SOP: KĐQG-21, 2007, NICVB)
Chọn chuột lang 150 – 300 g khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm (lồng chuồng, nhiệt độ và độ ẩm phòng, thức ăn...) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột lang. Tiêm 5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi trọng lượng hàng ngày trong 7 ngày. Yêu cầu chất lượng sau tiêm chuột khoẻ mạnh, bình thường, tăng trọng.
Hình 2.1: Tiêm chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB
Hình 2.2: Theo dõi trọng lượng chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung ở NICVB
* Thử nghiệm trên chuột nhắt:
Chọn chuột nhắt trắng 5 tuần tuổi, khoẻ mạnh, bình thường. Thời gian thích nghi điều kiện thử nghiệm ( như trên chuột lang) ít nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dùng 2 chuột nhắt. Liều tiêm 0,5 ml vào đường phúc mạc cho mỗi chuột. Theo dõi ít nhất 7 ngày. Hàng ngày theo dõi trọng lượng và tình trạng sức khoẻ của chuột. Yêu cầu chất lượng sau tiêm 7 ngày chuột khoẻ mạnh, bình thường và tăng trọng.
Hình 2.3: Tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng trong thử nghiệm an toàn chung
Hình 2.4: Theo dõi trọng lượng chuột nhắt trong thử nghiệm
2.3.2.2. Kiểm tra chất gây sốt (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
KĐQG-22, 2007, NICVB)
Thử nghiệm chất gây sốt là phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt của văcxin dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ trước và sau khi tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ dung dịch mẫu thử.
Văcxin thành phẩm được kiểm tra chất gây sốt trên thỏ. Đây là phương pháp nhậy nhất để phát hiện yếu tố gây sốt trong văcxin.
• Lựa chọn động vật thí nghiệm
Thỏ khoẻ mạnh, trưởng thành, đực hoặc cái ( nhưng không mang thai), cân nặng không ít hơn 1,5 kg, được nuôi dưỡng bằng thức ăn không chứa chất kháng sinh và không bị tụt cân trong suốt 1 tuần trước khi thử nghiệm. Trong thời gian 3 ngày trước khi thí nghiệm, không sử dụng thỏ này cho những thí nghiệm tương tự khác.
• Phòng thí nghiệm
Thử nghiệm được tiến hành trong phòng yên tĩnh, tránh mọi tiếng động và ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm và nhiệt độ phòng không chênh lệch 3 độ C so với nơi ở cũ. Thỏ được nuôi riêng trong phòng yên tĩnh có nhiệt độ 20-25 oC, cho thức ăn tổng hợp không có chất kháng sinh. Trước ngày tiêm, để thỏ nhịn ăn qua đêm ( nhưng được uống nước) cho đến khi thí nghiệm kết thúc. Không cho uống nước trong thời gian đang làm thí nghiệm
• Thử nghiệm thăm dò
1 ngày đến 3 ngày trước khi tiến hành tiêm văcxin, cần kiểm tra sơ bộ về tính nhậy cảm cho các thỏ thí nghiệm bằng cách tiêm vào tĩnh mạch 10ml/kg trọng lượng nước muối sinh lý 0,9% không chứa chất gây sốt. Ghi nhiệt độ trước tiêm và tiếp tục trong vòng 3 giờ sau khi tiêm dung dịch nước muối sinh lý. Nếu thỏ nào có nhiệt độ giao động so với nhiệt độ ban đầu > 0,6 oC sẽ bị loại, không dùng đưa vào thử nghiệm chính.
• Thử nghiệm chính
Thỏ thí nghiệm là thỏ đạt các tiêu chuẩn trên, được để trong lồng chuyên dụng ít nhất 60 phút để ổn định. Sau đó tiến hành đo nhiệt độ thỏ 2 lần mỗi lần cách nhau 30 phút. Nhiệt độ ban đầu của thỏ là giá trị trung bình của các lần đo này. Tiêu chuẩn đưa vào thí nghiệm là những thỏ có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo không quá 0,2 oC và nhiệt độ ban đầu nằm trong khoảng 38 oC đến 39,8 oC. Mỗi mẫu thử được tiêm cho một nhóm thỏ 3 con, nhiệt độ chênh lệch trong nhóm không quá 1 oC. Sử dụng nhiệt kế có vạch chia đến 0,1oC. Bơm kim tiêm vô trùng loại dùng 1 lần. Cố định thỏ bằng dụng cụ đặc biệt ở tư thế thoải mái. Đưa nhiệt kế vào hậu môn 6-9 mm. Mẫu thí nghiệm để ở 37oC trước khi tiêm. Đường tiêm là tĩnh mạch tai. Liều tiêm 1 ml/kg trọng lượng. Theo dõi đo và đọc nhiệt độ ít nhất 3 lần với khoảng cách giữa 2 lần đo nhiệt độ không quá 60 phút. Nhiệt độ cao nhất của thỏ được ghi nhận trong 3 giờ sau khi tiêm được coi là nhiệt độ “tối đa”. Hiệu số giữa nhiệt độ ban đầu và nhiệt độ tối đa được coi là nhiệt độ phản ứng. Nếu hiệu số này là âm tính thì phản ứng được đọc là 0oC. Thử nghiệm tiến hành lần đầu trên 3 thỏ và kết quả nhận định theo bảng dưới đây. Nếu tổng nhiệt độ tăng nằm giữa cột 3 và 4 thì thử nghiệm phải tiến hành lại trên số thỏ gấp đôi. Tổng nhiệt độ tăng của 6 thỏ được nhận định theo bảng 2.1. Thử nghiệm không lặp lại quá 3 lần.
Bảng2.1 : Tiêu chuẩn kiểm tra chất gây sốt (TCYTTG)
Thử nghiệm
Tổng số thỏ tích luỹ
Tổng nhiệt độ theo tiêu chuẩn (TCYTTG) Thử nghiệm không đạt với tổng nhiệt độ là 1 3 1,4oC 2,4oC 2 6 3,0oC 4,1oC 3 9 4,9oC 5,9oC
Hình 2.5: Tiêm tĩnh mạch tai thỏ trong kiểm tra chất gây sốt ở NICVB
2.3.2.3. Kiểm tra an toàn đặc hiệu (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009,
SOP: VR03-13, 2007, NICVB)
Chọn chuột nhắt trắng 11-13 g khoẻ mạnh, thể trạng phát triển tốt. Tiêm mẫu thử 0,03 ml/con, mỗi mẫu thử nghiệm sử dụng 10 chuột. Vị trí tiêm não chuột giữa điểm tai và mắt. Theo dõi sức khoẻ trọng lượng chuột trong 14 ngày. Ngày thứ 14 đọc kết quả với thể trạng chuột khoẻ mạnh và tăng trọng bình thường, không hề có các triệu chứng bệnh lý là đạt yêu cầu.
Hình 2.6: Tiêm não chuột trong kiểm tra an toàn đặc hiệu ở NICVB
2.3.2.4. Kiểm tra vô trùng (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL05-01, 2007, NICVB) HL05-01, 2007, NICVB)
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm kiểm tra vô trùng VX-SP là FTM và TSB. Thể tích mỗi ống môi trường 20ml/ống. Tỷ lệ số ống môi trường FTM và TBS là 3:1. Trong thời gian chưa sử dụng, hai môi trường này được bảo quản ở nhiệt độ 20-25 độ C.
• Tiến hành:
- Đi găng tay vô trùng.
- Mẫu văcxin sau khi lau cồn được đặt vào khay vô trùng và chuyển vào tủ cấy vô trùng.
- Chuyển dụng cụ, môi trường vào tủ cấy vô trùng.
