gần đây được ước tính lại khoảng 3% và <1% khi sử dụng FISH hoặc dot-blot (Sghir và c.s, 2000) [96]

Người ta cũng nhận thấy số lượng Lactobacilli ở phân trẻ em tương tự người lớn, nhưng Bifidobacteria có thể biến đổi từ 60-90% trong tổng số vi sinh vật ở trẻ bú sữa mẹ và trung bình là 50% đối với trẻ uống sữa ngoài (Harmsen và c.s., 2000) Mặt khác, ứng dụng kỹ thuật DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), các nhà nghiên cứu phát hiện hệ vi sinh vật chiếm ưu thế ở đường dạ dày-ruột của người trưởng thành rất phức tạp nhưng ổn định rõ rệt, ở trẻ lớn ít phức tạp và khá ổn định và ở trẻ nhỏ thì không ổn định và đang phát triển (Zoetendal, 1998) [96]

Trong quá trình tiêu hóa thực phẩm trong đường dạ dày-ruột, nước rút dần khỏi thức ăn đã được tiêu hóa, các vật chất tiêu hóa này dần dần trở nên cô đặc hơn và sau cùng biến đổi thành phân với 1/3 trọng lượng của phân là các vi khuẩn Cùng lúc với quá trình này, các vi sinh vật sống trong ruột già liên tục đào thải ra ngoài theo dòng chảy của vật chất trong đường dạ dày-ruột, những vi khuẩn bị mất đi sẽ được thay thế

Hình 1.1 Sự phân bố vi sinh vật trong đường tiêu hóa người [99]

Hệ vi sinh vật trong đường ruột

Dạ dày

Tá tràng Hỗng tràng

Hồi tràng

Ruột già

Và …

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

bởi những thế hệ mới [61]

1.2 ĐỊNH NGHĨA, VAI TRÕ VÀ CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA PROBIOTIC

1.2.1 Định nghĩa của probiotic

Probiotic bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life) và ngày

nay được dùng để gọi những vi sinh vật có liên quan đến những hiệu quả có lợi trên con người và động vật Nói về lịch sử của probiotic, chúng ta không thể không nhắc đến Elie Metchnikoff (1845-1916), một nhà khoa học công tác tại viện Pasteur ở Paris

và đã từng nhận giải Nobel Y Học (1908) vì khám phá của ông về quá trình thực bào Ông nổi tiếng với những nghiên cứu tiên phong trong lĩnh vực miễn dịch học và là người đầu tiên đã đưa ra liệu pháp chữa trị bằng các vi khuẩn lactic Nhà khoa học người Ucraina này cho rằng: ―sự phụ thuộc của các vi sinh vật đường ruột vào thực phẩm khiến cho nó có thể chấp nhận các biện pháp làm thay đổi hệ vi sinh vật trong cơ thể chúng ta và có thể thay thế những vi sinh vật có hại bằng những vi sinh vật có lợi‖ (Metchnikoff, 1908) Cùng thời đó, bác sĩ nhi khoa Henry Tissier đã theo dõi những đứa trẻ bị tiêu chảy Ông nhận thấy phân của những bệnh nhi này chứa ít vi khuẩn khác thường, có hình dạng chữ Y Ngược lại, những vi khuẩn chẻ đôi này lại có rất nhiều ở những trẻ khỏe mạnh (Tisier, 1906) Ông cho rằng những vi khuẩn này có thể giúp cho bệnh nhân tiêu chảy phục hồi sức khỏe của đường ruột [31], [50], [69], [87]

Những nghiên cứu trên của Metchnikoff và Tisier đã tạo nên những tiền đề có tính khoa học về vi khuẩn probiotic Mặc dù vậy, thuật ngữ probiotic vẫn chưa được biết đến, mãi cho đến khi Lilly và Stillwell đặt tên cho những chất tạo bởi một vi sinh vật có tác dụng kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác (Lilly và Stillwell, 1965) Packer là người đầu tiên đã sử dụng thuật ngữ probiotic theo ý nghĩa gần với định nghĩa được chấp nhận ngày nay Ông định nghĩa ―probiotic là những sinh vật và những chất góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột‖, nhưng chất trong định nghĩa của Parker tại mang ý nghĩa bao quát gồm cả chất kháng sinh Fuller sau đó đã nỗ lực

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

để cải tiến định nghĩa probiotic của Parker và định nghĩa lại như sau: ―probiotic là phần

bổ sung vào thực phẩm những vi sinh vật sống, tạo những ảnh hưởng có lợi trên động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ‖ (Fuller, 1989) Sau đó, một định nghĩa tương tự về probiotic đã được đưa ra bởi Havenaar và c.s., (1992): ―Probiotic là một hoặc hỗn hợp vi khuẩn có thể tồn tại được khi đưa vào

cơ thể động vật hoặc con người và tạo nên những tác động có ích trên vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật của vật chủ‖ Gần đây hơn, một định nghĩa khác

về probiotic cũng được đưa ra: ―Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt trên sức khỏe của cơ thể chủ‖ (Guarner và c.s., 1998) [31], [50], [69], [87]

1.2.2 Vai trò của probiotic

Đã có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về những lợi ích của các thực phẩm lên men và probiotic Những hiệu ứng liên quan đến sức khỏe có thể đúc kết như sau:

1.2.2.1 Không dung nạp Lactose

Những người bị khiếm khuyết enzyme β-galactosidase bẩm sinh không có khả năng tiêu hóa và hấp thụ lactose Ở các bệnh nhân này, các vi khuẩn hoạt động chuyển hóa lactose và có thể tạo ra các chất gây buồn nôn, sưng phồng và tiêu chảy

Lactobacillus bulgaricus (L bulgaricus) và các Lactobacilli khác thường được dùng

trong các sản phẩm sữa lên men có tác dụng làm giảm lactose trong sản phẩm Báo cáo

của Kilara và c.s., (1975) cho rằng sữa chua chứa L bulgaricus và Streptococcus

thermophilus (S thermophilus) có lợi cho những người không có khả năng dung nạp

lactose Khám phá này sau đó được củng cố bởi các nghiên cứu của Gilliland và c.s,

(1984), Marteau và c.s (1990) [69], [82]

Những tác dụng có lợi của các sản phẩm lên men vi sinh lên việc dung nạp lactose được giải thích bởi ba cách Thứ nhất, nồng độ lactose thấp trong các thực phẩm lên men do hoạt động của lactase cao ở các chế phẩm lên men Thứ hai, các sản phẩm lên men kích thích hệ enzyme lactase trong ruột non hoạt động Thứ ba, bản thân

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

vi sinh vật cũng có hoạt tính lactase cao Ở sản phẩm sữa chua, vi khuẩn sinh ra các enzyme β-galactosidase và lactose được chuyển thành acid lactic Do đó, nó giúp cải thiện quá trình không dung nạp lactose rất hiệu quả Theo Salminen và c.s., (2004), β-galactosidase có thể phát hiện trong tá tràng và hồi tràng sau khi tiêu thụ sữa chua tươi [84]

1.2.2.2 Chống nhiễm đường tiết niệu

E coli từ ruột, thường là tác nhân gây ra bệnh đường tiết niệu ở phụ nữ Những

nghiên cứu sử dụng các viên thuốc chứa các chủng Lactobacillus GR-1, B-54 và

RC-14 đã thu được kết quả khả quan trong việc phục hồi hệ sinh vật đường tiết niệu Bằng

cách gia tăng hàng rào Lactobacillus ở âm đạo, người ta cho rằng tác nhân gây bệnh sẽ

khó xâm nhập vào bàng quang, vì vậy ngăn chặn được hiện tượng nhiễm trùng gây ra bởi tác nhân này [31]

