Người ta cho rằng có 3 cách phòng bệnh VNNB: tiêu diệt vectơ muỗi, tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut VNNB và tiêm phòng cho người.
Vấn đề phòng bệnh bằng diệt vectơ thực hiện rất khó khăn. Muỗi Culex sống trong các ruộng lúa, ao hồ, trên một diện tích rộng khó diệt.
Ý tưởng tiêm phòng cho lợn có ý nghĩa về mặt lý thuyết để cắt nguồn truyền bệnh nhưng không thể thực hiện được trên thực tế. Một trong những khó khăn đó là tìm được thời gian thích hợp để tiêm phòng: sau 4 tháng tuổi lợn mới hết kháng thể mẹ truyền mà 7 -8 tháng đã bị mổ thịt, do đó khoảng cách còn lại để tiêm văcxin rất ngắn. Vì vậy văcxin phòng bệnh cho người là cần thiết và là biện pháp tích cực nhất để ngăn ngừa bệnh VNNB trong giai đoạn hiện nay.
Việc nghiên cứu văcxin VNNB đã được bắt đầu từ chiến tranh thế giới thứ II. Trước tiên văcxin được thử nghiệm thực địa trên ngựa vì ngựa cũng bị mắc bệnh nghiêm trọng như người. Bệnh VNNB cũng lưu hành ở ngựa trong một thời gian dài. Người ta đã thấy văcxin có hiệu quả bảo vệ đáng kể cho ngựa trong một vụ dịch ở Nhật Bản năm 1948 - 1949. Trên cơ sở những thành công thực địa, văcxin VNNB sản xuất trên não chuột đã được chính phủ Nhật Bản
cho phép sản xuất từ năm 1954. Văcxin này chứa tất cả các thành phần của não, hàm lượng protein trong văcxin cao nên dễ gây phản ứng phụ nghiêm trọng và nhiều nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã dành những cố gắng lớn để nâng cao hiệu lực của văcxin và loại các dị ứng nguyên khỏi văcxin [35].
Năm 1968, Takaku và cộng tác thông báo một phương pháp hoá lý để tinh chế văcxin VNNB bằng ứng dụng siêu ly tâm [55]. Phương pháp này được coi là tiên tiến nhất để tinh chế văcxin VNNB ở quy mô lớn. Văcxin này dùng cho người rất an toàn. Ở Nhật Bản, văcxin do Viện BiKen sản xuất và được tinh chế theo phương pháp này đã được dùng trong nhiều năm ở nhiều nước và mang lại hiệu quả rất lớn. Đến nay qua nhiều năm nghiên cứu và theo dõi người ta thấy rằng văcxin VNNB sản xuất trên não chuột có độ tinh khiết cao rất an toàn, ngay cả khi tiêm nhắc lại [20].
Năm 1990, sau khi chuyển giao công nghệ sản xuất văcxin VNNB trên não chuột của Viện BiKen, Việt Nam cũng đã thành công trong việc sản xuất văcxin VNNB. Năm 1992, Bộ Y tế cho phép thử nghiệm lâm sàng văcxin của Việt Nam trên người tình nguyện song song với nhóm tiêm văcxin Biken, kết quả cho thấy số trẻ em được tiêm cả hai loại văcxin này đều có đáp ứng kháng thể 100%, trong đó có cả số trẻ trước khi tiêm văcxin đã có kháng thể kháng virut VNNB (+) và số kháng thể (-). Số trẻ em có kháng thể kháng VNNB (-) thì phản ứng sinh miễn dịch mạnh hơn và động lực kháng thể tăng rất cao [3]. Trên cơ sở đã tự sản xuất được văcxin VNNB với chất lượng ngang bằng tiêu chuẩn Nhật Bản, Bộ Y tế đã quyết định đưa văcxin VNNB vào CTTCMR từ năm 1997. Cho đến nay, ở miền Bắc số trẻ em 1-5 tuổi đã được tiêm chủng miễn phí 200/300 huyện của 29 tỉnh phía Bắc. Nhờ đó mà khi xác định căn nguyên VNNB bằng phát hiện IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong số mắc hội chứng não cấp do virut đã giảm hơn 50%, góp phần bảo vệ sức khoẻ cho nhân dân, đặc biệt là trẻ em và giúp cho ngành Y học dự phòng của nước nhà ngày càng vững mạnh.
1.6.4. Hiệu lực của văcxin
Năm 1965, văcxin VNNB đã dược thử nghiệm trên thực địa ở Đài Loan với quy mô lớn gồm 400.000 người, trong đó có 134.000 trẻ em từ 3 đến 7 tuổi [36]. Theo dõi chặt chẽ các trường hợp được tiêm văcxin và nhóm đối chứng người ta thấy tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm được gây miễn dịch bằng 2 liều cơ bản gần bằng 20% so với nhóm đối chứng. Hiệu lực của văcxin được tính là gần 81%. Vậy đây là một bằng chứng có giá trị để thừa nhận hiệu lực của văcxin VNNB dùng cho người. Từ đó hiệu lực của văcxin thử nghiệm trên thực địa là 81% này được quy định là tiêu chuẩn tối thiểu trong Kiểm định Quốc gia đối với văcxin VNNB. Phương pháp đánh giá công hiệu của văcxin thử nghiệm trên thực địa rồi so sánh tỷ lệ mắc bệnh giữa các nhóm được tiêm văcxin và nhóm đối chứng cũng được thử nghiệm ở các vùng lưu hành dịch ở Nhật Bản và một số nước khác. Ở Việt Nam, văcxin VNNB của Viện BiKen - Nhật Bản đã được thử nghiệm công hiệu trên thực địa ở huyện Đông Anh, ngoại thành Hà Nội là nơi lưu hành bệnh VNNB. Kết quả thử nghiệm trên 27.700 trẻ em từ 3 tháng đến 5 tuổi cho thấy văcxin có hiệu quả bảo vệ rõ rệt (85,7%). Số trường hợp bị mắc bệnh VNNB xẩy ra hầu hết ở nhóm không được tiêm văcxin [18].
Ngày nay, hiệu lực văcxin còn được đánh giá bằng phương pháp tìm đáp ứng kháng thể ở những người được tiêm văcxin. Phương pháp này giản tiện hơn việc giám sát tỷ lệ mắc bệnh nhưng nếu tiến hành ở vùng có lưu hành dịch việc đánh giá kết quả sẽ khó khăn vì nhiễm virut VNNB tự nhiên có thể làm thay đổi đáp ứng kháng thể . Kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử trên tế bào phôi gà, tế bào BHK 21 một lớp là phương pháp thích hợp nhất để tìm đáp ứng kháng thể. Bằng thực nghiệm người ta đã chứng minh được rằng chuột nhắt trắng giống Swiss được gây miễn dịch có hiệu giá kháng thể trung hoà lớn hơn 1: 10 đã không bị mắc bệnh sau khi được thử thách với liều virut VNNB bằng 104 MLD. Từ khi Takahashi thông báo rằng hiệu giá tối đa của virut VNNB được truyền cho người hoặc động vật do một lần muỗi đốt là khoảng 104 MLD thì người ta
cho rằng người được tiêm văcxin có khả năng bảo vệ nếu có kháng thể trung hoà trong máu lớn hơn 1: 10 [20].
Trẻ em được tiêm 1 liều văcxin thì có khoảng 50% có hiệu giá kháng thể trung hoà lớn hơn 1: 10, còn nếu được tiêm 2 liều cách nhau 1 tháng thì có khoảng 80% có hiệu giá kháng thể trung hoà lớn hơn 1: 10. Công hiệu này cũng được quy định là tiêu chuẩn tối thiểu đối với văcxin VNNB hiện nay.
