Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do việt nam sản xuất

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) hiện đang là mối quan tâm lớn của ngành y tế các nước châu Á vì mức độ nguy hiểm của nó. Bệnh lưu hành ở châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Philipin, Triều Tiên, Ấn Độ, vùng viễn đông Nga và tất cả các nước Đông Nam Á, với khoảng 50.000 trường hợp mỗi năm, trong đó 10.000 ca tử vong, 15.000 ca mang di chứng thần kinh suốt đời [52]. Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã lan đến các vùng khác ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] . Ở Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành từ đồng bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất. Hiện nay khi việc tiêu diệt vectơ truyền bệnh là muỗi Culex hoặc tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut còn rất khó khăn thì gây miễn dịch cho người là biện pháp duy nhất để ngăn ngừa bệnh VNNB.Tuy nhiên với sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1 được phát hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam... báo động cho chúng ta cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin VNNB có diện đáp ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu hành ở nhiều vùng khác nhau. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy chủng Beijing-1 được coi là chủng đại diện nhất, có thể bảo vệ chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa phương và khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama. Sau khi chuyển giao công nghệ của Nhật Bản, Việt Nam đã sản xuất thành công văcxin VNNB từ chủng Nakayama. Hiện nay, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin VNNB ở cả 2 chủng Nakayama và Beijing-1 để đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết sức quan trọng, có tính chất khẳng định chất lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI WX ĐỖ THỊ DIỆP LAN NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT Chuyên ngành: Vi sinh Vật Mã số: 60.72. 68 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. HUỲNH PHƯƠNG LIÊN Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI WX ĐỖ THỊ DIỆP LAN NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Hà Nội – 2010 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc của mình, em xin dành trang đầu tiên của luận văn để bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, Phòng đào tạo sau Đại học, cùng toàn thể quý thầy cô trong Bộ môn Vi sinh đã giảng dạy tận tình và giúp đỡ em trong quá trình học tập ở trường. PGS.TS. Lê Văn Phủng- Viện trưởng Viện kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh phẩm Y tế, đồng thời là Trưởng Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội người thầy luôn quan tâm, động viên em trong quá trình học tập tại trường và làm việc tại Viện. GS. TS. Huỳnh Phương Liên- Công ty văcxin và sinh phẩm số 1, người thầy đã luôn quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm luận văn. Phòng kiểm định chất lượng, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1. Khoa Kiểm định Văcxin virut, Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh Phẩm Y Tế, đã tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc. Xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình , tất cả bạn bè, anh chị em đã quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em trong suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng 8 năm 2010 Người viết luận văn Đỗ Thị Diệp Lan MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………….….…3 1.1. Virut VNNB…………………………………………………………………3 1.1.1. Thành phần hoá học của virut……………………………………… 3 1.1.2. Tính chất hoá lý……………………………………………… …… 4 1.1.3. Cấu trúc hạt virut……………………………………………… ….…4 1.1.4. Hình thái học ………………………………………………… …… 4 1.1.5. Sự nhân lên của virut………………………………………………… 5 1.2. Dịch tễ học………………………………………………………………… 6 1.3. Đặc điểm lâm sàng………………………………………………… … 10 1.4. Chẩn đoán…………………………………………………………… …. 11 1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng……………………………………………… 11 1.4.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm………………………………… … 11 1.5. Bệnh lý học và sinh bệnh học………………………………………… …15 1.6. Văcxin VNNB…………………………………………………………… 16 1.6.1. Những khía cạnh chung của phương pháp tiêm phòng bằng văcxin 16 1.6.2. Kháng nguyên bảo vệ và văcxin……………… ……………………18 1.6.3. Ý nghĩa và lịch sử phát triển của văcxin VNNB…………………… 19 1.6.4. Hiệu lực của văcxin……………………………………………… …21 1.6.5. Thời gian miễn dịch………………………………………………….22 1.7. Các loại văcxin sử dụng trên thế giới………………………………… 23 1.8. Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột …………………………….23 1.8.1. Định nghĩa……………………………………………………….… 23 1.8.2. Chủng virut………………………………………………………… 23 1.8.3. Chuột dùng cho sản xuất văcxin……………………………… … 23 1.8.4. Sản xuất văcxin……………………………… …………………… 23 1.8.5. Kiểm định văcxin…………………………………………… …… 23 Chương II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu………………………………26 2.2. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… … 26 2.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu………………………………… 29 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….…29 2.3.2. Kiểm tra tính an toàn của văcxin VNNB……………………… … 29 2.3.2.1. Kiểm tra an toàn chung ……………………………………… … 29 2.3.2.2. Kiểm tra chất gây sốt………………………………………… … 32 2.3.2.3. Kiểm tra an toàn đặc hiệu……………………………………… 34 2.3.2.4. Kiểm tra vô trùng………………………………………………… 36 2.3.2.5. Kiểm tra các thành phần hoá học………………………………… 37 2.3.3. Kiểm tra tính công hiệu của văcxin VNNB……………………… 42 2.3.4. Phương pháp xử lý sô liệu……………………………………….… 47 2.3.5. Đạo đức trong nghiên cứu…………………………………….…… 47 Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………… …………………48 3.1. Kết quả kiểm tra thành phần hoá học của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng Beijing-1………………………………………………………………………… 48 3.2. Kết quả kiểm tra tính công hiệu của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng Beijing1 57 Chương IV. BÀN LUẬN………………………………………….…………… 58 4.1.Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất 58 4.1.1. Hàm lượng TCA-Protein 58 4.1.2. Hàm lượng Thimerosal 59 4.1.3. Hàm lượng Formaldehyd 61 4.1.4. Độ pH 62 4.1.6. Thử nghiệm an toàn chung 62 4.1.7. Thử nghiệm an toàn đặc hiệu 63 4.1.8. Thử nghiệm yếu tố gây sốt 64 4.2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất 65 Chương V: KẾT LUẬN 66 1. Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất. 2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất. KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN BA Albumin bò ( Bovin albumin) BHK-21 Tế bào thận chuột đất vàng (Baby hamster kidney) CF Kết hợp bổ thể (Complement Fixation) CPE Cytopathic effect CTTCMR Chương trình tiêm chủng mở rộng CV Virut thử thách (Challenge virus) DTaP Bạch hầu, Uốn ván, Ho gà vô bào ( Diphteria, Tetanus, acellular Pertussis) ELISA Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết gắn enzym (Enzyme Link Immuno-sorbent Assay) FBS Huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovin Serum) FTM Fluid Thioglycollate Medium GMP Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice) GSK Glaxo Smith Kline HA Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemaglutination Assay) HI Ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemaglutination Inhibition) IF Miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorscent) IP Tiêm phúc mạc (intra peritorial)) JE Viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) LAL L L i i m m u u l l u u s s A A m m e e b b o o c c y y t t e e s s L L y y s s a a t t e e LE Môi trường Lactalbumin trong đệm Earle LH Môi trường Lactalbumin hydrolysat NICVB Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh phẩm Y tế (National Institute for control of Vaccines and Biologicals) OD Mật độ quang học (Optic density) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PFU Tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit) PRNT Trung hoà giảm đám hoại tử (Plaque Reduction Neutralization Test) TSB Tryptic Soy Broth TCA Axit tricloraxetic ƯCNKHC Ức chế ngưng kết hồng cầu VABIOTECH Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 VVSDTTƯ Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương VNNB Viêm não Nhật Bản WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) hiện đang là mối quan tâm lớn của ngành y tế các nước châu Á vì mức độ nguy hiểm của nó. Bệnh lưu hành ở châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Philipin, Triều Tiên, Ấn Độ, vùng viễn đông Nga và tất cả các nước Đông Nam Á, với khoảng 50.000 trường hợp mỗi năm, trong đó 10.000 ca tử vong, 15.000 ca mang di chứng thần kinh suốt đời [52]. Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã lan đến các vùng khác ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] . Ở Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành từ đồng bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất. Hiện nay khi việc tiêu diệt vectơ truyền bệnh là muỗi Culex hoặc tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut còn rất khó khăn thì gây miễn dịch cho người là biện pháp duy nhất để ngăn ngừa bệnh VNNB.Tuy nhiên với sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1 được phát hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam báo động cho chúng ta cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin VNNB có diện đáp ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu hành ở nhiều vùng khác nhau. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy chủng Beijing-1 được coi là chủng đại diện nhất, có thể bảo vệ chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa phương và khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama. Sau khi chuyển giao công nghệ của Nhật Bản, Việt Nam đã sản xuất thành công văcxin VNNB từ chủng Nakayama. Hiện nay, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin VNNB ở cả 2 chủng Nakayama và Beijing-1 để đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết sức quan trọng, có tính chất khẳng định chất lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất” 1 Trong phạm vi của đề tài này nhằm 2 mục tiêu: 1. Đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột chủng Beijing-1 trong ph òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất. 2. Đánh giá tính công hiệu của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột chủng Beijing-1 trong ph òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất. 2 [...]... LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 sản xuất tại công ty văcxin và sinh phẩm số 1 - Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A 2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu * Địa điểm nghiên cứu: Phòng kiểm định văcxin, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) * Thời gian nghiên cứu. .. không có dấu hiệu bệnh lý 1.8.4 Sản xuất văcxin: Não chuột được tiêm chủng virut sản xuất Sau đó tiến hành gặt não khi chuột có dấu hiệu liệt Não chuột được nghiền đồng nhất trong môi trường thích hợp và được tinh chế, bất hoạt bằng phương pháp hóa lý thích hợp 1.8.5 Kiểm định văcxin: Phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến bán thành phẩm và thành phẩm... nước và mang lại hiệu quả rất lớn Đến nay qua nhiều năm nghiên cứu và theo dõi người ta thấy rằng văcxin VNNB sản xuất trên não chuột có độ tinh khiết cao rất an toàn, ngay cả khi tiêm nhắc lại [20] Năm 1990, sau khi chuyển giao công nghệ sản xuất văcxin VNNB trên não chuột của Viện BiKen, Việt Nam cũng đã thành công trong việc sản xuất văcxin VNNB Năm 1992, Bộ Y tế cho phép thử nghiệm lâm sàng văcxin. .. tất cả các chủng nói trên đều thuộc genotyp 3 1.7.2 .Văcxin sống giảm độc lực: sản xuất trên tế bào PHK chủng SA-14-14-2 1.7.3 Văcxin thế hệ 3: sử dụng công nghệ tái tổ hợp AND từ protein kháng nguyên E hiện đang được nghiên cứu, chưa có công bố về thử nghiệm lâm sàng 1.8 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột [64] 1.8.1 Định nghĩa: là sản phẩm dạng lỏng hoặc đông khô được tinh chế từ não chuột đã... gian dài Người ta đã thấy văcxin có hiệu quả bảo vệ đáng kể cho ngựa trong một vụ dịch ở Nhật Bản năm 1948 - 1949 Trên cơ sở những thành công thực địa, văcxin VNNB sản xuất trên não chuột đã được chính phủ Nhật Bản 19 cho phép sản xuất từ năm 1954 Văcxin này chứa tất cả các thành phần của não, hàm lượng protein trong văcxin cao nên dễ gây phản ứng phụ nghiêm trọng và nhiều nhà nghiên cứu ở Nhật Bản. .. miễn dịch cơ bản và nhắc lại ở người khi tiêm văcxin VNNB [46] 22 1.7 Các loại văcxin VNNB sử dụng trên thế giới [45] [60] 1.7.1 Văcxin bất hoạt: có 3 dạng hiện nay được sử dụng trên thế giới: - Văcxin tinh chế từ não chuột chủng Nakayama-NIH hoặc Beijing 1 (P-1) - Văcxin tinh chế từ tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK), chủng Beijing 3 (P-3) -Văcxin tinh chế từ tế bào Vero sử dụng chủng Beijing... virut và được bất hoạt bằng phương pháp thích hợp 1.8.2 .Chủng virut: Việc sản xuất văcxin VNNB phải sử dụng hệ thống chủng virut Cơ quan kiểm định Quốc gia nên xác định số lần cấy chuyển từ chủng virut gốc giống Chủng virut giống nên giữ ở dạng đông khô hoặc đông băng ( từ -20oC đến -60oC) 1.8.3 .Chuột cho sản xuất văcxin: Chuột được sử dụng cho virut VNNB nhân lên trên não phải dưới 5 tuần tuổi và không... kiện sống từng nơi Virut VNNB được phân lập đầu tiên vào năm 1935 ở Nhật Bản và đã được tìm thấy ở hầu hết các nước Đông Nam Á Genotyp I phân lập bao gồm các nước miền bắc Thái Lan, Campuchia và Hàn Quốc Việt Nam chỉ phân lập được 1 chủng Genotyp I từ người vào năm 1990 còn hầu hết Genotyp I được phát hiện ở muỗi và lợn Genotyp II được phân lập ở các nước miền nam Thái 6 Lan, Malaysia, Indonesia và phía... ngày Yêu cầu chuột phải tăng cân, không có dấu hiệu bệnh lý [1, 64] - Công hiệu: Mục đích của kiểm tra công hiệu là xác định khả năng gây miễn dịch của văcxin Hiệu lực của văcxin được đảm bảo bởi các thử nghiệm được thực hiện trong từng giai đoạn của quá trình sản xuất và trên sản phẩm cuối cùng Đối với văcxin VNNB bất hoạt công hiệu được xác định bằng phương pháp trung hoà giảm đám hoại tử trên tế... những cố gắng lớn để nâng cao hiệu lực của văcxin và loại các dị ứng nguyên khỏi văcxin [35] Năm 1968, Takaku và cộng tác thông báo một phương pháp hoá lý để tinh chế văcxin VNNB bằng ứng dụng siêu ly tâm [55] Phương pháp này được coi là tiên tiến nhất để tinh chế văcxin VNNB ở quy mô lớn Văcxin này dùng cho người rất an toàn Ở Nhật Bản, văcxin do Viện BiKen sản xuất và được tinh chế theo phương pháp . của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: " ;Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1. Y HÀ NỘI WX ĐỖ THỊ DIỆP LAN NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC. VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI WX ĐỖ THỊ DIỆP LAN NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN