1.8.1. Định nghĩa: là sản phẩm dạng lỏng hoặc đông khô được tinh chế từ não chuột đã được gây nhiễm virut và được bất hoạt bằng phương pháp thích hợp.
1.8.2.Chủng virut: Việc sản xuất văcxin VNNB phải sử dụng hệ thống chủng virut. Cơ quan kiểm định Quốc gia nên xác định số lần cấy chuyển từ chủng virut gốc giống. Chủng virut giống nên giữở dạng đông khô hoặc đông băng ( từ -20oC đến -60oC).
1.8.3.Chuột cho sản xuất văcxin: Chuột được sử dụng cho virut VNNB nhân lên trên não phải dưới 5 tuần tuổi và không có dấu hiệu bệnh lý.
1.8.4. Sản xuất văcxin: Não chuột được tiêm chủng virut sản xuất. Sau đó tiến hành gặt não khi chuột có dấu hiệu liệt. Não chuột được nghiền đồng nhất trong môi trường thích hợp và được tinh chế, bất hoạt bằng phương pháp hóa lý thích hợp.
1.8.5. Kiểm định văcxin: Phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến bán thành phẩm và thành phẩm cuối cùng).Việc đảm bảo chất lượng văcxin là một công việc phức tạp bắt đầu từ
công việc kiểm định nguồn nguyên liệu đầu, giám sát quy trình sản xuất và tuân theo thực hành sản xuất đúng đắn (GMP) một cách nghiêm khắc để xuất xưởng văcxin có chất lượng tốt. Việc kiểm tra đánh giá chất lượng văcxin đòi hỏi tính khách quan và chính xác với đội ngũ cán bộ trung thực, có tay nghề và trình độ chuyên môn. Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình, các phương pháp, kỹ thuật của tổ chức Y tế thế giới và kiểm định Quốc gia quy định, nhằm đảm bảo độ chính xác cao [58].
Chất lượng của văcxin thành phẩm được đánh giá ở các khâu sau: đánh giá ở phòng thí nghiệm, đánh giá lâm sàng và đánh giá thực địa. Đánh giá phòng thí nghiệm là rất quan trọng, bao gồm các thử nghiệm về các mặt hoá học (nhận dạng, tính chất hoá - lý), và sinh vật học (vô khuẩn, an toàn, công hiệu và chất gây sốt). Các thử nghiệm này được thực hiện theo thường quy thống nhất toàn cầu hoặc trong một nước [63].
• Kiểm tra sinh vật học
- Vô khuẩn: Kiểm tra vô khuẩn là để xác định sự vô khuẩn của văcxin. Văcxin phải không có tạp khuẩn hoặc nấm phát triển trên môi trường kiểm tra trong suốt thời gian theo dõi [64].
- An toàn trên chuột: văcxin phải được tiêm trên chuột nhắt và chuột lang sau đó theo dõi chúng sau 7 ngày hoặc 14 ngày. Yêu cầu chuột phải tăng cân, không có dấu hiệu bệnh lý [1, 64].
- Công hiệu: Mục đích của kiểm tra công hiệu là xác định khả năng gây miễn dịch của văcxin. Hiệu lực của văcxin được đảm bảo bởi các thử nghiệm được thực hiện trong từng giai đoạn của quá trình sản xuất và trên sản phẩm cuối cùng. Đối với văcxin VNNB bất hoạt công hiệu được xác định bằng phương pháp trung hoà giảm đám hoại tử trên tế bào BHK-21[1, 64].
- Chất gây sốt: Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện để phát hiện các thành phần gây sốt có trong sản phẩm. Chất gây sốt của văcxin được xác định gián tiếp qua thí nghiệm đo thân nhiệt của thỏ thí nghiệm trước và sau khi tiêm văcxin [1].