1.6.5. Thời gian miễn dịch
Nói chung hiệu quả miễn dịch khi tiêm văcxin VNNB bằng 2 liều cơ bản không được quá 1 năm. Vì vậy sau 1 năm phải tiêm nhắc lại. Kanamitsu và cộng tác đã chứng minh rằng hiệu giá trung bình của kháng thể trung hoà duy trì ở mức lớn hơn 1: 10 được tới 3 năm sau khi tiêm nhắc lại lần đầu [38]. Trên cơ sở đó người ta cho rằng để việc tiêm phòng có hiệu quả cần tuân theo chỉ dẫn như sau: tiêm 2 liều cơ bản cách nhau 1 đến 2 tuần, sau 1 năm tiêm nhắc lại, rồi sau đó cứ 3 đến 4 năm lại tiêm nhắc lại 1 lần.
Hình 1.7: Nồng độ kháng thể trung hoà sau miễn dịch cơ bản và nhắc lại ở
1.7. Các loại văcxin VNNB sử dụng trên thế giới [45] [60].
1.7.1. Văcxin bất hoạt: có 3 dạng hiện nay được sử dụng trên thế giới:
- Văcxin tinh chế từ não chuột chủng Nakayama-NIH hoặc Beijing 1 (P-1) - Văcxin tinh chế từ tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK), chủng Beijing 3 (P-3).
-Văcxin tinh chế từ tế bào Vero sử dụng chủng Beijing 1 hoặc SA-14-14-2
tất cả các chủng nói trên đều thuộc genotyp 3.
1.7.2.Văcxin sống giảm độc lực: sản xuất trên tế bào PHK chủng SA-14-14-2 1.7.3. Văcxin thế hệ 3: sử dụng công nghệ tái tổ hợp AND từ protein kháng nguyên E hiện đang được nghiên cứu, chưa có công bố về thử nghiệm lâm sàng.
1.8. Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột [64].
1.8.1. Định nghĩa: là sản phẩm dạng lỏng hoặc đông khô được tinh chế từ não chuột đã được gây nhiễm virut và được bất hoạt bằng phương pháp thích hợp.
1.8.2.Chủng virut: Việc sản xuất văcxin VNNB phải sử dụng hệ thống chủng virut. Cơ quan kiểm định Quốc gia nên xác định số lần cấy chuyển từ chủng virut gốc giống. Chủng virut giống nên giữở dạng đông khô hoặc đông băng ( từ -20oC đến -60oC).
1.8.3.Chuột cho sản xuất văcxin: Chuột được sử dụng cho virut VNNB nhân lên trên não phải dưới 5 tuần tuổi và không có dấu hiệu bệnh lý.
1.8.4. Sản xuất văcxin: Não chuột được tiêm chủng virut sản xuất. Sau đó tiến hành gặt não khi chuột có dấu hiệu liệt. Não chuột được nghiền đồng nhất trong môi trường thích hợp và được tinh chế, bất hoạt bằng phương pháp hóa lý thích hợp.
1.8.5. Kiểm định văcxin: Phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến bán thành phẩm và thành phẩm cuối cùng).Việc đảm bảo chất lượng văcxin là một công việc phức tạp bắt đầu từ
công việc kiểm định nguồn nguyên liệu đầu, giám sát quy trình sản xuất và tuân theo thực hành sản xuất đúng đắn (GMP) một cách nghiêm khắc để xuất xưởng văcxin có chất lượng tốt. Việc kiểm tra đánh giá chất lượng văcxin đòi hỏi tính khách quan và chính xác với đội ngũ cán bộ trung thực, có tay nghề và trình độ chuyên môn. Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình, các phương pháp, kỹ thuật của tổ chức Y tế thế giới và kiểm định Quốc gia quy định, nhằm đảm bảo độ chính xác cao [58].
