Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi hoa mười giờ ( Portulaca grandiflora ) qua trung gian mô sẹo

Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Hoa mười (Portulaca grandiflora) thân thảo thuộc họ rau sam, lồi thân thảo phổ biến dễ trồng nhờ tính đa dạng màu sắc sặc sỡ mà lồi giúp tơn lên vẻ đẹp khu vườn hay khn viên, đặc biệt lúc hoa nở rộ Ni cấy in vitro hoa mười để khảo sát điều kiện sinh sống hoa mười ống nghiệm khác so với điều kiện bên ngồi, bên ngồi mơi trường tự nhiên hoa mười dễ trồng thời gian phát triển nhanh tiến hành ni cấy in vitro nhiều thời gian mục đích khảo sát tập tính điều kiện sống hoa mười Đây lồi thân có nhiều lơng nhỏ gây khó khăn việc tạo nguồn mẫu vơ trùng Đó bước nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu ni cấy hoa mười hoa ống nghiệm loại hình nhiều người ưa thích nhìn đẹp, kinh doanh được, khơng phải chăm sóc hoa ngồi tự nhiên mà tươi tốt Hoa mười đồng hồ sinh học khoảng – 10 sáng hoa nở rộ, nghiên cứu để khảo sát vấn đề xem hoa mười lại có tập tính này, hoa quỳnh nở vào lúc 12 đêm, điều đặc biệt lồi ni cấy ống nghiệm với điều kiện khơng có oxy phát triển tốt để hoa nở ngày điều khơng dễ chút phá vỡ quy luật tự nhiên cây, – 10 cho hoa nở Đây vấn đề cần phải nghiên cứu lâu nhiều thời gian Là lồi phổ biến dễ trồng nên có giá trị kinh tế khơng cao chưa tiến hành ni cấy in vitro Đây bước đầu khai thác giá trị kinh tế lồi này, phổ biến loại thuốc nam cơng dụng với số thuốc khác họ lồi rau sam tốt cho sức khỏe SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích u cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu khả ni cấy mơ hoa mười nhằm tạo nguồn mẫu vơ trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực nghiên cứu hoa ống nghiệm 1.2.2 u cầu Phải đưa mẫu vào để tạo mẫu vơ trùng, khảo sát mẫu ban đầu mơi trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Chương 2: Tổng quan 2.1 Khái qt kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1 Khái niệm  Kỹ thuật nhân giống in vitro hay ni cấy mơ tế bào thực vật thuật ngữ mơ tả phương pháp ni cấy quan thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp muối khống, vitamin, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật điều kiện vơ trùng (Dương Cơng Kiên, 2002)  Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi quan từ mơ lá, thân, hoa, rễ, củ đỉnh sinh trưởng Trước người ta dùng phương pháp để nghiên cứu đặc tính tế bào phân chia, đặc tính di truyền ảnh hưởng hóa chất tế bào mơ q trình ni cấy  Những năm 70 kỷ XX thập niên bùng nổ cơng nghệ sinh học thực vật, đặc biệt kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật Nó cơng cụ nghiên cứu nhiều nhà khoa học Điều quan trọng vi nhân giống việc nghiên cứu vai trò tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhằm kích thích hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ cho cơng tác nhân giống  Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống làm cách mạng lớn nhân giống thực vật người ta hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật để sản xuất giống thương mại Vi nhân giống trở thành phương pháp nhân giống chuẩn phổ biến nhiều loại trồng như: cơng nghiệp, lâm nghiệp, cảnh, dược liệu, ăn trái rau xanh Phương pháp có ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Có khả tái sinh từ vùng mơ quan khác (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà ngồi tự nhiên khơng thể thực Có thể sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn, diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại Cây tạo đồng mặt di truyền Tạo