- Thay găng tay vô trùng
- Dùng kẹp để mở nắp các lọ văcxin, dùng pipet Pasteur hút văcxin từ các lọ cấy vào các ống môi trường. Mỗi lọ dùng riêng biệt một pipet Pasteur. - Lượng văcxin cần lấy từ mỗi lọ để cấy vào mỗi loại môi trường và thể
tích cấy vào mỗi ống môi trường được thực hiện theo bảng dưới đây: Thể tích có trong mỗi lọ Số lượng tối thiểu dùng
cho mỗi loại môi trường
Số lượng cấy vào mỗi ống môi trường < 1ml Toàn bộ VX có trong mỗi lọ Toàn bộ VX có trong mỗi lọ Từ 1ml đến 20 ml 1ml 1ml > 20 ml và < 100ml 5ml 1ml - Cách cấy:
+ Đối với FTM: đưa sâu pi-pét tới gần đáy ống môi trường, vừa bơm văcxin vừa di chuyển pi-pét lên bề mặt môi trường.
- Ủ môi trường và theo dõi
Các ống môi trường được ủ ở nhiệt độ thích hợp ít nhất 14 ngày: + FTM: ủ ở nhiệt độ 30-35oC
+ TSB: ủ ở nhiệt độ 20-25oC
- Theo dõi các ống môi trường ở 3 thời điểm để phát hiện xem có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường hay không:
Lần 1: vào ngày thứ 3 Lần 2: vào ngày thứ 7
Lần 3: vào ngày cuối cùng.
- Đánh giá kết quả: Theo tiêu chuẩn của WHO (WHO-TRS 530, phụ lục 4) Văcxin đạt yêu cầu về vô trùng nếu không có dấu hiệu phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường cấy văcxin sau ít nhất 14 ngày theo dõi.
2.3.2.5. Kiểm tra các thành phần hoá học
a) Đo độ pH (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL01-09, 2005,
NICVB).
Sử dụng máy đo pH Metter Toledo (Thuỵ Sĩ) với các dung dịch chuẩn pH 4,0 và pH 7,0. Cần chú ý rửa đầu từ và bảo quản đầu từ đo pH cho sạch bằng cách sau khi đo pH phải rửa bằng nước cất 2 lần trong nhiều lần. pH của văcxin phải nằm trong khoảng 6,8 – 7,4.
b) Định lượng TCA-protein trong vắc xin.(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5,
2009, SOP: HL01-10, 2005, NICVB) .
* Nguyên lý
Protein trong văcxin được tủa bằng axit tricloraxetic (TCA) rồi định lượng theo phương pháp Lowry. Các dung dịch protein chuẩn là albumin bò có nồng độ 50,100 và 150 µg/ml.
- Dung dịch A: Pha ngay trước khi dùng
Hoà tan 0,4 g natri hydroxyt trong nước cất, thêm 4g natricarbonat, lắc cho tan đều. Thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
- Dung dịch B: Pha ngay trước khi dùng
Trộn đều dung dịch đồng sulfate 2% với 1ml natri tritrate 4%. - Dung dịch C: (thêm 1 ml dung dịch B vào 50 ml dung dịch A)
- Dung dịch axit tricloraxetic 10%: cân 100 g axit tricloraxetic rồi thêm nước cất vừa đủ 1000 ml.
*Tiến hành:
- Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) vào các protein chuẩn và các mẫu chuẩn văcxin các ống (mỗi mẫu 3 ống, mỗi ống 1 ml)
- Thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch TCA 10%
- Đun cách thuỷ 100oC, 15 phút sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 3500v/p trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa tủa bằng 2 ml dung dịch TCA 5%
- Ly tâm 3500v/p trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ nước nổi.
- Thêm vào mỗi ống 2,5 ml dung dịch C, lắc đều, đểở nhiệt độ phòng 30 phút - Thêm vào mỗi ống 2,5 ml nước cất.
- Thêm 0,5 ml dung dịch folin để 37oC trong 30 phút, để nguội. - Đo độ hấp phụở bước sóng 750 nm trên máy đo quang phổ.