Chất lượng của văcxin thành phẩm được đánh giá ở các khâu sau: đánh giá ở phòng thí nghiệm, đánh giá lâm sàng và đánh giá thực địa. Đánh giá phòng thí nghiệm là rất quan trọng, bao gồm các thử nghiệm về các mặt hoá học (nhận dạng, tính chất hoá - lý), và sinh vật học (vô khuẩn, an toàn, công hiệu và chất gây sốt). Các thử nghiệm này được thực hiện theo thường quy thống nhất toàn cầu hoặc trong một nước [63].
• Kiểm tra sinh vật học
- Vô khuẩn: Kiểm tra vô khuẩn là để xác định sự vô khuẩn của văcxin. Văcxin phải không có tạp khuẩn hoặc nấm phát triển trên môi trường kiểm tra trong suốt thời gian theo dõi [64]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- An toàn trên chuột: văcxin phải được tiêm trên chuột nhắt và chuột lang sau đó theo dõi chúng sau 7 ngày hoặc 14 ngày. Yêu cầu chuột phải tăng cân, không có dấu hiệu bệnh lý [1, 64].
- Công hiệu: Mục đích của kiểm tra công hiệu là xác định khả năng gây miễn dịch của văcxin. Hiệu lực của văcxin được đảm bảo bởi các thử nghiệm được thực hiện trong từng giai đoạn của quá trình sản xuất và trên sản phẩm cuối cùng. Đối với văcxin VNNB bất hoạt công hiệu được xác định bằng phương pháp trung hoà giảm đám hoại tử trên tế bào BHK-21[1, 64].
- Chất gây sốt: Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện để phát hiện các thành phần gây sốt có trong sản phẩm. Chất gây sốt của văcxin được xác định gián tiếp qua thí nghiệm đo thân nhiệt của thỏ thí nghiệm trước và sau khi tiêm văcxin [1].
• Kiểm tra lý - hoá học
Đối với văcxin VNNB bất hoạt cần kiểm tra những mặt sau đây: - Trạng thái bên ngoài: màu sắc, độđục, thể tích văcxin, nhãn... - Độ pH của văcxin
Chương II
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 sản xuất tại công ty văcxin và sinh phẩm số 1
- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
* Địa điểm nghiên cứu:
Phòng kiểm định văcxin, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)
* Thời gian nghiên cứu
Từ 9/2009-9/2010.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng giống Swiss 4 tuần tuổi, trọng lượng: 11- 13g - Chuột lang 150 – 300 gr
- Thỏ 1,5 – 2,5 kg
2.2.2. Sinh phẩm, môi trường và hoá chất
2.2.2.1. Sinh phẩm
- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A
- Chủng virut VNNB Beijing-1 NIH, Nhật Bản - Tế bào thận chuột đất vàng (BHK- 21).
- Môi trường TSB ( Mỹ)
- Môi trường FTM (Mỹ) - Môi trường TCA (Mỹ)
- Dung dịch PBS pH = 7,4 chứa 0,02% gelatin (Gibco) - Dung dịch LEBA (Gibco) - Dung dịch tripsin 0,025% (Gibco)
- Môi trường MEM× 2 (Sigma) - Dung dịch NaHCO3 7% (Sigma) - Dung dịch Agarose 2% (Gibco)
- Dung dịch Agar Noble 2% (Gibco) - Dung dịch đỏ trung tính 0,25% (Sigma) - Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma)
- Dung dịch đệm Citrat-photphat pH = 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
có chứa hydrogen peroxid (Sigma) - Na2HPO4.12H2O (Anh) - KH2PO4 (Sigma) - KCl (Sigma) - NaCl (Pháp) - H2SO4 (Nhật Bản) - Tween 20 (Sigma) - Dung dịch NaCl 0,9% (Sigma) - Dung dịch đồng kiềm (Sigma) - Thuốc thử Folin Ciocaltor (Sigma) - Albumin bò tinh khiết (Sigma) - Nước cất 2 lần (Sigma) - Formalin 37% (Difco, Mỹ) - Gelatin (Sigma, Mỹ) - Cồn 70 độ (Halico, Việt Nam)