1.2.2.3 Bệnh viêm ruột

Viêm loét ruột kết và bệnh Crohn‘s là những bệnh viêm ruột thường gặp ở Mỹ

và Tây Âu Một vài loại thuốc được chỉ định cho việc chữa trị những căn bệnh này, tuy nhiên bệnh thường tái phát sau một thời gian chữa trị Nguyên nhân của các bệnh viêm ruột này không rõ ràng, có thể liên quan đến việc gây tổn thương của niêm mạc do vi sinh vật, các yếu tố tâm lý và thói quen ăn uống Các nghiên cứu cho thấy sử dụng probiotic có thể làm giảm viêm và triệu chứng của bệnh viêm ruột kết Hơn nữa, những kết quả sơ bộ ở mô hình động vật cũng chứng tỏ probiotic tạo ảnh hưởng tích cực trên bệnh viêm ruột kết ở chuột (Madsen, 1999 ; Steidler và c.s, 2000) Một vài kết quả

khác cũng được mô tả ở người như: việc sử dụng L rhamnosus GG ở những bệnh nhân

bị bệnh Crohn‘s đẩy nhanh phản ứng miễn dịch IgA đường ruột (Malin và c.s., 1996)

Mặt khác, một cuộc nghiên cứu sơ bộ trên 4 trẻ em bị bệnh Crohn‘s nhẹ cho thấy L

rhamnosus GG có thể cải thiện chức năng hàng rào của ruột và tình trạng bệnh lý

(Gupta và c.s., 2000) [44]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1.2.2.4 Ung thư ruột kết

Vai trò của probiotic trong việc ngăn chặn ung thư ruột kết gần đây đang được xem xét Người ta thấy rằng hiện tượng đột biến xảy ra trong các tế bào ruột kết có thể gây ra ung thư và các amin thơm dị vòng hình thành trong quá trình chế biến thức ăn

có thể là tác nhân tiềm tàng gây ung thư ruột kết Các nghiên cứu in vitro đã chứng

minh rằng vách tế bào của vi khuẩn lactic có thể gắn kết các amin dị vòng Các vi khuẩn lactic hoặc các sản phẩm sữa lên men đều thể hiện tác dụng kháng các chất gây

đột biến trong các thử nghiệm đột biến Salmonella typhimurium hoặc trên mô hình

động vật (Renner, 1991) [44], [69]

Ngoài ra, các vi sinh vật đường ruột có thể tạo ra butyrate, một acid hữu cơ tạo

ra ở ruột kết có tác dụng ức chế hoạt tính gây độc của nhiều hợp chất trong tế bào ruột kết ở người (Abrahamse và c.s., 1999) Hoạt động của các chất gây ung thư có thể bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các enzyme vi khuẩn như: NADPH dehydrogenase, nitroreductase, β-glucosidase, β-glucuronidase và 7-α-dehydroxylase; các enzyme này

biểu hiện nhiều ở các Enterobacteria, Bacteroides và Clostridia, nhưng biểu hiện thấp ở các Lactobacillus và Bifidobacterium Các enzyme này có hại đối với màng nhày ruột

kết vì chúng tham gia vào sự tái sinh của các chất gây độc (Hawksworth và c.s., 1971) Những nghiên cứu khá triển vọng về probiotic đối với bệnh ung thư ở động vật và

người trong điều kiện in vitro và in vivo đã được thực hiện, nhưng chưa thu được

những kết quả đáng mong đợi Một số nghiên cứu công bố việc sử dụng sữa chua làm giảm tác động của ung thư ruột kết ở vài cá nhân (Young và c.s., 1988), nhưng các nghiên cứu khác lại không đạt được những hiệu quả như vậy (Kampman và c.s., 1994)

Do đó, cần thêm nhiều nghiên cứu nữa về vấn đề này trước khi có thể xác định chắc chắn những ảnh hưởng có lợi của probiotic trong việc ngăn chặn bệnh ung thư ruột kết

ở người [44], [69]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1.2.2.5 Ngăn ngừa và điều trị bệnh do nhiễm Helicobacter pylori

Helicobacter pylori (H pylori) là một trong số ít vi khuẩn có thể tồn tại ở niêm

mạc dạ dày Trong một số trường hợp, chúng có thể gây viêm dạ dày, loét hệ thống tiêu

hóa và ung thư dạ dày Việc sử dụng probiotic để chống lại H pylori là một ứng dụng khá mới mẻ Các nhà khoa học nhận thấy rằng chủng L acidophilus LB có thể tiết ra một chất kháng khuẩn chống lại H pylori trong điều kiện in vitro Làm giảm khả năng kết bám và phát triển của H pylori vào các tế bào ruột HT29-MTX ở người được nuôi cấy (Coconnier, 1997) Ngoài ra, L salivarius cũng cho thấy khả năng ngăn chặn yếu

tố nhiễm H pylori ở người (Sakamoto, 2001) Trong một cuộc nghiên cứu trên những người bị nhiễm H pylori tình nguyện, sữa chua LC1 chứa L johsonnii La1 đã làm giảm mật độ H pylori và làm giảm chứng viêm trong xoang (Felley, 2001) L gasseri cũng làm giảm nhiễm H pylori và chứng viêm niêm mạc ở người (Sakamoto, 2001)

[44]

1.2.2.6 Giảm cholesterol

Rất nhiều nhà nghiên cứu đề xuất các chế phẩm probiotic có tác dụng giảm cholesterol hiệu quả Tuy nhiên, cơ chế của hiệu ứng này vẫn chưa giải thích chắc chắn Có hai giả thuyết để giải thích cơ chế Một trong số đó là vi khuẩn có thể gắn hoặc kết hợp cholesterol trực tiếp vào màng tế bào Thứ hai, enzyme thủy phân muối mật kết hợp với muối mật mà có nhiều khả năng kết hợp phân hủy cholesterol [76]

Khi nghiên cứu về việc giảm cholesterol đã cho thấy rằng L reuteri CRL 1098

giảm cholesterol toàn phần 38% khi nó được đưa vào cơ thể chuột trong 7 ngày với tỷ

lệ 104 tế bào/ngày Cũng với liều lượng L reuteri này, triglyceride giảm 40%, không

có sự di chuyển hệ vi sinh vào lá lách và gan [93]

1.2.3 Một số cơ chế phân tử liên quan đến hoạt động của Probiotic

Những lợi ích liên quan đến sức khỏe con người của các probiotic ngày càng được công bố nhiều, nhưng phần lớn các cơ chế chính xác về hoạt động của chúng vẫn chưa được hiểu rõ Gần đây, những nghiên cứu dựa trên phân tử và bộ gen đang bắt

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

đầu cung cấp những hiểu biết sâu hơn về các phương thức mà các probiotic cảm ứng và thích nghi với môi trường bên trong đường tiêu hóa Dưới đây là một số cơ chế phân tử liên quan đến hoạt động của chúng trong đường dạ dày - ruột

1.2.3.1 Sự tồn tại và sống sót của probiotic trong đường dạ dày-ruột

Nhiều đặc điểm liên quan đến sự sống sót của probiotic trong khi di chuyển qua đường dạ dày–ruột được nghiên cứu Trong đó, 2 đặc điểm quan trọng nhất là khả năng chịu đựng môi trường acid dạ dày và khả năng chịu đựng nồng độ muối mật trong ruột non của vi sinh vật probiotic Gần đây, những gen được cảm ứng khi probiotic phơi bày với acid và muối mật đã được nhận diện Những gen này có thể đóng vai trò quan

trọng trong sự sống sót của probiotic ở đường dạ dày–ruột Những nghiên cứu in vivo

tiếp theo đo lường đột biến mất gen chịu đựng acid và chịu đựng muối mật liên hệ với những chủng hoang dại và những phản ứng của tế bào chủ tương ứng sẽ giúp trả lời rõ hơn về tầm quan trọng của sự chịu đựng acid và muối mật trong chức năng của probiotic [63]

Bên cạnh sự chịu đựng môi trường lý hóa của đường dạ dày–ruột, sự bám dính với các tế bào niêm mạc ruột để tạo nên hàng rào sinh học bảo vệ cũng được xem là đặc tính cần thiết đối với sự tồn tại của các chủng probiotic ở đây Việc gắn vào biểu

mô ruột cần thiết cho sự định cư của probiotic và sự tương tác trực tiếp giữa probiotic với các tế bào chủ dẫn đến sự ngăn chặn các tác nhân gây bệnh bằng sự cạnh tranh hoặc điều chỉnh các phản ứng của tế bào chủ

