Để đánh giá yếu tố gây sốt trong văcxin, WHO khuyến cáo sử dụng phương pháp thử nghiệm trực tiếp trên thỏ. Sáu loạt văcxin được thử nghiệm yếu tố gây sốt theo SOP: KĐQG-22, 2007, NICVB [13]. Thỏ là động vật rất nhạy cảm với các yếu tố gây sốt, do vậy khi tiêm một lượng kháng nguyên 1ml/kg trọng lượng thỏ qua đường tĩnh mạch tai thỏ, lập tức được truyền đi khắp cơ thể. Tất cả thỏ được chọn đều khoẻ mạnh cân nặng lớn hơn 1,5 kg được nuôi dưỡng bằng thức ăn không chứa chất kháng sinh và không bị tụt cân trong suốt một tuần trước thí nghiệm. Thỏ được nuôi riêng trong phòng yên tĩnh nhiệt độ 20-25oC, trước ngày tiêm để thỏ nhịn ăn qua đêm (chỉ cho uống nước). Như vậy đảm bảo chất lượng thỏ để tiến hành thí nghiệm. Dùng bơm kim tiêm sử dụng 1 lần không có nội độc tố lấy trực tiếp văcxin từ lọ tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ, vì vậy đã loại trừ được các yếu tố gây sốt do dụng cụ thí nghiệm. Nếu trong văcxin có chất gây sốt thì ngay trong giờ đầu tiên phản ứng tăng nhiệt độ cơ thể sẽ xảy ra. Trên hình 3.8, thử nghiệm 6 loạt văcxin sau 3 giờ theo dõi (30 phút đo nhiệt độ một lần). Tổng nhiệt độ 3 thỏ cho mỗi loạt văcxin đều chỉ tăng 0,1-0,3oC so với tiêu chuẩn Việt Nam [1]và WHO [64] là ≤1,4oC. Điều này chứng tỏ văcxin đạt độ tinh khiết cao, không còn các protein tạp gây sốt.
Ngoài ra còn có phương pháp LAL test để phát hiện nội độc tố vvii k khhuuẩẩnn ggrraamm ((--)) trong văcxin [28]. NNộộii đđộộcc ttốố vvii kkhhuuẩẩnn GGrraamm ((--)) pphhâânn hhuuỷỷ t tíínnhh hhooạạtt đđộộnngg ccủủaa ttiiềềnn eennzzyymm ((PPrrooeennzzyymmee)) ccóó ttrroonngg LLiimmuulluuss AAmmeebbooccyytteess L Lyyssaattee ((đđưượợccttrriiếếttxxuuấấttttừừ ccoonn ssaamm)).. MMeennCCooaagguullaassee ccũũnngg ccóó mmặặttttrroonngg LLAALL t tạạoo tthhàànnhh CCooaagguulliinn.. CCooaagguulliinn ccóó ttíínnhh cchhấấtt ttựự lliiêênn kkếếtt vvàà hhììnnhh tthhàànnhh ccụụcc t thhạạcchh.. SSaauu kkhhiiủủ ccóó mmặặttnnộộiiđđộộcc ttốố,, ccụụcc tthhạạcchh ssẽẽ xxuuấấtthhiiệệnn..NNếếuu kkhhôônngg ccóó nnộộii đ độộcc ttốố,, ccụụcc tthhạạcchh ssẽẽ kkhhôônngg xxuuấấtt hhiiệệnn.. TTừừ đđóó xxáácc đđịịnnhh đđưượợcc hhààmm llưượợnngg nnộộii đ độộcc ttốố ttrroonngg vvăăccxxiinn..
Qua đánh giá 6 loạt văcxin VNNB đầu tiên được sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1 đều đạt tính an toàn 100%.
4.2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất.
Định lượng kháng thể bằng phương pháp PRNT trên tế bào là phương pháp chuẩn của WHO về kiểm định công hiệu của văcxin, xác định được hiệu giá kháng thể một cách chính xác và là kỹ thuật có độ tin cậy cao được WHO khuyến cáo sử dụng. Phương pháp này được sử dụng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam.
