nghiên cứu khả năng tái sinh chồi hoa mười giờ qua trung gian mô sẹo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI HOA MƯỜI GIỜ (Portulaca grandiflora.) QUA TRUNG GIAN MÔ SẸO Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành : 111 GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH SVTH : TRẦN THỊ THU HIỀN MSSV : 105111023 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009 i MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục biểu đồ vii Danh mục hình viii Chương 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 3 2.1.1. Khái niệm 3 2.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 2.1.3. Những vấn đề trong nhân giống in vitro 6 2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô 8 2.1.5. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro cây thân thảo và cây thân gỗ 8 2.1.6. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro và nhân giống in vivo 9 2.1.7. Các bước nhân giống in vitro 11 2.1.8. Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro 12 2.1.8.1. Sự hình thành chồi bất định 13 2.1.8.2. Sự hình thành rễ bất định 15 2.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 16 2.1.9.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy 16 2.1.9.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 19 2.1.9.3. Ảnh hưởng của các vitamin lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật .24 ii 2.1.9.4. Ảnh hưởng của đường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 24 2.1.10. Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô 25 2.2. Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan thực vật 27 2.2.1. Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro 27 2.2.2. Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo 29 2.2.3. Tạo mô sẹo từ lá song tử diệp 31 2.2.4. Môi trường nuôi cấy mô sẹo 31 2.2.5. Cấy chuyển mô sẹo 33 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa mười giờ 33 2.3.1. Các đặc điểm của cây hoa mười giờ 33 2.3.1.1. Vị trí phân loại 34 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái 35 2.3.2. Một số nghiên cứu đã được tiến hành 35 Chương 3. Vật liệu và phương pháp 38 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 38 3.2. Vật liệu 38 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu 38 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ 38 3.2.3. Các loại môi trường nuôi cấy 38 3.2.4. Điều kiện nuôi cấy ở phòng nuôi cấy in vitro 39 3.2.5. Khử trùng mẫu 39 3.3. Bố trí thí nghiệm 39 3.3.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung thêm Tween 20 39 3.3.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo 40 3.3.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác nhau 41 iii 3.3.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 42 3.4. Phương pháp xử lý số liệu 43 Chương 4. Kết quả - Thảo luận 44 4.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung thêm Tween 20 44 4.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa IBA kết hợp với BA hoặc Kinetin lên sự phát sinh mô sẹo 46 4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác nhau .51 4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 57 Chương 5. Kiến luận – Đề nghị 62 5.1. Kết luận 62 5.2. Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo Phụ lục iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT  MS : MS medium (Murashige và Skoog, 1962)  BA : 6-Benzyladenine  IBA : Indole-3-butyric acid  Kinetine : 6-Furfurylamino purine  HgCl 2 : Thủy ngân chlorite  NaOCl : Sodium hypochlorite  Ca(OCl) 2 : Calcium hypochlorite  H 2 O 2 : Hydro peroxide  Cl 2 : Khí Clo  NADCC : Sodium dichloroisocyanurate v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung thêm Tween 20 Bảng 3.2 Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Bảng 3.3 Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA và Kinetine lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Bảng 3.4 Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ở các nồng độ khác nhau Bảng 4.1 Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh mô sẹo Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo Bảng 4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác nhau Bảng 4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh chồi vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hoa mười giờ Hình 2.2 Các loại hoa mười giờ Hình 4.1 Mô sẹo ở môi trường có bổ sung IBA kết hợp với BA Hình 4.2 Mô sẹo ở môi trường có bổ sung IBA kết hợp với Kinetine Hình 4.3 Chồi được tái sinh từ 2 dòng mô sẹo trên 2 môi trường khác nhau Hình 4.4 Chồi tái sinh trên các môi trường bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau Hình 4.5 Cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:  Ban giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.  Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, ân cần chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Thầy Phạm Minh Nhựt – chủ nhiệm lớp 05DSH đã ân cần chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học.  Thầy Huỳnh Văn Thành, cô Vũ Ngọc Yến Ly phụ trách tại phòng thí nghiệm của khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài.  Bạn Thanh Xuân, Quỳnh Quyên và Lâm Trúc cùng thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm 9 của khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.  Tập thể lớp 05DSH đã gắn bó, động viên, giúp đỡ và chia sẻ những vui buồn trong suốt 4 năm qua.  Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc nhất đối với bố mẹ. Cám ơn bố mẹ và hai em đã luôn tin tưởng, yêu thương, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho con học tập trong suốt 4 năm trời đại học. Sinh viên thực hiện Trần Thị Thu Hiền Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh SVTH: Trần Thị Thu Hiền 1 Chương 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc dù là một loài cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng và màu sắc sặc sỡ mà loài cây này mới giúp tôn lên vẻ đẹp của những khu vườn hay khuôn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ. Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngoài, ở bên ngoài môi trường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh nhưng khi tiến hành nuôi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ. Đây là loài cây thân có nhiều lông nhỏ gây khó khăn trong việc tạo nguồn mẫu vô trùng. Đó là những bước nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười giờ ra hoa trong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, có thể kinh doanh được, không phải chăm sóc như hoa ngoài tự nhiên mà cây vẫn tươi tốt. Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại có tập tính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đó chính là điều đặc biệt của loài cây này nhưng khi nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện không có oxy cây vẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều không dễ chút nào vì nó phá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đó là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở. Đây là vấn đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian. Là loài cây rất phổ biến và dễ trồng nên nó có giá trị kinh tế không cao khi chưa tiến hành nuôi cấy in vitro. Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của loài cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất công dụng cùng với một số cây thuốc khác trong họ của nó như loài rau sam rất tốt cho sức khỏe. Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh SVTH: Trần Thị Thu Hiền 2 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu khả năng nuôi cấy mô cây hoa mười giờ nhằm tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là ra hoa trong ống nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Phải đưa được mẫu vào để tạo mẫu vô trùng, khảo sát mẫu ban đầu ở các môi trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng [...]... của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy... cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica (Coumans và cộng sự, 1979)  Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả. .. chúng có thể trở thành mô phân sinh rễ, trong vài trường hợp khác thì là mô phân sinh chồi Nhìn chung người ta xác nhận sự tạo mô sẹo in vitro nhờ áp dụng auxin có thể do ba quá trình khác nhau: sự phản phân hóa của vài tế bào nhu mô, sự kích thích hoạt động của các mô phân sinh cấp 2 và sự xáo trộn của các mô phân sinh cấp 1, đặc biệt là các mô phân sinh rễ của các cây con  Tạo mô sẹo từ sự phản phân... mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai... đầu Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica  Tuổi của mô và cơ quan Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn... già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj và Pierik, 1974) và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974) Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được... phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy  Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô. .. Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau SVTH: Trần Thị Thu Hiền 13 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh  Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết định do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng... nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH,… 2.1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 2.1.9.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro:  Kiểu di truyền Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một... Kiên, 2002) 2.2 Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan thực vật Kỹ thuật tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầu những năm 1930, là một trong những phương pháp đầu tiên của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhiều năm Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật,…) . phát sinh mô sẹo 46 4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác nhau .51 4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI HOA MƯỜI GIỜ (Portulaca grandiflora.) QUA TRUNG GIAN MÔ SẸO Chuyên. phát sinh mô sẹo của mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Bảng 3.3 Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA và Kinetine lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Bảng 3.4 Môi trường khảo