Những tiếp cận dựa trên bộ gen đang bắt đầu khám phá nhiều protein liên kết ở

bề mặt tế bào vi khuẩn có chức năng liên kết với dịch nhày và tế bào ruột, một số

nghiên cứu đã nhận diện được vài nhân tố kết bám ở L acidophilus Ngoài ra, sự kết bám đặc hiệu mannose của L plantarum cũng được nhận diện, người ta thấy rằng vi khuẩn gây bệnh đường ruột E coli có khả năng liên kết với các tế bào biểu mô thông qua các thụ thể mannose Do đó, các chủng probiotic có khả năng kết bám (như L

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

plantarum) có thể ngăn cản sự tấn công và sự định cư của E coli ở những vị trí liên kết

và bằng cách đó, sinh vật chủ sẽ được bảo vệ chống lại bệnh tật [63]

1.2.3.2 Probiotic điều chỉnh chức năng của tế bào chủ

Các probiotic được biết là có hiệu quả điều chỉnh các phản ứng miễn dịch và hàng rào ruột Những cơ chế liên quan đến vấn đề này có thể được khám phá thông qua

các nghiên cứu in vitro về các phản ứng ở biểu mô ruột của sinh vật chủ hoặc các phản

ứng của tế bào miễn dịch với chủng probiotic Một số cơ chế này được mô tả chi tiết:

Các tế bào bạch tuộc (Dendritic cell – DC) có vai trò quan trọng trong việc bắt đầu nhận diện vi khuẩn, do đó quan trọng trong sự hình thành các phản ứng với tế bào

T (T cell) Một số probiotic (như L plantarum 299 và các probiotic của sản phẩm

VSL#3) có khả năng kích thích sự trưởng thành và biểu hiện của các tế bào DC theo các cách khác nhau, góp phần hỗ trợ các phản ứng miễn dịch với các tế bào T hỗ trợ (helper) Sự tương tác với các tế bào DC này xuất hiện một phần gián tiếp là nhờ vi khuẩn probiotic liên kết với PRR (pattern recognition receptor – thụ thể kiểu nhận diện), DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrin) Quan trọng là chỉ những chủng probiotic này mới có thể tương tác với DC-SIGN dẫn đến sự phát triển các tế bào T điều hòa sản xuất IL-10 (interleukin-10) [63]

Bên cạnh đó, các tế bào biểu mô ruột (Intestinal Epithelial Cells - IEC) và ruột kết (Colonic Epithelial Cells – CEC) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện vi khuẩn và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch Các nhà nghiên cứu nhận thấy

rằng tế bào IEC Caco-2 phản ứng lại sự hiện diện của Lactobacillus GG bằng cách làm

giảm quá trình sản xuất IL-8 (Interleukin-8) gây ra yếu tố α gây hoại tử khối u (TNF- α: Tumor necrosis factor - α) thông qua con đường truyền tín hiệu NF-kB [63]

Một cơ chế khác liên quan đến các probiotic của VSL#3 cũng được nhận diện Trong cơ chế này, các phức chất hòa tan tạo bởi các vi khuẩn probiotic này có thể ngăn chặn sự phân hủy của các chất ức chế NF-kB là I-kB trong các tế bào CEC ở chuột,

thông qua sự ức chế các proteasome Hơn nữa, L reuteri cũng cho thấy có thể ngăn

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

cản sự di chuyển của NF-kB vào nhân của các tế bào HeLa bằng cách ngăn chặn sự phân hủy của I-kB Những cơ chế hoạt động ở trên của probiotic chứng tỏ các probiotic

có khả năng làm giảm hiện tượng viêm ở ruột [63]

Ngoài ra, sự tăng cường hàng rào ở ruột là một cơ chế hoạt động khác của

probiotic Chủng probiotic E coli Nissle 1917, có khả năng gây ra sự biểu hiện của

peptide kháng khuẩn β-defensin-2 (hBD2) thông qua các nhân tố NF-kB và AP-1 (activating protein-1) Sự hoạt hóa hBD2 có thể dẫn đến sự tăng cường hàng rào niêm mạc ruột Điều đó phần nào giải thích được khả năng của các probiotic đặc hiệu ức chế

sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong đường dạ dày– ruột Hơn nữa, các protein sốc nhiệt (Heat shock protein – Hsp) đặc biệt được biết là có khả năng giữ được tình trạng nguyên vẹn của bộ khung xương tế bào cũng được tạo ra trong các tế bào IEC khi

có mặt các probiotic của VSL#3 Trong một nghiên cứu tiếp theo, các nhà nghiên cứu

cũng kết luận rằng các nhân tố hòa tan của Lactobacillus GG cũng gây ra các Hsp

tương tự ở các tế bào CEC ở chuột và hoạt hóa vài MAPK (mitogen-activated protein kinases – protein kinase hoạt hóa tác nhân gây phân bào) liên quan đến con đường

truyền tín hiệu nội bào dẫn đến sự biểu hiện của Hsp Ngoài ra, Lactobacillus GG cũng

được phát hiện là có khả năng ngăn chặn hiện tượng apoptosis bằng cách hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu ở IEC Những khám phá này cho thấy probiotic có thể điều chỉnh chức năng hàng rào của ruột thông qua nhiều cơ chế khác nhau [63]

Bên cạnh đó, Lactobacillus GG có khả năng tương tác với các tế bào DC gây ra

các tế bào T CD4+ kích thích giảm đáp ứng miễn dịch trong thí nghiệm in vitro, cũng

có những ảnh hưởng tương tự trên các tế bào DC của những bệnh nhân bị bệnh

Crohn‘s và những người tình nguyện khỏe mạnh sau khi tiêu thụ Lactobacillus GG

[17]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

Tóm lại, các vi sinh vật probiotic có khả năng điều chỉnh một số chức năng của

tế bào chủ Một số hoạt động chức năng này của probiotic liên quan đến các phân tử

của vi khuẩn và tế bào chủ được mô tả tóm tắt ở hình 1.2 Các chủng probiotic

Lactobacillus có thể gây ra các tế bào T điều hòa (regulatory T cell – T reg) sản xuất

IL-10 thông qua sự tương tác với DC-SIGN (1) Chúng cũng có thể gây ra các tế bào T

CD4+ giảm đáp ứng miễn dịch sau sự tương tác với tế bào DC (2) Thành phần cấu tạo của LTA (lipoteichoic acid) chịu trách nhiệm về sự điều chỉnh khác nhau cho việc sản xuất cytokine (3) Sự điều chỉnh các phản ứng viêm bằng cách bất hoạt con đường truyền tín hiệu NF-kB, điều này đạt được thông qua sự ức chế proteasome sau khi tế bào IEC nhận diện các thành phần hòa tan của probiotic (4), hoặc sau sự nhận diện các motif của vi khuẩn (sự nhận diện CpG DNA bởi các thụ thể TLR9) (6) Sự gây ra các Hsp (thông qua (4) hoặc (5) có tác dụng ổn định bộ khung xương tế bào (các actin) sẽ tăng cường hàng rào niêm mạc Sự tấn công và phát triển của các tác nhân gây bệnh có thể bị ức chế bởi sự chiếm cứ các thụ thể mannose bởi các chủng probiotic (7), hoặc

Hình 1.2 Mô hình về một số cơ chế phân tử của các tác động probiotic [63]

Các thành phần hòa tan

Tác nhân gây bệnh

thụ thể mannose

Tác nhân gây bệnh

Nhân

Tế bào M

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

bằng cách gây ra hBD2 trong các tế bào IEC (8) Tế bào M ở đây là một tế bào biểu mô đặc biệt, có vai trò hấp thu và chuyên chở kháng nguyên [63]