Sau khi gây miễn dịch văcxin cho chuột nhắt trắng 2 mũi cách nhau một tuần. Đến ngày thứ 14 tiến hành lấy máu chuột, tách huyết thanh. Huyết thanh được bất hoạt ở 56oC/90 phút ở bể ổn nhiệt. Sau đó thực hiện kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử (PRNT) trên tế bào BHK-21. Tế bào BHK-21 được lấy từ bình Nitơ lỏng ra, nuôi cấy chuyển tiếp 3 lần rồi cho đĩa petri. Tế bào đạt tiêu chuẩn để tiến hành thử nghiệm phải không bị bệnh lý tế bào, tế bào mọc kín mượt một lớp trên bề mặt chai nuôi cấy. Hiện nay Trung Quốc và Hàn Quốc cũng sử dụng phương pháp (PRNT) trên tế bào BHK-21, còn Nhật Bản thì sử dụng phương pháp này trên tế bào phôi gà tiên phát để kiểm tra công hiệu văcxin VNNB [42]. Sáu loạt văcxin được thử nghiệm công hiệu theo SOP: VR03-01, 2007, NICVB [17]. Mẫu văcxin chuẩn EJP034A được làm song song với mẫu văcxin thử nghiệm. Giá trị CV nằm trong khoảng từ 90-150 plaque, chứng âm và chứng dương đều thoả mãn tiêu chuẩn, vì vậy các thử nghiệm là hoàn toàn có giá trị. Kết quả cho thấy ở hình 3.9, cả 6 loạt văcxin đều có chỉ số trung hoà lớn hơn mẫu chuẩn từ 0,04-0,2 log, so sánh mẫu thử/ mẫu chuẩn cho thấy: loạt JB011203 là 1,965/1,617; JB021203 = 1,973/1,937; JB030104 = 1,833/1,617; JB040204 = 1,854/1,617; JB050304 = 1,841/1,617 và JB060305 = 2,0/1,777. Điều đó cho thấy văcxin có đáp ứng kháng thể tương đương với văcxin của BIKEN- Nhật Bản. Vậy 6/6 loạt văcxin thử nghiệm đều đạt yêu cầu về công hiệu theo tiêu chuẩn của WHO [64] và Việt Nam [1].
Chương V
KẾT LUẬN
1. Văcxin VNNB bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất đạt tính an toàn cao:
- Thành phần các chất trong văcxin đạt tiêu chuẩn của TCYTTG với protein toàn phần 12,56-14,5 µg/ml (tiêu chuẩn ≤ 40 µg/ml). Hàm lượng Thimerosal 82-85,2 µg/ml (tiêu chuẩn ≤ 120 µg/ml). Hàm lượng Formaldehyd 0,039-0,063 µg/ml (tiêu chuẩn ≤ 100 µg/ml). Độ pH của văcxin ổn định từ 7,02-7,05 ( tiêu chuẩn 6,8-7,4).
- Kết quả thử nghiệm an toàn chung trên chuột lang tăng trọng từ 106%- 117%, chuột nhắt tăng trọng từ 137%-151%. An toàn đặc hiệu với liều 0,03 ml tiêm vào não chuột sau 14 ngày chuột khoẻ mạnh và tăng trọng từ 174%-211%.
- 6/6 loạt văcxin thử nghiệm không có nấm và vi khuẩn phát triển trên môi trường FTM và TSB ở 2 nhiệt độ 20-25oC và 30-35oC.
- Chất gây sốt trong văcxin gần như không có. Theo dõi thỏ sau 3 giờ tiêm tĩnh mạch, tổng nhiệt độ cơ thể của 3 thỏ tăng 0,0oC- 0,3oC (tiêu chuẩn ≤ 1,4oC).
2.Văcxin VNNB bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất đạt tính công hiệu:
6/6 loạt với chỉ số trung hoà ≥ EJP034A văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản (Hiệu giá tương quan giữa mẫu thử/mẫu chuẩn >1).
KIẾN NGHỊ
Đề ngh ị B ộ y t ế xem x ét sớm đưa văcxin VNNB chủng Beijing -1 vào CTTCMR để tiêm phòng cho trẻ em Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc, phần 5, văcxin và sinh phẩm y tế 2009: 75,76.
2. Đo độ pH của các dung dịch, SOP: HL01-09, 2005, NICVB.