- Dựng đường chuẩn protein chuẩn rồi dựa theo đường chuẩn tính hàm lượng protein trong văcxin.
c) Định lượng Thimerosal (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL01-01, 2005, NICVB)
* Nguyên lý
Dựa trên cơ sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 430 nm. Đo độ hấp phụ của hợp chất tạo thành ở bước sóng này.
- Dung dịch Dithizon 0,002%: cân 2 mg dithizon, thêm carbontetraclorit vừa đủ 100 ml.
- Nước amonia 60% (9N): đong 60 ml amonia, thêm nước cất vừa đủ 100 ml. *Tiến hành
- Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng), các dung dịch thimerosal chuẩn và mẫu văcxin vào các ống, mỗi ống 0,5 ml (mỗi mẫu 2 ống).
-Thêm nước cất vừa đủ 5ml
- Thêm 10 ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút.
- Để ở nhiệt độ phòng, nước và CCL4 tách thành 2 lớp. Hút bỏ lớp nước ở trên. -Thêm 10 ml nước cất, lắc mạnh. Để lắng rồi hút bỏ lớp nước ở trên.
- Thêm nước amonia, lắc đều rồi hút bỏ lớp nước ở trên. -Thêm 1 thìa natri sulfate khan để ngừng phản ứng.
- Đo độ hấp phụở bước sóng 480 nm trên máy quang phổ kế.
- Dựng đường chuẩn thimerosal rồi dựa vào đó tính hàm lượng thimerosal trong văcxin
d) Định lượng formaldehyt (Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL01-08, 2005, NICVB)
* Nguyên lý
Định lượng formaldehyt bằng phương pháp đo cường độ màu của 3,5 diacetyl 4-dihydrothidin ở bước sóng 415 nm. Phức hợp này được tạo thành do phản ứng của formaldehyt chứa trong văcxin với acetylaceton và amonia trong môi trường axit nhẹ.
* Chuẩn bị dung dịch
- Dung dịch formaldehyt chuẩn: Cân 388,8mg examethylen tetramin, thêm nước cất vừa đủ 500 ml. Nồng độ formaldehyt trong dung dịch này bằng 1000µg/ml. Từ dung dịch này pha các dung dịch formaldehyt có nồng độ 2,4 và 6 µg/ml. - Dung dịch acetyl aceton: Hoà tan 150 g amonia acetat trong một lượng nước thích hợp, thêm 30 ml axit acetic và 2 ml acetylaceton rồi thêm nước cất vừa đủ 1000 ml.
*Tiến hành
Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) các dung dịch formaldehyt chuẩn và mẫu văcxin vào các ống (2ml/ống; mỗi mẫu 2 ống). Thêm vào mỗi ống 2 ml acetylaceton ( đã pha amoniaacetat và axit acetic). Đun cách thuỷ 100oC trong 15 phút, rồi làm nguội bằng nước vòi. Đo độ hấp phụ ở bước sóng 415 nm trên máy quang phổ kế. Dựng đường chuẩn nồng độ formaldehyt rồi dựa vào đó để tính hàm lượng formaldehyt trong văcxin.
Hình 2.8: Kiểm tra thành phần hoá học văcxin VNNB ở NICVB
2.3.3. Kiểm tra tính công hiệu của vắc xin VNNB
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: VR03-01, 2007, NICVB)
a) Nguyên lý
Công hiệu của văcxin VNNB dựa trên hiệu giá kháng thể trung hoà sau khi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Hiệu giá kháng thể trung hoà được tính bằng giá trị 50% giảm đám hoại tử.
b) Tiến hành
* Pha văcxin: - Văcxin mẫu chuẩn là EJP034A (BIKEN) - Văcxin mẫu thử
Tỷ lệ pha: nhóm A: 1/16; B: 1/32 và C:1/64 (Vắc xin mẫu chuẩn) nhóm D: 1/16; E: 1/32 và F:1/64 (Văcxin mẫu thử ) Dung dịch pha: M/75 pH 7,4 có 0,02% gelatin
Chú ý: mẫu văcxin và mẫu chuẩn cùng làm song song. Một lúc có thể làm nhiều mẫu văcxin với một mẫu văcxin chuẩn.
* Gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng 11-13 g:: + Số chuột cần tiêm: mỗi nồng độ 10 con
+ Liều tiêm: 0,5 ml/con × 2 liều cách nhau 7 ngày. + Đường tiêm: phúc mạc (IP)
+ Lấy máu tim: 7 ngày sau khi tiêm
Ngày
Lấy máu 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tiêm mũi 1 Tiêm mũi 2
+ Lấy máu tim chuột cho vào tube và để máu ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ rồi để tủ lạnh 40 - 80C qua đêm.
+ Chắt huyết thanh: dùng pipet - man hút 100 µl của mỗi tube (của 1 con chuột). Hộn vào 1 tube theo nhóm A,B,C...
+ Pha loãng huyết thanh 1/10 bằng dung dịch LEBA.có 0,2% BA + Bất hoạt huyết thanh ở 560C/30 phút trong bể ổn nhiệt 370C. + Bảo quản huyết thanh đã bất hoạt ở - 200C.
Bảng 2.2: Độ pha loãng huyết thanh gây miễn dịch trên chuột
Mẫu văcxin gây miễn dịch Độ pha loãng huyết thanh Nhóm chuột A 1/640, 1/ 1280, 1/2560 B 1/320, 1/640, 1/ 1280 Mẫu chuẩn EJP034A pha gây miễn dịch C 1/160, 1/320, 1/ 640 Nhóm chuột D 1/640, 1/ 1280, 1/2560 E 1/320, 1/640, 1/ 1280 Mẫu văcxin thử pha gây miễn dịch F 1/160, 1/320, 1/ 640 Mẫu huyết thanh dương 1/80, 1/160, 1/320 * Chuẩn bị dung dịch virut thử thách (CV)
Dung dịch virut thử thách pha đạt 90-150 plaque/đĩa trong dung dịch LE có 0,2% BA
* Chuẩn bị pha thạch cho lớp phủ thứ nhất
+ Dung dịch A: Cân 8g agar Noble, thêm vào 500 ml nước cất 2 lần và sấy ướt 120oC trong 40 phút.
+ Dung dịch B: Cân 5g Lactalbumin hydrolysat (LH), thêm vào 250 ml nước cất 2 lần. Hấp ướt 115oC trong 40 phút
+ Hộn dung dịch A và B sau đó thêm 100 ml glucose 4% + 100 ml Earle đặc 10 lần và 5 ml dung dịch cao nấm men.
Để nguội 50oC rồi thêm 32 ml bicarbonat 7% + 1ml erythromycin + 1 ml kanamycin + 1 ml fungizon và 0,5 ml viccinllin
* Chuẩn bị thạch cho lớp phủ thứ 2: Cân 8g agar Noble, thêm 800 ml nước cất 2 lần. Sấy ướt 120oC trong 40 phút. Thêm 100 ml dung dịch Earle đặc 10 lần + 36 ml đỏ trung tính 25%. Giữở 50oC.
* Chuẩn bị tế bào BHK-21:
+Tế bào BHK-21 đã nuôi trên đĩa petri đường kính 6 cm. Kiểm tra tế bào mọc kín, đẹp.
+ Rửa tế bào bằng dung dịch Hanks có kháng sinh ( lắc nhẹ đều mặt tế bào). + Hút vô trùng qua bơm chân không kiệt hết dịch nuôi tế bào
+ Đánh dấu: tên mẫu, A,B...
Tóm tắt sơđồ trung hoà giảm đám hoại tử (PRNT)
1 ml huyết thanh của mỗi nồng độ pha loãng +1 ml CV (hỗn hợp trung hoà)
Để tủ ấm CO2ở 37oC trong 90 phút
Cấy hỗn hợp trung hoà 0,2 ml vào đĩa tế bào BHK-21 (mỗi độ pha loãng 3 đĩa) láng đều trên bề mặt tế bào
Phủ lớp thạch thứ nhất đã chuẩn bị (5 ml/đĩa)