1.3 LACTOBACILLUS CASEI

1.3.1. Lactobacillus casei

Lactobacillus casei (L casei) là vi khuẩn Gram

dương, kỵ khí không hoàn toàn, không di động và

không sinh bào tử, có dạng hình que (kích thước tế bào

khoảng 0.7-1.1 x 2.0-4.0 mm) Được phân loại như

sau:

1.3.2 Đặc điểm sinh lý của L casei và nơi phân bố

Giống với những vi khuẩn acid lactic, L casei có khả năng chịu đựng được điều kiện acid cực đoan và acid lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men trao đổi chất Trong giống Lactobacillus, L casei là nhóm lên men theo con đường dị hình, sản

xuất acid lactic từ đường hexose theo lộ trình Embden-Meyerhof và từ pentose đến con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase [11] Nhiệt độ phát triển từ 150

C – 450C Riboflavin, acid folic, calcium pantothenate và niacin là những nhân tố yêu cầu cho quá trình phát triển và phát triển tối ưu ở pH từ 5.5 - 5.8 [49]

L casei là một sinh vật kỵ khí tùy ý, tạo năng lượng thông qua quá trình lên

men Hầu hết các chủng L casei có thể lên men galactose, glucose, fructose, mannose,

mannitol, N-acetylglucosamine và tagatose Khả năng lên men lactose ở các chủng phân lập từ ruột của người và pho mát thì phổ biến hơn trong các chủng phân lập từ các

Hình 1.3 L casei [98]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

nguyên liệu thực vật [19] Các điều kiện lên men như pH, nhiệt độ, các loại môi trường

phát triển, oxy, …, cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động phát triển của L

casei [39]

Các hợp chất quan trọng nhất mà L casei sản xuất là acid lactic Nó thu được

bằng quá trình lên men glucose và hình thành lactate Acid lactic có thể được sản xuất hóa học từ acetaldehyd và hydrogen cyanide hoặc lên men từ vi khuẩn Acid lactic được sử dụng rất nhiều cho quá trình công nghiệp như sản xuất các acid hữu cơ theo phương pháp hóa học và sinh học, sử dụng như một hương liệu trong thực phẩm, sản xuất mỹ phẩm và sản xuất các chất dẻo phân hủy sinh học [21]

L casei có thể được tìm thấy trong các môi trường khác nhau như sản phẩm

sữa nguyên liệu và lên men, các sản phẩm thực vật tươi và lên men, trong đường ruột

và hệ sinh dục của người và động vật [19] Các acid lactic được sản xuất bởi L casei

thông qua quá trình lên men là rất quan trọng vì nó có thể được sử dụng để làm pho mát và sữa chua; có chức năng giảm cholesterol, tăng cường đáp ứng miễn dịch, chống bệnh tiêu chảy, tăng khả năng dung nạp lactose, ức chế tác nhân gây bệnh đường ruột

và được sử dụng như các chế phẩm sinh học [66] Hữu hiệu trong việc thúc đẩy hoặc

hỗ trợ sự cân bằng các vi khuẩn sống có trong đường tiêu hóa [45]

L casei có khả năng thích ứng với nhiều hệ sinh thái Khu trú trong đường ruột,

L casei với chức năng như một probiotic (các vi sinh vật thúc đẩy sự phát triển của vi

sinh vật khác) [46] Những đặc tính thuộc về probiotic là khả năng chịu đựng được acid

và mật, kháng lại các vi sinh vật gây bệnh [66]

1.3.3 Vai trò của L casei đối với hệ tiêu hóa

L casei rất quan trọng trong việc điều hòa hệ miễn dịch của đường tiêu hóa Vi

khuẩn L casei sẽ liên kết với bề mặt khoang ruột và kích thích đường ruột liên kết với

mô bạch huyết [64] Điều này sẽ tăng cường phản ứng miễn dịch bẩm sinh và cung cấp khả năng miễn dịch của đường ruột và cơ thể Nghiên cứu của Perigon và c.s., (1988) thấy rằng khi cho chuột dùng sữa lên men trong 11 ngày với liều dùng 100 µg/ngày sẽ

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

kích thích hoạt động của bạch cầu và đại thực bào; hoạt động miễn dịch này xuất hiện vào ngày thứ 3, đáp ứng duy trì trong vòng 5 ngày và giảm nhẹ vào ngày thứ 8 [75]

Ngoài ra, L casei giúp điều hòa hệ miễn dịch, tránh tình trạng đáp ứng quá mức

dẫn đến hiện tượng viêm ở ruột Nghiên cứu của nhóm tác giả Hacini-Rachinel và c.s., (2009) cho thấy, sau 14 ngày cho chuột bị viêm ruột kết uống sữa lên men có bổ sung

L casei DN-114 001, chuột có hiện tượng giảm viêm đáng kể Nguyên nhân được giải

thích là L casei có thể ngăn chặn chức năng của tế bào T điều hòa nhân tố Foxp3+

CD4+ của biểu mô ruột (nhân tố kích thích viêm ruột kết) [40]

Để chống lại tác nhân gây bệnh có thể xâm nhập vào hệ thống miễn dịch, L

casei có thể cạnh tranh chất dinh dưỡng hoặc bám dính vào vùng bị tổn thương nhằm

chống lại tác nhân gây bệnh Kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy, L casei DN-114 001

có thể ngăn chặn hiệu quả sự bám dính của E.coli (gây ra bệnh Crohn‘ ở người) với tỷ

lệ từ 75-84% khi cho xâm lấn đồng thời L casei với E.coli lên dòng tế bào ruột 407 hay từ 43-62% khi xâm lấn lần lượt L casei tiếp theo là E.coli [48] Kết quả cũng xảy

ra tương tự, dòng L casei Shirota có thể giảm khả năng xâm lấn của 4 tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp là enterotoxigenic E coli (ETEC), Salmonella enteritidis, Shigella

dysenteriae và Vibrio cholera một cách hiệu quả khi nghiên cứu ở cấp độ in vitro [35]

L casei cũng có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh bằng cách giảm

độ pH thông qua việc sản xuất các acid hữu cơ như acetic, propionic, acid lactic hoặc

bằng cách sản xuất hydrogen peroxide Hơn nữa, L casei có thể tiết bacteriocin

(lacticin 705, caseicin A) là các peptide kháng khuẩn mang điện tích dương, các phân

tử amphiphilic, để thoát khỏi các tác nhân gây bệnh trong cơ thể [65]

Từ những dữ liệu nghiên cứu ở trên cho thấy L casei có vai trò quan trọng, góp

phần cân bằng hệ tiêu hóa, giữ cho chúng được khỏe mạnh bởi việc kháng lại nhiều tác nhân gây bệnh

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1.4 KỸ THUẬT BAO VI GÓI

1.4.1 Định nghĩa bao vi gói

Theo King (1995), bao vi gói được hiểu là quá trình tạo thành một lớp màng mỏng, như một lớp vỏ bọc gói gọn hoàn toàn khối vật chất trong lòng nó (phần lõi) Phần lõi này có thể ở dạng rắn, giọt lỏng hoặc bọt khí, lấp đầy vùng không gian bên trong lớp vỏ Cả hai hợp phần này tạo thành những hạt có kích thước khác nhau Dựa vào kích thước hạt, kỹ thuật bao gói được chia làm 3 loại sau [67]:

Bao gói lớn: kích thước hạt lớn hơn 5.000µm

Bao vi gói: kích thước hạt từ 0.2-5.000 µm

Bao siêu vi gói: kích thước hạt nhỏ hơn 0,2 µm

1.4.2 Bao vi gói tế bào vi sinh vật

Được định nghĩa là quá trình bẫy hoặc nhốt tế bào vi sinh vật bởi một lớp gel nước, có vai trò như lớp vỏ bọc để phân cách, bảo vệ tế bào với các ảnh hưởng của môi trường xung quanh và giải phóng chúng đúng thời điểm mong muốn của mỗi ứng dụng

cụ thể [53], [90]

Tác nhân giúp giải phóng hệ vi sinh vật được vi gói thường là: do thay đổi pH,

áp suất cơ học, tác dụng nhiệt xử lý (nhiệt độ nóng hoặc nhiệt lạnh), hoạt động enzyme,