3. Huỳnh Phương Liên 2007, Virut viêm não Nhật Bản và văcxin dự phòng, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr 91.
4. Huỳnh Phương Liên, Nguyễn Anh Tuấn, Đỗ Thuỷ Ngân, Nguyễn Kim Giao và CS, 2005. Phân tích thành phần hoá học và quan sát hình thái virut trên kính hiển vi điện tử của văcxin VNNB sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1. Tạp chí YHDP, 6 (514)
5. Huỳnh Phương Liên, Nguyễn Anh Tuấn và cs (2006). Nghiên cứu thay thế chủng Nakayama bằng chủng Beijing -1 trong sản xuất văcxin viêm não Nhật Bản.
Đề tài nghiên cứu cấp nhà nước KC10-22.
6. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Vương Đức Cường, Vũ Sinh Nam, Phạm Thị Minh Hằng, Trần Văn Tiến. Giám sát chẩn đoán viêm não Nhật Bản ở Việt Nam, 2001-2002. Tạp chí y học dự phòng 2003, tập XII, số 4 (55): 5-11.
7. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Huỳnh Phương Liên, Trần Văn Tiến. Sự
thay đổi về giảm tỷ lệ mắc bệnh viêm não Nhật Bản (qua chẩn đoán huyết thanh) ở miền Bắc Việt Nam, 1998. Tạp chí Y học dự phòng 1999, tập IX, số 2 (40):19-22
8. Phan Thị Ngà, Đoàn Thị Hải Yến, Phạm Đỗ Quyên, Nguyễn Thanh Thủy, Huang Claire. Giám sát căn nguyên virut viêm não Nhật Bản, virut West Nile và virut Nam Định gây hội chứng não cấp bằng kỹ thuật MAC-ELISA.
9. Phan Thị Ngà và cs. Ứng dụng kỹ thuật MAC-ELISA để xác định tần suất nhiễm virut VNNB trong quần thể lợn ở Hà Tây, 2001-2002.Tạp chí Y học dự phòng, 2003, tập XIII số 1 (58)
10. Hoàng Thủy Nguyên, Trần Văn Tiến và ctv (1990). Phát hiện sự phân bố của bệnh dengue xuất huyết và viêm não Nhật Bản theo phân vùng địa lý đặc trưng trên cơ sở điều tra các mối liên quan về tần số mắc bệnh, dịch tễ
huyết thanh học với sự biến động của vectơ truyền bệnh này. Chương trình NCKH cấp nhà nước 64B.
11. Lê Hồng Phong, Trần Văn Tiến, Hoàng Thủy Nguyên, Phan Thị Ngà,Vũ Sinh Nam. Bệnh viêm não Nhật Bản ở miền Bắc Việt Nam 1988-1992. Tạp chí Vệ
sinh phòng dịch 1996, tập VI, số 2 (28): 11-15
12. Quy trình chuẩn an toàn chung cho văcxin và sinh phẩm, SOP: KĐQG-21, 2007, NICVB.
13. Quy trình chuẩn chí nhiệt tố cho văcxin và sinh phẩm, SOP: KĐQG-22, 2007, NICVB.
14. Quy trình chuẩn kiểm tra an toàn đặc hiệu văcxin viêm não Nhật Bản, SOP: VR03-13, 2007, NICVB
15. Quy trình chuẩn kiểm tra vô trùng văcxin, sinh phẩm, SOP: HL05-01, 2007, NICVB.
16. Quy trình chuẩn tiêu chuẩn ĐVTN dùng cho kiểm định văcxin và sinh phẩm, SOP: TN 02-08, 2007, NICVB.
17. Quy trình chuẩn thử nghiệm công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản, SOP: VR03- 01, 2007, NICVB
18. Trần Văn Tiến, Hoàng Thuỷ Nguyên, Vũ Sinh Nam, Phan Thị Ngà và ctv (1989). Tình hình bệnh VNNB và kết quả phòng bệnh bằng văcxin trên thực
địa Đông Anh, Hà Nội 1985 – 1989. Chương trình NCKH Viện VSDTTƯ. 19. Tiêu chuẩn Việt Nam I-1, 2009, phụ lục 15, tr 577-661.