• Kiểm tra lý - hoá học
Đối với văcxin VNNB bất hoạt cần kiểm tra những mặt sau đây: - Trạng thái bên ngoài: màu sắc, độđục, thể tích văcxin, nhãn... - Độ pH của văcxin
Chương II
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 sản xuất tại công ty văcxin và sinh phẩm số 1
- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
* Địa điểm nghiên cứu:
Phòng kiểm định văcxin, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)
* Thời gian nghiên cứu
Từ 9/2009-9/2010.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng giống Swiss 4 tuần tuổi, trọng lượng: 11- 13g - Chuột lang 150 – 300 gr
- Thỏ 1,5 – 2,5 kg
2.2.2. Sinh phẩm, môi trường và hoá chất
2.2.2.1. Sinh phẩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A
- Chủng virut VNNB Beijing-1 NIH, Nhật Bản - Tế bào thận chuột đất vàng (BHK- 21).
- Môi trường TSB ( Mỹ)
- Môi trường FTM (Mỹ) - Môi trường TCA (Mỹ)
- Dung dịch PBS pH = 7,4 chứa 0,02% gelatin (Gibco) - Dung dịch LEBA (Gibco) - Dung dịch tripsin 0,025% (Gibco)
- Môi trường MEM× 2 (Sigma) - Dung dịch NaHCO3 7% (Sigma) - Dung dịch Agarose 2% (Gibco)
- Dung dịch Agar Noble 2% (Gibco) - Dung dịch đỏ trung tính 0,25% (Sigma) - Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma)
- Dung dịch đệm Citrat-photphat pH = 5
có chứa hydrogen peroxid (Sigma) - Na2HPO4.12H2O (Anh) - KH2PO4 (Sigma) - KCl (Sigma) - NaCl (Pháp) - H2SO4 (Nhật Bản) - Tween 20 (Sigma) - Dung dịch NaCl 0,9% (Sigma) - Dung dịch đồng kiềm (Sigma) - Thuốc thử Folin Ciocaltor (Sigma) - Albumin bò tinh khiết (Sigma) - Nước cất 2 lần (Sigma) - Formalin 37% (Difco, Mỹ) - Gelatin (Sigma, Mỹ) - Cồn 70 độ (Halico, Việt Nam)
- Axit tricloracetic (Gibco) - Acetylaceton (Sigma) - Amoni acetat (Sigma) - Axit acetic (Sigma) - Dithizon (Sigma) - Carbon tetraclorit (Sigma) - Kháng sinh: Ampicillin, Kanamycin, Erythromycin,
Funzigon Vicillin (Sigma)
2.2.2.3. Vật tư, trang thiết bị
- Tube thuỷ tinh φ 14 (Việt Nam) - Chai thuỷ tinh 100ml, 250ml, 500ml (Schotte- Đức)
- Ống đong 100ml, 250ml, 500ml (Schotte- Đức) - Pipet nhựa loại 2ml, 10ml & 25ml Kimble- Mỹ)
- Đầu côn 300 µl, 1000 µl (Labosystem - Mỹ) - Pipetman200µl,1000µl (Gilson) - Pipette Aid (Drummond Scient. Co. - Mỹ) - Giấy Parafilm (Laboratory film- Anh ) - Giấy thấm (Việt Nam) - Giá đểống nghiệm (Việt Nam) - Máy trộn – KIKA (Malaysia) - Máy cách thuỷ ổn nhiệt (Nhật Bản) - Tủ lạnh (Mitsubishi - Nhật Bản) - Tủấm CO2 (Jouan- Pháp) - Tủẩm 37°C (Sanofi-Pháp) - Máy đo pH (Metter Toledo/MP220- Thuỵ sĩ) - Cân phân tích (Metter Toledo/MP220- Thuỵ sĩ) - Máy khuấy từ (KIKA/MIDI MR1- Đức ) - Máy ly tâm lạnh (Kubota - Nhật Bản) - Máy đo mật độ quang (OD) (Nhật Bản)
- Hotte Laminaire (lọc thổi không khí vô trùng) (Pháp) - Găng tay, mũ, khẩu trang vô trùng. (Việt Nam) - Máy hút chân không (Nhật Bản) - Thùng nitơ lỏng (giữ giống virut và tế bào) (Pháp) - Lò sấy khô (Mỹ) - Lò hấp ướt (Pháp) - Và các thiết bị khác
2.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
* Thiết kế nghiên cứu: tiến hành theo phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm
* Cỡ mẫu nghiên cứu:
Tiến hành thử nghiệm trên 6 loạt văcxin thành phẩm.