áp suất thẩm thấu, một số hợp chất hóa học và thời gian lưu trữ, … [67]

1.4.3 Cấu trúc hạt vi gói

Mỗi hạt vi gói bao gồm lớp gel ưa nước bao bọc tế bào vi sinh vật, còn gọi là vỏ bọc Vì vỏ có cấu trúc gel nên còn gọi là hạt gel Hình dạng hạt thường là hình cầu hoặc elip nên cũng được gọi là hạt vi cầu Hạt có bề mặt phẳng hoặc gồ ghề (hình 1.4/1.1) Mỗi hạt chứa một hoặc nhiều tế bào vi sinh vật

Khi vi gói tế bào, chất lỏng qua khe hở lấp đầy không gian bên trong hạt Vết nứt trên bề mặt hoặc sâu bên trong có thể xuất hiện ở hạt (hình 1.4/1.1) Sự gia tăng vết nứt dẫn đến hình thành lỗ và như vậy làm giảm hiệu quả vi gói

Ngoài ra, hạt vi gói còn có thể được bọc bằng 2 lớp hợp chất hóa học để tăng

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

hiệu quả vi gói Lớp thứ 2 được gọi là vỏ ngoài hoặc lớp bọc bổ sung (hình 1.4/1.3) [67]

1.4.4 Nguyên vật liệu cho vi gói

Có rất nhiều vật liệu tạo gel nhưng để sử dụng vi gói tế bào vi sinh vật cần đạt một số yêu cầu chính như sau [67]:

Dễ dàng tạo lớp gel bao quanh tế bào vi sinh vật

Không độc với cơ thể vật chủ, vi sinh vật (an toàn hoặc tương thích sinh học) Giá thành thấp

Điều kiện tiến hành, việc chuẩn bị và thao tác đảm bảo đơn giản

Giải phóng tế bào vi gói dễ dàng

Không mẫn cảm với sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men

Không hoặc ít tương tác với môi trường ngoài đến khi giải phóng phần lõi Hạn chế những vết nứt, rạn và kích cỡ lỗ phải phù hợp với mục đích vi gói Một số loại vật liệu thường dùng như: alginate và phức hợp, tinh bột, hỗn hợp xanthan-gelan, carrageenan và hỗn hợp, gelatin, cellulose acetate phethalate, … Trong

Hình 1.4 Cấu trúc hạt vi gói [67]

1.1 Hạt tế bào đơn: tế bào vi khuẩn (a), bề mặt không phẳng (b), bề mặt phẳng (c), bề mặt gãy (d); 1.2 Hạt đa tế bào: tế bào vi khuẩn (a), chất lỏng bên trong hạt (b), vỏ bọc (c); 1.3 Hạt tế bào vi gói: tế bào vi khuẩn (a), vỏ bọc (b), vỏ bọc ngoài (c)

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

đó, alginate là cơ chất thông dụng nhất

1.4.4.1 Cấu tạo của alginate

Alginate là polysaccharide dị hợp mạch thẳng được chiết tách từ các loại tảo khác nhau, với 2 đơn vị cấu trúc là β-D-mannuronic và α-L-guluronic acid Alginate hình thành từ sự liên kết giữa các monomer này ở các vị trí C-1 và C-4 bằng liên kết glucozide, tỉ lệ của 2 hợp phần này (mannuronic:guluronic acid) thường là 1:5 Dạng thương phẩm của alginate thường là Natri alginate Trọng lượng phân tử của alginate dao động từ 32-200 kdal, hấp thụ nước ở dạng muối của kim loại kiềm, magnesium, ammonia hoặc muối amin Alginate là tác nhân làm dày, ổn định và tạo gel rất thông dụng trong công nghiệp thực phẩm [15]

1.4.4.2 Tính chất của alginate

Đặc tính quan trọng của alginate là độ nhớt và khả năng tạo gel

a Độ nhớt dung dịch alginate: phụ thuộc bởi nhiều yếu tố Theo Belitz, và c.s.,

(1999) [15]:

Trọng lượng phân tử alginate: khi trọng lượng phân tử càng cao, độ nhớt càng cao

Tỉ lệ ion của muối: độ nhớt tỉ lệ thuận với nồng độ cation đa hóa trị Vì thế, khi

Hình 1.5 Cấu trúc của gel alginate [15]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

dung dịch alginate có tác nhân chelate (tác nhân xúc tác tạo thành hợp chất hữu cơ có nhiều hơn một liên kết với các ion kim loại trong dung dịch), độ nhớt sẽ giảm

Quá trình làm đông và rã đông dung dịch alginate: không ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch Tuy nhiên, khi có mặt ion Ca2+, quá trình làm đông và rã đông sẽ làm tăng độ nhớt của dung dịch

Nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10C, độ nhớt tăng 25% nhưng khi tăng nhiệt độ rồi lại

hạ nhiệt độ thì độ nhớt của dung dịch alginate thấp hơn ban đầu

Xuất xứ của nguồn tảo chiết xuất: tảo ôn đới thường có độ nhớt khá cao

Quá trình bảo quản: khi bảo quản ở nhiệt độ cao, alginate sẽ bị phân hủy và sau một thời gian thì độ nhớt của nó giảm xuống đáng kể

Giá trị pH của dung dịch: pH thấp, alginate sẽ bị mất điện tích âm, làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi và tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt, hình thành gel pH cao (pH>11) alginate bị cắt chuỗi polymer, dung dịch giảm độ nhớt do liên kết glucoside dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm

b Sự tạo gel của dung dịch alginate

Thông thường, dung dịch alginate (thường là Natri alginate) sẽ tạo gel hay tạo màng khi thêm vào dung dịch đa điện tích trái dấu (ion Ca2+) [15]

Tuy nhiên, cấu trúc gel sẽ bị yếu dưới điều kiện acid thấp (pH 2-3) Ở điều kiện này, mạng lưới liên kết chéo của ion Ca2+ bị thay thế khỏi mạng lưới alginate và nhóm cacboxyl còn lại của alginate sẽ bị proton hóa thành dạng acid alginic tan trong nước [72], [73] Hơn nữa, khi có mặt ion Na+, cấu trúc gel sẽ bị vỡ bởi liên kết chéo của ion

Ca2+ bị thay thế bởi ion Na+.[12], [72]

1.4.5 Các phương pháp vi gói

Từ cuối thập kỉ 80, phương pháp vi gói tế bào vi sinh vật đã được quan tâm nghiên cứu Có 2 hướng chính là phương pháp nén ép (extrusion) và phương pháp tạo nhũ (emulsion)

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1.4.5.1 Phương pháp nhỏ giọt (nén ép)

Phương pháp nhỏ giọt là phương pháp xuất hiện sớm nhất và được sử dụng phổ biến nhất với chất gói là loại gel tan trong nước (King, 1995) Nhìn chung, đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, nhẹ nhàng nên ít làm tổn thương tế bào Khả năng tương hợp sinh học và tính linh hoạt là những tính chất đặc biệt của phương pháp này [67]

Đầu tiên, huyền phù tế bào – alginate sẽ được đẩy xuyên qua kim tiêm để tạo các giọt nhỏ, rơi trực tiếp vào trong dung dịch chứa các cation canxi dưới dạng CaCl2 Ngay lập tức polymer alginate bao chung quanh tế bào và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+ Nồng độ phổ biến được sử dụng nằm trong khoản 1-2% cho alginate và 0.05–1.5M cho CaCl2 Hầu hết các giọt được tạo ra có đường kính 2-3 mm [53]

1.4.5.2 Phương pháp nhũ tương hóa

Phương pháp này đã được áp dụng thành công để vi gói vi khuẩn lactic, so với phương pháp nén ép, phương pháp vi gói với hệ nhũ tương có nhiều ưu điểm vượt trội nhưng yêu cầu kỹ thuật cao hơn (Audet, 1998 và Lacroix, 1990) [67]