20. Đoàn Thị Thủy (1991). Tinh chế virut viêm não Nhật Bản cho sản xuất văcxin bất hoạt tinh khiết, dùng trong dự phòng bệnh viêm não Nhật Bản, Luận án tiến sĩ Y dược học.
21. Đặng Đức Trạch (1972). Miễn dịch học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 17.
22. Xác định hàm lượng Formaldehyd trong vacxin và sinh phẩm, SOP: HL01-08, 2005, NICVB.
23. Xác định hàm lượng Merthiolate trong vacxin và sinh phẩm bằng phương pháp
đo quang, SOP: HL01-01, 2005, NICVB.
24. Xác định hàm lượng Protein toàn phần trong vacxin và sinh phẩm bằng phương pháp Lowry, SOP: HL01-10, 2005, NICVB.
Tiếng Anh
25. Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM 1990. Flaviviruse genome organisation, expression and replication. Annu Rev Microbiol 44: 649-688. 26. Chen, D., Wang, H. Y., Fu, S.H., Song, H., Deng, J., Yang, Y.L.& Liang, G.D.
(2005). Molecular characteristics of three new isolates of Japanese encephalitis virus in Fujian Province. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi 19, 5-8 (in Chinese).
27. Bernard N. Fields et al (1989), Japanese encephalitis, Virology,pp. 779-782. 28. European pharmacopoeia, Fourth edition 2002 Volume II.
29. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. et al.1996. Virology 3th Edition, Flaviviruses, Thomas P. Monath and Franz X Heinz Chapter 31, p.961-1022. 30. Jacobson J. A., Hills S. L., Winkler J.L., Mammaen M., Thaisomboonusuk B., Marfin A.A., Gibbons R. V. Evalution of three immunoglobulin M antibody capture enzyme-linked immunosorbent assays for diagnosis of Japanese encephalitis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2007, 77 (1): 164-168
31. Kuno G. Sero-diagnosis of Flaviviral infection and vaccination in humans. Advances in virus research, 2003. Vol. 61: 3-48
32. Grossman R. A, Edelman R, Gould D. J (1974). ''Study of Japanese encephalitis virus in Chiangmai valley, Thailand'', Am.J. Epidemiol,3, pp. 37-56.
33. Grossman R. A, Edelman R, et al (1973). ''Study of Japanese encephalitis virus in Chiangmai valley, Thailand II. Human clinical infection'', Am.J. Epidemiol,98, pp. 121-132.
34. Hana JN, Ritchie SA, Phillips DA, et al. 1996. An outbreak of Japanese encephalitis in the Torres Strait, Australia 1995. Med. J. Aust. 165: 256- 260.
35. Hoke C. H., Nisalak A., Sangawhipa N., et al (1988). '' Protection against Japanese encephalitis by inactivated vaccines'', N Eng/ J. Med., 319, pp. 608 – 613.
36. Hsu T.C. et al (1971). ''A completed field trial for an evaluation of the efectiveness of mouse-brain Japanese encephalitis vaccine'', Immunization for Japanese encephalitis, Tokyo, Igaku Shoin Ltd, pp. 258 – 265.
37. Igarashi, A., Tanaka, M., Morita, A., Takasu, T., Ahmed, A., Akram, D.S. & Wakar, M.A (1994). Detection of West Nile and Japanese encephalitis viral genome sequences in cerebrospinal fluid from acute encephalitis cases in Karachi, Pakistan, Microbiol Immunol 1994.
38. Kanamitsu M. (1971), ''Relationship between immunizing potencies in man and animals of Japanese encephalitis vaccine'', Immunization for Japanese encephalitis, Igaku Shoin, Tokyo, pp 83-86.
39. Lee H. W., Min B. W., Lim Y. W. (1972). '' Isolation and serologic studies of Japanese encephalitis from snakes in Korea'', J. Korean Med. Assos, 15, pp 69-70.
40. Mackenzie, J.S., Johansen C.A., Ritchie, S.A., Van den Hurk, A.F & Hall, R.A. Japanese encephalitis as an emerging virus: The emergence and spread of Japanese encephalitis virus in Australia. In Current topics in
microbiology and Immunology: Japanese encephalitis and West Nile virus infections 2002, vol.267: 49-73. Edited by J.S. mackenzie, A.D. Barret & V. Deubel. Berlin: Springer-Verlag.