* Biến số và chỉ số nghiên cứu:
Hàm lượng TCA-protein, Hàm lượng Thimerosal, Hàm lượng Formaldehyd Độ pH
Tỷ lệ chuột lang tăng trọng Tỷ lệ chuột nhắt tăng trọng Nhiệt độ tăng của thỏ (độ C) Tỷ lệ mọc của nấm và vi khuẩn Hiệu giá kháng thể trung hoà.
2.3.2. Kiểm tra tính an toàn của vắc xin VNNB
2.3.2.1. Kiểm tra an toàn chung (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009,
SOP: KĐQG-21, 2007, NICVB)
Chọn chuột lang 150 – 300 g khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm (lồng chuồng, nhiệt độ và độ ẩm phòng, thức ăn...) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột lang. Tiêm 5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi trọng lượng hàng ngày trong 7 ngày. Yêu cầu chất lượng sau tiêm chuột khoẻ mạnh, bình thường, tăng trọng.
Hình 2.1: Tiêm chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB
Hình 2.2: Theo dõi trọng lượng chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Thử nghiệm trên chuột nhắt:
Chọn chuột nhắt trắng 5 tuần tuổi, khoẻ mạnh, bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm ( như trên chuột lang) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột nhắt. Liều tiêm 0,5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi ít nhất 7 ngày. Hàng ngày theo dõi trọng lượng và tình trạng sức khoẻ của chuột. Yêu cầu chất lượng sau tiêm 7 ngày chuột khoẻ mạnh, bình thường và tăng trọng.
Hình 2.3: Tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng trong thử nghiệm an toàn chung
Hình 2.4: Theo dõi trọng lượng chuột nhắt trong thử nghiệm
2.3.2.2. Kiểm tra chất gây sốt (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
KĐQG-22, 2007, NICVB)
Thử nghiệm chất gây sốt là phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt của văcxin dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ trước và sau khi tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ dung dịch mẫu thử.
Văcxin thành phẩm được kiểm tra chất gây sốt trên thỏ. Đây là phương pháp nhậy nhất để phát hiện yếu tố gây sốt trong văcxin.
• Lựa chọn động vật thí nghiệm
Thỏ khoẻ mạnh, trưởng thành, đực hoặc cái ( nhưng không mang thai), cân nặng không ít hơn 1,5 kg, được nuôi dưỡng bằng thức ăn không chứa chất kháng sinh và không bị tụt cân trong suốt 1 tuần trước khi thử nghiệm. Trong thời gian 3 ngày trước khi thí nghiệm, không sử dụng thỏ này cho những thí nghiệm tương tự khác.
• Phòng thí nghiệm
Thử nghiệm được tiến hành trong phòng yên tĩnh, tránh mọi tiếng động và ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm và nhiệt độ phòng không chênh lệch 3 độ C so với nơi ở cũ. Thỏ được nuôi riêng trong phòng yên tĩnh có nhiệt độ 20-25 oC, cho thức ăn tổng hợp không có chất kháng sinh. Trước ngày tiêm, để thỏ nhịn ăn qua đêm ( nhưng được uống nước) cho đến khi thí nghiệm kết thúc. Không cho uống nước trong thời gian đang làm thí nghiệm
• Thử nghiệm thăm dò
1 ngày đến 3 ngày trước khi tiến hành tiêm văcxin, cần kiểm tra sơ bộ về tính nhậy cảm cho các thỏ thí nghiệm bằng cách tiêm vào tĩnh mạch 10ml/kg trọng lượng nước muối sinh lý 0,9% không chứa chất gây sốt. Ghi nhiệt độ trước tiêm và tiếp tục trong vòng 3 giờ sau khi tiêm dung dịch nước muối sinh lý. Nếu thỏ nào có nhiệt độ giao động so với nhiệt độ ban đầu > 0,6 oC sẽ bị loại, không dùng đưa vào thử nghiệm chính.