Trong kỹ thuật này, pha phân tán là huyền phù tế bào, alginate được thêm vào 1 lượng dầu thực vật như dầu đậu nành, dầu hướng dương hay dầu bắp, đóng vai trò như pha liên tục (Groboillot, 1993) Dung dịch tạo thành sẽ đồng nhất hơn khi khuấy trộn với tốc độ thích hợp cho đến khi hệ nhũ tương hình thành [67]

Khi đã có hệ nhũ tương, thêm dung dịch CaCl2 vào ở dạng vi giọt để tạo mầm hạt gel trong pha dầu Tốc độ khuấy trộn hỗn hợp cũng là nhân tố quyết định đường kính hạt [53]

Đường kính hạt và nồng độ alginate là các yếu tố quyết định khả năng sống của

tế bào, sự trao đổi chất của chúng, giá trị cảm quan sản phẩm cuối cùng và khả năng phân tán các hạt trong sản phẩm (Picot, 2003a) [67]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

Phương pháp tiến hành vi gói: nhỏ giọt và nhũ tương hóa được mô tả như hình 1.6

1.4.5.3 Ưu nhược điểm của hai phương pháp vi gói

Phương pháp nén ép có ưu điểm về chi phí thấp, kỹ thuật đơn giản nhưng kích thước vi gói phụ thuộc lớn vào đường kính kim tiêm, quá trình tạo hạt và ổn định chất lượng hạt mất nhiều thời gian hơn kỹ thuật nhũ tương hóa nên thích hợp với quy mô sản xuất nhỏ Với kỹ thuật tạo nhũ tương, trong công nghiệp thực phẩm sẽ dễ dàng cơ

Hình 1.6 Kỹ thuật vi gói [53]

Các hạt Ca-alginate

Dung dịch muối alginate Tế bào vi sinh vật

Trộn

Kỹ thuật nhỏ giọt Kỹ thuật tạo nhũ

Tạo nhũ trong dầu thực vật

Giọt huyền phù tế bào- Alginate

Cho vào dung dịch CaCl 2 Cho giọt CaCl 2 vào hệ nhũ để tạo gel

Dịch lỏng

Tế bào vi sinh vật Alginate

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

giới hóa, mở rộng quy mô và tăng hiệu suất vì quá trình tạo hạt nhanh và ổn định chất lượng hạt, kích thước hạt nhỏ khó nhận biết trong thực phẩm, tạo cảm giác về cảm quan tốt Tuy nhiên, quá trình thực hiện phải qua công đoạn nhũ hỗn hợp huyền phù tế bào – chất tạo gel, chính chất tạo nhũ làm tăng chi phí sản xuất của kỹ thuật này [53]

[53]

1.4.6 Vai trò của vi gói

Vi gói có thể sử dụng hiệu quả cho việc tạo giống khởi động có khả năng sống cao dù trải qua quá trình lên men, bảo quản lạnh đông sâu hay điều kiện khắc nghiệt của quá trình chế biến (gia nhiệt, phối trộn, xử lý acid hoặc kiềm, …) (Picot, 2003a; Sultana, 2000) [67]

Bao vi gói có thể cải thiện đáng kể khả năng sống của tế bào vi sinh vật chống lại các nhân tố môi trường bất lợi trong quá trình chế biến thực phẩm: nồng độ acid cao, pH thấp, ảnh hưởng của oxy (trong trường hợp vi khuẩn kị khí bắt buộc), nhiệt xử

lý, quá trình bảo quản lạnh đông sâu, …; vì thế tăng thời gian bảo quản sản phẩm, đặc biệt với sản phẩm probiotic [67]

Các chỉ tiêu so sánh Nén ép Nhũ tương hóa

Tính khả thi trong công nghiệp

80 - 95%

2 – 5 mm

Dễ dàng Cao Thấp

80 - 95%

25 µm – 2 mm

Bảng 1 Ưu và nhược điểm của hai phương pháp vi gói cơ bản

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

1.4.7 Nghiên cứu khả năng bảo vệ vi sinh vật của phương pháp vi gói bằng alginate

1.4.7.1 Nghiên cứu trong nước

Đã có những nghiên cứu tiền đề cho thấy hiệu quả của kỹ thuật vi gói có khả năng bảo vệ vi khuẩn lactic trong các môi trường không thuận lợi, điển hình qua báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Thúy Hương và c.s., (2008) Nhóm tác giả báo cáo rằng,

vi khuẩn lactic dễ bị hao hụt trong môi trường sữa chua có độ acid cao, do đó đã tiến

hành thực hiện vi gói 2 chủng vi khuẩn L bulgaricus và S thermophillus bằng phương

pháp nhốt trong nguyên liệu Natri alginat Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt vi gói có kích thước 1,2 mm vừa có thể bảo vệ vi khuẩn, vừa không làm thay đổi chất lượng cảm quan sản phẩm sữa chua đậu nành [2]

Thông qua nguyên liệu hỗn hợp alginate – xanthan, nhóm nghiên cứu Liêu Mỹ

Đông và c.s., (2011) đã tiến hành vi gói vi khuẩn Bifidobacteria Bifidum với mục đích

nâng cao hoạt tính probiotic của vi khuẩn này Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nồng

độ Ca-Alginate được giữ cố định là 2.5%, hiệu quả bảo vệ vi sinh vật gia tăng khi gia tăng nồng độ Xanthan gum từ 0.1% đến 0.2% và đạt hiệu quả tốt nhất khi nồng độ Xanthan gum là 0.2% khi ủ chế phẩm vi gói này trong môi trường dạ dày nhân tạo [1]

1.4.7.2 Nghiên cứu ngoài nước

Qua các nghiên cứu cho thấy rằng việc cố định các vi khuẩn probiotic bằng phương pháp vi gói có thể cải thiện khả năng sống sót của những vi sinh vật này trong quá trình lưu trữ sản phẩm và trong quá trình di chuyển qua hệ tiêu hóa [27]; [57] Việc chọn lựa các loại vật liệu vi bao tùy thuộc vào các tính chất thuộc về chức năng của các chế phẩm sinh học và phương pháp vi gói được sử dụng (Hegenbart, 1993) [25]

Nghiên cứu của Lee và c.s., (2000) cho rằng tỷ lệ sống sót của Bifidobacterium

longum KCTC 3128 và HLC 3742 trong dịch dạ dày và muối mật được cải thiện một

cách đáng kể khi cố định chúng trong các hạt Calcium alginate có chứa 2, 3 và 4%

Natri alginate Họ kết luận rằng, tỷ lệ chết của bifidobacteria giảm tỉ lệ thuận với việc

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

tăng cả nồng độ gel alginate và kích thước hạt [57]

Kết hợp alginate và chitosan đóng vai trò như phản ứng succinyl (tăng cường chuyển đổi các anion để có thể giữ lại các proton) hay là acylation (tăng cường chất nền kỵ nước) được nhóm tác giả Canh Le-Tien và c.s., (2004) sử dụng cho việc nhốt các tế bào vi sinh vật Kết quả nghiên cứu của họ cho thấy, các hạt (với đường kính 3mm) được hình thành bởi quá trình đông tụ với dung dịch CaCl2 cho thấy đặc tính rất tốt về mặt cơ học Kết quả thí nghiệm cho thấy với tế bào tự do, không còn tế bào nào

của L rhamnosus sống sót khi bổ sung chúng vào trong dịch dạ dày (pH=1.5) Tuy

nhiên, đối với nghiệm thức vi khuẩn được vi bao trong các hạt alginate có tỷ lệ sống sót là 22-26% và tỷ lệ sống sót được cải thiện lên đến 60-66% trong các hạt được vi bao bằng hỗn hợp alginate và chitosan Tỷ lệ sống sót được ghi nhận cao nhất đối với

nghiệm thức vi khuẩn được vi bao bằng N- palmitoylaminoethyl alginate bởi vì vật liệu

này có thể giới hạn sự mất nước cho vi khuẩn trong môi trường acid [20]