- Axit tricloracetic (Gibco) - Acetylaceton (Sigma) - Amoni acetat (Sigma) - Axit acetic (Sigma) - Dithizon (Sigma) - Carbon tetraclorit (Sigma) - Kháng sinh: Ampicillin, Kanamycin, Erythromycin,
Funzigon Vicillin (Sigma)
2.2.2.3. Vật tư, trang thiết bị
- Tube thuỷ tinh φ 14 (Việt Nam) - Chai thuỷ tinh 100ml, 250ml, 500ml (Schotte- Đức)
- Ống đong 100ml, 250ml, 500ml (Schotte- Đức) - Pipet nhựa loại 2ml, 10ml & 25ml Kimble- Mỹ)
- Đầu côn 300 µl, 1000 µl (Labosystem - Mỹ) - Pipetman200µl,1000µl (Gilson) - Pipette Aid (Drummond Scient. Co. - Mỹ) - Giấy Parafilm (Laboratory film- Anh ) - Giấy thấm (Việt Nam) - Giá đểống nghiệm (Việt Nam) - Máy trộn – KIKA (Malaysia) - Máy cách thuỷ ổn nhiệt (Nhật Bản) - Tủ lạnh (Mitsubishi - Nhật Bản) - Tủấm CO2 (Jouan- Pháp) - Tủẩm 37°C (Sanofi-Pháp) - Máy đo pH (Metter Toledo/MP220- Thuỵ sĩ) - Cân phân tích (Metter Toledo/MP220- Thuỵ sĩ) - Máy khuấy từ (KIKA/MIDI MR1- Đức ) - Máy ly tâm lạnh (Kubota - Nhật Bản) - Máy đo mật độ quang (OD) (Nhật Bản)
- Hotte Laminaire (lọc thổi không khí vô trùng) (Pháp) - Găng tay, mũ, khẩu trang vô trùng. (Việt Nam) - Máy hút chân không (Nhật Bản) - Thùng nitơ lỏng (giữ giống virut và tế bào) (Pháp) - Lò sấy khô (Mỹ) - Lò hấp ướt (Pháp) - Và các thiết bị khác
2.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
* Thiết kế nghiên cứu: tiến hành theo phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm
* Cỡ mẫu nghiên cứu:
Tiến hành thử nghiệm trên 6 loạt văcxin thành phẩm.
* Biến số và chỉ số nghiên cứu:
Hàm lượng TCA-protein, Hàm lượng Thimerosal, Hàm lượng Formaldehyd Độ pH
Tỷ lệ chuột lang tăng trọng Tỷ lệ chuột nhắt tăng trọng Nhiệt độ tăng của thỏ (độ C) Tỷ lệ mọc của nấm và vi khuẩn Hiệu giá kháng thể trung hoà.
2.3.2. Kiểm tra tính an toàn của vắc xin VNNB
2.3.2.1. Kiểm tra an toàn chung (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009,
SOP: KĐQG-21, 2007, NICVB)
Chọn chuột lang 150 – 300 g khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm (lồng chuồng, nhiệt độ và độ ẩm phòng, thức ăn...) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột lang. Tiêm 5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi trọng lượng hàng ngày trong 7 ngày. Yêu cầu chất lượng sau tiêm chuột khoẻ mạnh, bình thường, tăng trọng.
Hình 2.1: Tiêm chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB
Hình 2.2: Theo dõi trọng lượng chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB
* Thử nghiệm trên chuột nhắt:
Chọn chuột nhắt trắng 5 tuần tuổi, khoẻ mạnh, bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm ( như trên chuột lang) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột nhắt. Liều tiêm 0,5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi ít nhất 7 ngày. Hàng ngày theo dõi trọng lượng và tình trạng sức khoẻ của chuột. Yêu cầu chất lượng sau tiêm 7 ngày chuột khoẻ mạnh, bình thường và tăng trọng.
Hình 2.3: Tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng trong thử nghiệm an toàn chung
Hình 2.4: Theo dõi trọng lượng chuột nhắt trong thử nghiệm
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});