• Thử nghiệm chính
Thỏ thí nghiệm là thỏ đạt các tiêu chuẩn trên, được để trong lồng chuyên dụng ít nhất 60 phút để ổn định. Sau đó tiến hành đo nhiệt độ thỏ 2 lần mỗi lần cách nhau 30 phút. Nhiệt độ ban đầu của thỏ là giá trị trung bình của các lần đo này. Tiêu chuẩn đưa vào thí nghiệm là những thỏ có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo không quá 0,2 oC và nhiệt độ ban đầu nằm trong khoảng 38 oC đến 39,8 oC. Mỗi mẫu thử được tiêm cho một nhóm thỏ 3 con, nhiệt độ chênh lệch trong nhóm không quá 1 oC. Sử dụng nhiệt kế có vạch chia đến 0,1oC. Bơm kim tiêm vô trùng loại dùng 1 lần. Cố định thỏ bằng dụng cụ đặc biệt ở tư thế thoải mái. Đưa nhiệt kế vào hậu môn 6-9 mm. Mẫu thí nghiệm để ở 37oC trước khi tiêm. Đường tiêm là tĩnh mạch tai. Liều tiêm 1 ml/kg trọng lượng. Theo dõi đo và đọc nhiệt độ ít nhất 3 lần với khoảng cách giữa 2 lần đo nhiệt độ không quá 60 phút. Nhiệt độ cao nhất của thỏ được ghi nhận trong 3 giờ sau khi tiêm được coi là nhiệt độ “tối đa”. Hiệu số giữa nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ tối đa được coi là nhiệt độ phản ứng. Nếu hiệu số này là âm tính thì phản ứng được đọc là 0oC. Thử nghiệm tiến hành lần đầu trên 3 thỏ và kết quả nhận định theo bảng dưới đây. Nếu tổng nhiệt độ tăng nằm giữa cột 3 và 4 thì thử nghiệm phải tiến hành lại trên số thỏ gấp đôi. Tổng nhiệt độ tăng của 6 thỏ được nhận định theo bảng 2.1. Thử nghiệm không lặp lại quá 3 lần.
Bảng2.1 : Tiêu chuẩn kiểm tra chất gây sốt (TCYTTG)
Thử nghiệm
Tổng số thỏ tích luỹ
Tổng nhiệt độ theo tiêu chuẩn (TCYTTG) Thử nghiệm không đạt với tổng nhiệt độ là 1 3 1,4oC 2,4oC 2 6 3,0oC 4,1oC 3 9 4,9oC 5,9oC
Hình 2.5: Tiêm tĩnh mạch tai thỏ trong kiểm tra chất gây sốt ở NICVB
2.3.2.3. Kiểm tra an toàn đặc hiệu (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009,
SOP: VR03-13, 2007, NICVB)
Chọn chuột nhắt trắng 11-13 g khoẻ mạnh, thể trạng phát triển tốt. Tiêm mẫu thử 0,03 ml/con, mỗi mẫu thử nghiệm sử dụng 10 chuột. Vị trí tiêm não chuột giữa điểm tai và mắt. Theo dõi sức khoẻ trọng lượng chuột trong 14 ngày. Ngày thứ 14 đọc kết quả với thể trạng chuột khoẻ mạnh và tăng trọng bình thường, không hề có các triệu chứng bệnh lý là đạt yêu cầu.