41. Mandl CW, Heinz FX, KunzC.1988. Sequence of the structural protein of tick- born encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses virol 173: 674-682.
42. Minimum requirements for biological products. National Institute of Infectious Diseases, Japan, 2006, pp 89-94.
43. Miura T., Toyokawa K., Allen R. et al (1970). “ Studies of arthropodborne virus is infections in chiroptera. VII. Serologic evidence of natural Japanese B encephalitis virus infections in bads'', Am. J. Trop. Med. Hyg, 19, pp 88-93.
44. Pyke AT, Williams DT, Nisbet DJ, Vanden Hurk AF, Taylor CT, et al. 2001.
The appearance of a second genotype of Japanese encephalitis virus in the Australasian region. Am J Trop Med Hyg 65: 747-754.
45. Recommendation for JE vaccine (invactivated) for human use. Expert Commitee on Biological Standardization, Geneva, 8-12 October 2007
46. Reseacher Associates-NIH (1996),'' Quality assurance of vaccines'', Vaccine handbook, Maruzen-Tokyo, pp 15-21,110.
47. Rosen L., Tesh R. B., Lien J. C. (1978). ''Transovarial transmission of Japanese encephalitis virus by mosquitoe'', Sience, 199, pp. 909- 911.
48. Russell PK, Brandt WE, Dalrymple JM. 1980. Chemical and antigenic structure of flaviviruses. In: Schlesinger RW, eds. The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. NewYork: Academic Press.
49. Shapiro D., Kos K. A., Russell P. K. (1973), '' Japanese encephalitis virus glycoproteins'', Virology, 56, pp 88-94.
50. Shiraki H. (1970),'' Japanese encephalitis'', Clinical virology, Saunders, Philadelphia, pp 156-175.
51. Solomon T, 2003. Recent advances in JE. J Neuro Virol.9: 274-283
52. Solomon T, Dung NM, Kneen R, Gains boroygh M, Vaugfhn DW, Khanh VT 2000. Japanese encephalitis. J Neurol Neurosung Psychiatry 68: 405-415.
53. Shotridge K. F., Oya A., Kobayashi M. et al (1975). ''Arbovirus infectious in reptiles: studies on the presence of Japanese encephalitis virus antibody in the plasma of the turtle, Trionyx sinensis'', Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 6, pp 161-169.
54. Strauss E. G., Strauss J. S. (1983). '' Replication strategies of the single stranded RNA viruses of eukaryotes'', Curr. Top. Microbiol. Immunol, 105, pp 1-98.
55. Takaku K., Yamashita T., Yoshida I., Kato M. et al (1968). '' Japanese encephalitis purified vaccine'', Biken J., 11, pp 25-39.
56. Takegami T.,Hotta S. (1990), “Synthesis and localization of Japanese encephalitis virus RNAs in the infected cells'', Microbiol. Immuol, 34, pp 849-857.
57. Takeshi O. et al (1975). ''Japanese encephalitis surveillance in China (Province of Taiwan) during 1968-1971'', Japan J. Med. Sci. Biol, 28, pp 235-253.
58. WHO (1992), '' Good manufacturing practices for biological products", WHO expert Committee on biological standardization, WHO Technical Report Series, 822.
59. WHO (1990), ''Guidelines for preparation, characterization and establishment of international and other standards and reference reagents for biological substances'', WHO Technical Report Series, 800, pp. 181- 215.
60. WHO-Technical Report Series-No 910-2002- Annex 3. Guidelines for the production and control of Japanese encephalitis vaccine (live) for human use, pp 67-70.
61. WHO Immunological basis for immunization series- Module 13: Japanese encephalitis (2010)
62. WHO (1997), '' Standardization in vaccine potency testing in Manual of laboratory methods for testing of vaccines used in the WHO/ EPI'', WHO Technical Report Series, 296, pp. 12- 22.
63. WHO (1981),'' The national control of vaccines and sera'', WHO Technical Report Series, 658, pp 299-313.
64. WHO-Technical Report Series-No 771-1988- Requirements for Japanese encephalitis vaccine (inactivated) for human use. Annex 6, pp140-146.