Krasaekoopt và c.s., (2004) cũng có kết luận tương tự rằng hạt vi gói bằng

alginate bao bọc bên ngoài là chitosan có khả năng bảo vệ hữu hiệu đối với L

acidophilus và L casei trong dịch dạ dày nhân tạo pH=1.55 và dịch muối mật 0.6%

[54]

Với nồng độ alginate 3%, Ding và c.s., (2007) tiến hành vi gói 8 loại vi khuẩn

khác nhau: L rhamnosus, Bifidobacterium longum, L salivarius, L plantarum, L

acidophilus, L paracasei, B lactis type Bl-O4 và B lactis type Bi-07 Kết quả thí

nghiệm của họ cho thấy alginate có khả năng bảo vệ tế bào vi sinh vật trong các điều kiện môi trường cực đoan như acid của dạ dày (pH=2), muối mật (3%) và nhiệt độ cao (650C trong 30 phút) Báo cáo chỉ ra rằng, vi khuẩn probiotic được vi gói sống sót tốt hơn vi khuẩn tự do Trong môi trường có bổ sung muối mật 3%, tế bào vi khuẩn tự do giảm 6.51 log (CFU/mL), trong khi chỉ giảm 3.36 log (CFU/mL) ở vi khuẩn được vi gói trong thời gian là 8 giờ Sau 30 phút xử lý nhiệt độ 650C, tế bào vi khuẩn không được vi gói giảm 6.74 log (CFU/mL) trong khi tế bào được vi gói chỉ giảm 4.17 log

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

(CFU/mL) [28]

Tiếp theo các nghiên cứu trên về hỗn hợp vi gói alginate và chitosan, nhóm tác giả Li và c.s., (2011) đã kết hợp phối trộn nguyên liệu vi gói alginate-chitosan-

carboxymethyl chitosan dùng để vi bao vi khuẩn Lactobacillus casei ATCC 393 Tác

dụng bảo vệ của vi bao thể hiện rõ rệt khi ủ các hạt vi gói trong dịch dạ dày pH=2

trong 2 giờ và muối mật 1% trong 6 giờ, L casei vẫn còn sống sót với mật độ là 7.91

và 7.42 log (CFU/g) [58]

Từ những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy kỹ thuật bao vi gói

vi sinh vật bằng vật liệu alginate có thể bảo vệ tốt tế bào vi sinh vật ở môi trường cực đoan như trong môi trường cực đoan của hệ tiêu hóa (môi trường acid của dạ dày, muối mật ở ruột non) Tuy nhiên, khi sấy phun ở nhiệt độ cao, bao vi gói bằng alginate có thể bảo vệ hữu hiệu tế bào vi khuẩn hay không? Đó là vấn đề đang được quan tâm trong đề tài này

1.5 BỘT SỮA CHUA VÀ PHƯƠNG PHÁP SẤY PHUN

1.5.1 Bột sữa chua

Sữa chua là sản phẩm lên men từ sữa với vi khuẩn S thermophilus và L

bulgaricus rất giàu protein Sản phẩm này được người tiêu dùng ưa chuộng bởi hương

vị thơm ngon (chủ yếu là do acetaldehyde) và cấu trúc của nó

Tuy nhiên, thời hạn sử dụng của sữa chua là khá ngắn, 1 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng (25-300C) và khoảng 5 ngày ở 70C (Salji và c.s., 1987) và đây là yếu tố quan trọng cản trở việc thương mại hóa của sản phẩm Sữa chua luôn được duy trì ở mức 2 – 40C trong suốt chuỗi phân phối, không chỉ tránh được nguy cơ hư hỏng từ nấm men và nấm mốc mà còn ngăn chặn hoạt động hơn nữa bởi các giống khởi động Tuy nhiên, điều này làm tăng giá thành của sản phẩm [55]

Để nâng cao thời gian bảo quản của sữa chua, có thể thực hiện bằng cách hạ thấp hàm lượng nước có trong sản phẩm với việc loại nước của Whey Hoặc một cách khác nữa là sấy khô ví dụ như sấy đông khô, sấy phun hoặc sấy bằng vi sóng Với mục

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

đích chính là nhằm bảo vệ sản phẩm dạng bột trong một thời gian dài sử dụng với tính chất ổn định mà không cần để ở điều kiện lạnh Sữa chua sấy khô sẽ rất tiện lợi cho việc đóng gói và lưu trữ, đồng nghĩa với việc giảm chi phí do giảm khối lượng và không cần trữ lạnh trong khâu vận chuyển Nhưng vẫn giữ được các thuộc tính ban đầu vốn có của sữa chua [55]

Bằng chứng của sản phẩm bột sữa chua có thể được tìm thấy ở vùng Tây Á; ở Turkestan, sản phẩm được gọi là churpi hoặc zurpi [91] Bột sữa chua, được sản xuất bằng cách làm khô sữa chua tươi, có thể được sử dụng như thành phần để sản xuất các sản phẩm thực phẩm như bánh kẹo, sữa chua uống trộn với trái cây hoặc rau quả, hỗn hợp thức uống nhanh, thành phần chính của súp, nước chấm và nước sốt cũng như trực

tiếp tiêu thụ sau khi hoàn nguyên [55] Nó chứa các vi khuẩn lên men sữa chua (L

bulgaricus và S thermophilus), một vài dòng sản phẩm bổ sung thêm probiotic có hàm

lượng protein cao như trong sữa chua tươi

Trước đây, sữa chua hoàn nguyên có mật độ giống khởi động thấp do bị chết trong giai đoạn sấy ở nhiệt độ cao, hương vị và cấu trúc không bằng sữa chua truyền thống Tuy nhiên, đã có những nỗ lực đáng kể trong những năm gần đây để cải thiện chất lượng của sữa chua sấy khô bằng cách thêm vào những chất phụ gia như sucrose,

Hình 1.7 Các sản phẩm bột sữa chua trên thị trường [100]

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

dextrose; hay những chất ổn định bao gồm xanthan gums, tinh bột, Natri alginate,

…[91]

Nhìn chung bột sữa chua được chia thành hai loại: loại đầu tiên là sữa chua hoàn nguyên được ủ trong một vài giờ để cho phép quá trình đông tụ diễn ra và loại thứ hai với cấu trúc gel được hình thành trong một thời gian rất ngắn (gọi là instant yoghurt) [91]

1.5.2 Sấy phun

Mục tiêu chính của sấy sữa chua là để bảo vệ chúng ở dạng bột ổn định với chất lượng cao trong thời gian sử dụng mà không cần phải trữ ở điều kiện lạnh Bột này có thể được tạo ra bằng cách phương pháp khác nhau như sấy thăng hoa, sấy phun, sấy bằng vi sóng và sấy chân không

Sấy thăng hoa cho đến nay được đánh giá là phương pháp tốt nhất nhằm sấy khô sản phẩm có chứa vi khuẩn với khả năng duy trì tỉ lệ sống cao [55] Tuy nhiên, chi phí sấy thăng hoa đã cản trở quá trình đưa phương pháp này vào trong quy mô sản xuất lớn

Hiện tại, sấy phun được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi thay thế cho sấy thăng hoa vì nó có tốc độ loại bỏ độ ẩm cao, giảm chi phí và thời gian do quá trình sấy diễn

ra trong thời gian ngắn [24]

Sấy phun là phương pháp biến các sản phẩm dạng lỏng hoặc sệt thành dạng bột rất nhanh chóng với luồng khí nóng Là quá trình duy nhất trong đó các hạt hình thành

đồng thời ngay khi chúng được sấy khô [74] Được ứng dụng rộng rãi trong việc sấy

khô nhiều loại vật liệu nhạy cảm với nhiệt như thực phẩm và dược phẩm Với ưu điểm

là tạo ra sản phẩm với kích thước khá đồng nhất [68]

Hiện tại, phương pháp này rất thích hợp cho sử dụng ở quy mô công nghiệp [24] Máy hoạt động bởi dòng nhập liệu (chất lỏng hoặc chất bán rắn) được dẫn vào và được phân tán thành những hạt sương nhỏ li ti thông qua vòi phun Dòng nguyên liệu

đi vào sẽ được sấy bởi dòng không khí nóng và sau đó phân tử nước sẽ bốc hơi Chất

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

rắn được hình thành bởi quá trình thoát hơi nước một cách nhanh chóng Vòi phun ngoài mục đích để tạo những giọt nhỏ li ti, nó còn có chức năng tối đa hóa quá trình truyền nhiệt và tỷ lệ bốc hơi nước [70]

Trong mỗi máy sấy phun luôn có bộ phận bơm nguyên liệu, phân tán nguyên liệu, thổi không khí nóng, phân tán không khí, buồng sấy, thiết bị cho thu hồi sản phẩm, chuyên chở, đóng gói và loại bỏ không khí (Devakate và c.s, 2009) Phần phân tán nguyên liệu (phun sương) là quan trọng nhất trong máy sấy phun Trong bất kỳ loại phun sương, năng lượng là yếu tố cần thiết để phá vỡ số lượng lớn chất lỏng để tạo ra các giọt nhỏ Tùy thuộc vào loại năng lượng được sử dụng để sản xuất các hạt sương, phun sương có thể được phân loại thành bốn loại chính: ly tâm, áp suất, động lực và âm thanh (Barbosa-Canovas và c.s., 2005) [74]

1.5.2.1 Ưu và nhược điểm của sấy phun

a Ưu điểm

Thời gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhân sấy trong thiết bị rất ngắn, do

đó nhiệt độ của mẫu nguyên liệu đem sấy không tăng quá cao Nhờ đó, sự tổn thất các hợp chất dinh dưỡng mẫn cảm với nhiệt độ có trong mẫu là không đáng kể Ngoài ra, sản phẩm sấy phun thu được là những hạt nhỏ có hình dạng và kích thước tương đối đồng nhất, tỷ lệ khối lượng giữa các cấu tử không bay hơi trong sản phẩm tương tự trong mẫu lỏng ban đầu [5]

Một ưu điểm khác nữa là thiết bị sấy phun trong thực tế sản xuất thường có năng suất cao và làm việc theo nguyên tắc liên tục Điều này góp phần làm hiện đại hóa các quy trình sản xuất công nghiệp [5]

b Nhược điểm

Mặc dù có những ưu điểm đáng kể, phương pháp này vẫn tồn tại những nhược điểm: sản phẩm thu được bị giới hạn, không thể sử dụng mẫu nguyên liệu có độ nhớt quá cao hoặc sản phẩm thu được có tỷ trọng cao Bên cạnh đó, mỗi thiết bị sấy phun thường được thiết kế để sản xuất một số sản phẩm với những tính chất và chỉ tiêu đặc

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

thù riêng Ngoài ra, vốn đầu tư thiết bị sấy phun khá lớn khi so sánh với các thiết bị sấy

liên tục khác [5]

1.5.2.2 Các yếu tố gây chết tế bào vi sinh vật bởi sấy phun

Có nhiều nghiên cứu khẳng định khi tăng nhiệt độ đầu vào sẽ ảnh hưởng đến sức sống của vi sinh vật (Mauriello và c.s., 1999) [74] Tuy nhiên theo Kim và c.s., (1990) không có sự tương quan rõ ràng về khả năng bất hoạt vi sinh vật bởi nhiệt độ không khí đầu vào và đây chỉ là yếu tố tác động nhỏ Bởi vì mức độ bất hoạt vi khuẩn trong quá trình sấy phun phụ thuộc vào sự kết hợp giữa thời gian và nhiệt độ sấy [51] Các nhà khoa học khác lại báo cáo rằng nhiệt độ không khí đầu ra tăng làm giảm sức sống của vi sinh vật sau khi sấy phun (Kim và c.s., 1990; Lian và c.s., 2002) Thông số này bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ không khí đầu vào, tốc độ lưu lượng không khí, tốc độ tạo sản phẩm, thành phần của nguyên liệu và kích thước hạt phun (Boza và c.s., 2004; Santivarangkna và c.s, 2008) Tuy nhiên, rất khó để tính toán cho vấn đề tối

ưu hóa các biến này và điều này có thể dẫn đến sự thay đổi lớn trong khả năng tồn tại của vi sinh vật đã sấy khô (Roelans và c.s., 1990) [74]

Janning và c.s., (1994) cho rằng hai yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của vi sinh vật trong quá trình sấy là do nhiệt độ và sự mất nước Nhưng để biết chính xác yếu tố nào gây hại nhiều hơn thì chưa chứng minh được vì 2 yếu tố này diễn ra đồng thời Trong sấy phun, giống khởi động acid lactic được sấy trong dòng không khí nóng, bởi thế sự bất hoạt của tế bào diễn ra ở nhiệt độ cao có thể diễn ra đồng thời với bất hoạt do mất nước [74]

a Bất hoạt do nhiệt

Kể từ khi nhiệt độ cao được nghiên cứu chủ yếu như là một nguyên nhân để gây chết hoặc làm giảm số lượng vi sinh vật trong thực phẩm sấy khô, đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần nào quan trọng bên trong tế bào bị tổn thương để gây nên bất hoạt tế bào [86]

Abee và c.s., (1999); Van de Guchte và c.s., (2002) đã xác định dấu hiệu thiệt

Đào Thị Minh Châu Luận văn Thạc Sĩ Sinh Học

hại của các đại phân tử DNA, RNA và protein hoặc các siêu phân tử như màng và các ribosome từ tác động của nhiệt Nhưng để xác định chính xác thành phần quan trọng nào hoặc trình tự các sự việc diễn ra trong quá trình phá hủy thì rất khó bởi vì nhiệt độ đồng thời ảnh hưởng không chỉ riêng các phân tử mà còn ảnh hưởng đến cấu trúc của

tế bào Khi tế bào chết kéo theo sự biến tính của thành phần tế bào và thành phần tế bào then chốt sẽ biến tính trước tiên Theo Santivarangkna và c.s., (2008), dưới nhiệt

độ 640C (nhiệt độ gây nguy hiểm cho tế bào) cấu trúc màng và bên trong tế bào vẫn còn giữ nguyên vẹn Tuy nhiên từ 650C trở lên, ribosome và protein bị biến tính đồng thời với giai đoạn chết của tế bào [86]

b Bất hoạt do loại nước

Bất hoạt do yếu tố loại nước đối với các giống khởi động acid lactic có thể xảy

ra trong suốt thời gian sấy tại nhiệt độ sinh lý hoặc ở nhiệt độ cực thấp (đông khô) hoặc rất cao (sấy phun)

Tế bào vi khuẩn chứa từ 70-95% là nước và các phân tử nước đóng góp vào sự

ổn định của protein, DNA và lipid cũng như thay đổi trật tự cấu trúc đáp ứng lên tế bào Do đó việc loại nước có ảnh hưởng rất lớn đến sinh lý của tế bào (Potts, 1994) Khi các tế bào bị sấy khô có hàm lượng nước thấp, các thành phần cấu trúc nên tế bào cũng bị biến đổi [85] Màng tế bào chất được coi là thành phần nhạy cảm nhất trong quá trình mất nước, bởi vì nó mất đi một số thành phần nội màng khi màng tế bào bị hư hỏng [81]

Người ta ước tính rằng có khoảng 80% các phản ứng sinh lý của sinh vật phụ thuộc chủ yếu vào sự chuyển động của các liên kết nước (Webb, 1960) Việc loại bỏ các phân tử nước tự do dường như có ít nhiều tác dụng bất lợi đến khả năng tồn tại của

các tế bào (Santivarangkna và c.s., 2007b) Bên cạnh đó, trong suốt quá trình sấy khô,

các tế bào có khuynh hướng tiếp xúc với một thể tích không khí và do đó quá trình oxy hoá lipid có thể xảy ra (Teixeira và c.s., 1996) Kết quả của quá trình oxy hóa lipid có thể dẫn đến việc thay đổi tính chất vật lý trong cấu trúc và động lực học của màng (In