Hình 2.6: Tiêm não chuột trong kiểm tra an toàn đặc hiệu ở NICVB
2.3.2.4. Kiểm tra vô trùng (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL05-01, 2007, NICVB) HL05-01, 2007, NICVB) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX-SP là FTM và TSB. Thể tích mỗi ống môi trường 20ml/ống. Tỷ lệ số ống môi trường FTM và TBS là 3:1. Trong thời gian chưa sử dụng, hai môi trường này được bảo quản ở nhiệt độ 20-25 độ C.
• Tiến hành:
- Đi găng tay vô trùng.
- Mẫu văcxin sau khi lau cồn được đặt vào khay vô trùng và chuyển vào tủ cấy vô trùng.
- Chuyển dụng cụ, môi trường vào tủ cấy vô trùng.
- Thay găng tay vô trùng
- Dùng kẹp để mở nắp các lọ văcxin, dùng pipet Pasteur hút văcxin từ các lọ cấy vào các ống môi trường. Mỗi lọ dùng riêng biệt một pipet Pasteur. - Lượng văcxin cần lấy từ mỗi lọ để cấy vào mỗi loại môi trường và thể
tích cấy vào mỗi ống môi trường được thực hiện theo bảng dưới đây: Thể tích có trong mỗi lọ Số lượng tối thiểu dùng
cho mỗi loại môi trường
Số lượng cấy vào mỗi ống môi trường < 1ml Toàn bộ VX có trong mỗi lọ Toàn bộ VX có trong mỗi lọ Từ 1ml đến 20 ml 1ml 1ml > 20 ml và < 100ml 5ml 1ml - Cách cấy:
+ Đối với FTM: đưa sâu pi-pét tới gần đáy ống môi trường, vừa bơm văcxin vừa di chuyển pi-pét lên bề mặt môi trường.
- Ủ môi trường và theo dõi
Các ống môi trường được ủ ở nhiệt độ thích hợp ít nhất 14 ngày: + FTM: ủ ở nhiệt độ 30-35oC
+ TSB: ủ ở nhiệt độ 20-25oC
- Theo dõi các ống môi trường ở 3 thời điểm để phát hiện xem có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường hay không:
Lần 1: vào ngày thứ 3 Lần 2: vào ngày thứ 7
Lần 3: vào ngày cuối cùng.
- Đánh giá kết quả: Theo tiêu chuẩn của WHO (WHO-TRS 530, phụ lục 4) Văcxin đạt yêu cầu về vô trùng nếu không có dấu hiệu phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường cấy văcxin sau ít nhất 14 ngày theo dõi.
2.3.2.5. Kiểm tra các thành phần hoá học
a) Đo độ pH (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL01-09, 2005,
NICVB).
Sử dụng máy đo pH Metter Toledo (Thuỵ Sĩ) với các dung dịch chuẩn pH 4,0 và pH 7,0. Cần chú ý rửa đầu từ và bảo quản đầu từ đo pH cho sạch bằng cách sau khi đo pH phải rửa bằng nước cất 2 lần trong nhiều lần. pH của văcxin phải nằm trong khoảng 6,8 – 7,4.
b) Định lượng TCA-protein trong vắc xin.(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5,
2009, SOP: HL01-10, 2005, NICVB) .
* Nguyên lý
Protein trong văcxin được tủa bằng axit tricloraxetic (TCA) rồi định lượng theo phương pháp Lowry. Các dung dịch protein chuẩn là albumin bò có nồng độ 50,100 và 150 µg/ml.
- Dung dịch A: Pha ngay trước khi dùng
Hoà tan 0,4 g natri hydroxyt trong nước cất, thêm 4g natricarbonat, lắc cho tan đều. Thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
- Dung dịch B: Pha ngay trước khi dùng
Trộn đều dung dịch đồng sulfate 2% với 1ml natri tritrate 4%. - Dung dịch C: (thêm 1 ml dung dịch B vào 50 ml dung dịch A) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dung dịch axit tricloraxetic 10%: cân 100 g axit tricloraxetic rồi thêm nước cất vừa đủ 1000 ml.
*Tiến hành:
- Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) vào các protein chuẩn và các mẫu chuẩn