virus thơng qua xử lý nhiệt hay ni cấy đỉnh sinh trưởng Sản xuất quanh năm chủ động kiểm sốt yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… Bảo quản nguồn giống in vitro với số lượng lớn lại chiếm diện tích nhỏ Tạo có khả hoa, tạo sớm Tạo dòng tồn (cây chà là) tồn đực (cây măng tây) theo mong muốn Dễ dàng tạo giống trồng phương pháp chuyển gen  Bên cạnh ưu điểm bật thuận lợi cho mục đích nhân giống đề cập phương pháp vi nhân giống có nhược điểm cần phải khắc phục: Giá thành sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống cao Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan cần khoảng thời gian dài trước thích ứng trồng ngồi vườn ươm Sự đa dạng dòng sản phẩm nhân giống hạn chế, nghĩa tạo thường đồng mặt kiểu hình Có thể xảy đột biến tác dụng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào mơi trường ni cấy  Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống vào sản xuất thương mại giá thành sản phẩm tạo q cao Theo Kozai cộng (1992), ngun nhân vấn đề thất nhiễm khuẩn nấm q trình ni cấy, tỷ lệ sống sót thấp SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh giai đoạn chuyển vườn ươm, giá nhân cơng lao động chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết q trình cấy chuyền mẫu cấy sang mơi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình ni cấy,…) ngun liệu (đường, agar,…) cao Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng phát triển thực vật, có làm tăng tính bất thường di truyền tế bào Tuy nhiên, hạn chế nghiêm trọng kỹ thuật vi nhân giống tỷ lệ sống sót sau chuyển vườn ươm thường thấp khác biệt lớn điều kiện mơi trường in vitro ex vitro 2.1.2 Các phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật  Ni cấy đỉnh sinh trưởng Ni cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm ni cấy chồi đỉnh chồi bên Sau vơ trùng, mẫu ni cấy mơi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khống vơ hữu mơi trường khống có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ đỉnh sinh trưởng, sau khoảng thời gian ni cấy định mẫu phát triển thành chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, rễ để trở thành hồn chỉnh Cây chuyển đất thích nghi phát triển bình thường  Ni cấy mơ sẹo Mơ sẹo khối tế bào phát triển vơ tổ chức, hình thành phản phân hóa tế bào phân hóa Mơ sẹo phát triển nhanh mơi trường có diện auxin Khối mơ sẹo có khả tái sinh thành hồn chỉnh điều kiện mơi trường khơng có chất kích thích tạo mơ sẹo Ni cấy mơ sẹo thực loại thực vật khơng có khả nhân giống thơng qua ni cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mơ sẹo có đặc tính giống mẹ Từ cụm tế bào mơ sẹo tái sinh lúc nhiều chồi ni cấy đỉnh sinh trưởng, nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh  Ni cấy tế bào đơn Khối mơ sẹo ni cấy mơi trường lỏng đặt máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp tách thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi tế bào đơn Tế bào đơn lọc ni cấy mơi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với chất thích hợp bổ sung vào mơi trường tế bào có khả sản xuất chất có hoạt tính sinh học Sau thời gian ni cấy kéo dài mơi trường lỏng tế bào đơn tách trải mơi trường thạch - Khi mơi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mơ sẹo - Khi mơi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả tái sinh thành hồn chỉnh  Ni cấy protoplast – chuyển gen Protoplast (tế bào trần) tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, có sức sống trì đầy đủ chức sẵn có Trong điều kiện ni cấy thích hợp, protoplast có khả tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia tái sinh thành hồn chỉnh (tính tồn thực vật) Khi tế bào vách tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả dung hợp với tạo tế bào lai, đặc tính cho phép cải thiện giống trồng Q trình dung hợp protoplast thực hai đối tượng lồi hay khác lồi  Ni cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn thực vật ni cấy mơi trường thích hợp tạo thành mơ sẹo Mơ sẹo tái sinh thành hồn chỉnh đơn bội 2.1.3 Những vấn đề nhân giống vơ tính in vitro  Tính bất định mặt di truyền Tính bất định mặt di truyền tác động số chất kích thích sinh trưởng Tần số biến dị thường khác khơng lặp lại Việc ni cấy mơ sẹo SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh tế bào đơn thường tần số biến dị cao so với ni cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy phụ thuộc yếu tố: - Kiểu di truyền hay giống ni cấy - Loại mơ cấy - Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, loại biến dị nhiễm sắc thể xuất cao thời gian ni cấy kéo dài Số lần cấy chuyền thời gian cấy chuyền hai lần ngắn làm giảm khả gây biến dị  Sự nhiễm mẫu Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật Có thể giảm khả lại mẫu cách: - Sử dụng mẫu ni cấy mơ phân sinh đỉnh - Sử dụng loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin, Vacomicin Penicillin với nồng độ phụ thuộc vào vật liệu ni cấy  Sự hóa thủy tinh thể Hiện tượng thủy tinh thể dạng bệnh lý cây, bị nước chuyển từ mơi trường in vitro mơi trường ngồi Ngun nhân in vitro có lớp sáp bên ngồi biểu bì mỏng, tế bào chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước, cấu tạo khí khổng thường có hình tròn thay hình elip tự nhiên, khí khổng mở suốt q trình ni cấy mật độ khí khổng cao Ngồi nhu mơ thịt lớp mơ bảo vệ mặt ngồi phát triển, tế bào chất đậm đặc, diệp lục so với bình thường nên đưa mơi trường ngồi với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác, khơng thể thích nghi dẫn đến stress chết Có số phương pháp hạn chế q trình hóa thủy tinh thể sau: - Giảm hút nước in vitro cách tăng nồng độ đường mơi trường cấy dùng chất có áp suất thẩm thấu cao Tuy nhiên, điều làm giảm tổng hợp diệp lục tố ức chế hình thành chồi SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp - GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Tránh gây thương tổn mẫu cấy khử trùng tiếp xúc với mơi trường cấy - Ở số lồi sử dụng chất ABA - Giảm nồng độ đạm mơi trường cấy - Giảm C2H2 bình ni cấy cách thơng gió tốt, tăng cường ánh sáng giảm nhiệt độ phòng cấy 2.1.4 Ứng dụng kỹ thuật ni cấy mơ Phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật ứng dụng số lĩnh vực như:  Lai tạo lồi xa di truyền phương pháp dung hợp (ni cấy tế bào trần)  Ni cấy tế bào thực vật mơi trường lỏng (ni cấy huyền phù tế bào) quy mơ lớn để sản xuất hợp chất thứ cấp  Chọn lọc tế bào có đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành thay chọn lọc ngồi đồng ruộng (ni cấy tế bào đơn)  Sản xuất dòng đồng hợp tử (ni cấy bao phấn túi phấn)  Vi nhân giống giống có giá trị khoa học thương mại  Bảo quản phơi quan điều kiện nhiệt độ thấp  Ni cấy phơi sinh dưỡng, phơi hợp tử  Ni cấy quang tự dưỡng 2.1.5 Sự khác nhân giống in vitro thân thảo thân gỗ  Các lồi thân gỗ có khả tái sinh lồi thân thảo  Các nghiên cứu nhân giống thân gỗ bắt đầu trễ so với thân thảo  Việc cảm ứng trẻ hóa thân gỗ khó thân thảo  Tốc độ nhân giống thân gỗ thấp thân thảo SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh  Tác động trạng thái hưu miên tăng trưởng chồi kéo dài thân thân gỗ theo thời kì năm  Cây thân gỗ dễ bị ảnh hưởng chất độc tiết mơi trường ni cấy  Mơ thân gỗ khó khử trùng đại đa số mọc ngồi thiên nhiên  Cây thân gỗ bụi thường chọn lọc để nhân dòng sau trưởng thành Ở giai đoạn mơ thường khó khơng thể sử dụng nhân giống in vitro  Sự đa dạng mặt di truyền thân gỗ lớn so với nơng nghiệp loại thân thảo khác, sau nhân giống thu nhiều kết khác khó kiểm sốt  Cây thân gỗ khơng thể trồng nhà kính, việc thu mẫu bị ảnh hưởng nhiều điều kiện khí hậu điều kiện tăng trưởng khác 2.1.6 Sự khác nhân giống in vitro nhân giống in vivo  Nhân giống vơ tính in vitro nhanh nhân giống vơ tính in vivo  Có thể tạo số lồi thực vật mà khơng thể tiến hành in vivo nhân giống in vitro cảm ứng trẻ hóa mơ  Sự tăng trưởng nhân giống vơ tính in vitro thường mạnh nhân giống vơ tính in vivo trẻ hóa bệnh  Việc nhân giống in vitro tạo bệnh có chọn lọc đối tượng bệnh để đưa vào ni cấy đồng thời xử lý mẫu cấy có mang mầm bệnh trước đưa vào mơi trường ni cấy Các bệnh trao đổi dễ dàng nơi với có kích thước nhỏ khơng trồng đất  Trong ni cấy in vitro sử dụng mẫu cấy ban đầu nhỏ chọn lọc kỹ lưỡng dễ dàng SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh  Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm khơng gian sử dụng so với nhân giống in vivo giảm chi phí lượng trường hợp loại cần nhân giống nhà kính  Do in vitro ni cấy điều kiện hồn tồn thích hợp (nguồn dinh dưỡng điều kiện mơi trường) sản xuất quanh năm  Có thể sử dụng nhân giống in vitro để làm mẹ cho bước nhân giống  Có thể tạo đột biến điểm q trình ni cấy  Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ngân hàng gen  Các tế bào trần huyền phù tế bào đối tượng hữu dụng việc lai soma  Một số loại bị khả sinh sản hữu tính đơn bội, bất thụ đực, bất thụ đột biến,… trì nhân giống phương pháp nhân giống in vitro  Những bất lợi phương pháp nhân giống vơ tính in vitro: - Kiểu gen thực vật khơng ổn định số hệ thống ni cấy - Tạo khơng hồn tồn mong muốn: mọc um tùm số giữ khả trẻ hóa q trình ni cấy - Đặc biệt, số lồi thân gỗ, việc cảm ứng rễ khó thực Trong số trường hợp, có loại tạo rễ in vitro rễ khơng phù hợp tạo rễ sau chuyển trồng đất - Việc chuyển từ ống nghiệm vườn ươm khó số - Cây chuyển từ phòng thí nghiệm vườn ươm dễ bị cơng số loại bệnh hại quen sống điều kiện vơ trùng Vì vậy, cần phải xử lý mơi trường giá thể sống thật cẩn thận SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 10 of 133 10 Header Page 49 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh chọn đốt thân non tươi, khỏe, kết thu sau vơ mẫu mơ sẹo để tiến hành thí nghiệm 3 Hình 4.1 Mơ sẹo mơi trường có bổ sung IBA kết hợp với BA [1]: Mơi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.1 mg/l BA [2]: Mơi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.25 mg/l BA [3]: Mơi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA 0.5 mg/l BA Hình 4.2 Mơ sẹo mơi trường có bổ sung IBA kết hợp với Kinetine [1]: Mơi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.1 mg/l Kinetine [2]: Mơi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.25 mg/l Kinetine [3]: Mơi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA 0.5 mg/l Kinetine  Mơ sẹo đám tế bào khơng phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường tạo xáo trộn q trình tạo quan, SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 49 of 133 49 Header Page 50 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) Các tế bào thuộc mơ quan này, trừ tế bào mơ phân sinh, phải chịu phản phân hóa trước lần phân chia (Halperin, 1969) Sự phản phân hóa có vai trò quan trọng, cho phép tế bào trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa) Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả phân chia tạo phơi soma điều kiện thích hợp (Pierik, 1987) Các tế bào thuộc mơ quan phân hóa song tử diệp thường phản phân hóa tác động auxin riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin mơ sẹo Mơ sẹo tạo ngồi ngun nhân tế bào nhu mơ chịu phản phân hóa phân chia tế bào tượng tầng, xáo trộn mơ phân sinh sơ khởi hay xáo trộn q trình tạo quan (Hunault, 1979) Khi đặt mơi trường, mẫu cấy phồng ra, dày lên hấp thu nước, dinh dưỡng chất điều hòa sinh trưởng thực vật Có nhiều mơ quan thực vật sử dụng để làm vật liệu tạo mơ sẹo như: thân, lá, phát hoa, cuống lá, rễ,… (Street, 1969) ; thí nghiệm sử dụng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ, cấy vào mơi trường bổ sung auxin cytokinin mẫu cấy phồng chỗ phồng to dần tạo thành mơ sẹo Điều chứng minh Ochatt Caso (1986) người ta tạo mơ sẹo từ nhiều loại quan khác thể thực vật Tuy nhiên, với loại mơ hay quan thường phải sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại nồng độ khác tùy theo mức độ nhạy cảm tế bào mơ hay quan  Mơ sẹo phát sinh từ gân cuống sót lại sớm từ phần phiến gần đồng thời với phát sinh mơ sẹo từ thân cuống Điều hiểu gân có kiểu phân chia giống thân cuống (Bùi Trang Việt, 2000), mà thân, cuống (với mơ vỏ) có xu hướng tạo mơ sẹo mơ (Dương Cơng Kiên, 2003) Chọn mẫu cấy đốt thân mẫu đốt thân non, có xu hướng tạo mơ sẹo mơ lá, mơ hoa mười q nhỏ nên khó tạo mơ sẹo Cây non (ngun vẹn hay cắt đoạn)hay mảnh thân non SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 50 of 133 50 Header Page 51 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh trưởng thành dễ cho mơ sẹo điều kiện ni cấy in vitro, tác động auxin mạnh áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000) Nhờ thân non ‘Sorbone’ tồn lượng auxin nội sinh cao nên mơi trường khơng chứa chất điều hòa nào, mẫu cấy tạo mơ sẹo lên chồi  Sự phát triển mơ sẹo chia thành giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào phân hóa Ở giai đoạn phân chia, tế bào mơ cấy trở dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hóa Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mơ sẹo khác hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phơi Kết thí nghiệm cho thấy chất kích thích tăng trưởng nồng độ cảm ứng tạo mơ sẹo, nên sử dụng mơi trường ni cấy 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.1 mg/l BA 0.1 mg/l Kinetine mơi trường hình thành mơ sẹo mà lại tiết kiệm lượng chất kích thích điều hòa tăng trưởng thực vật Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần đơn vị thu sinh tạo mơ sẹo Sự phát sinh chồi Torenia tn theo ngun tắc tỉ lệ A/C: A/C cao kích thích tạo rễ, A/C tiến gần kích thích tạo mơ sẹo, từ mơ sẹo sau hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp kích thích tạo chồi trực tiếp Tỉ lệ A/C xác định tạo quan, tỉ lệ cao tạo chồi, tỉ lệ thấp tạo rễ (Skoog Tsui, 1948; Miller Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959) 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả tái sinh chồi từ dòng mơ sẹo khác  Mục đích thí nghiệm xem xét khả tái sinh chồi từ dòng mơ sẹo thu thí nghiệm từ tìm dòng mơ sẹo có khả cảm ứng lượng chồi nhiều phục vụ cho thí nghiệm  Hình thái mơ sẹo phụ thuộc nhiều vào loại nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật diện mơi trường ni cấy Qua số thí nghiệm, ghi nhận giữ ngun nồng độ loại auxin mơi trường SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 51 of 133 51 Header Page 52 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh ni cấy, thay đổi thành phần nồng độ cytokinin hình thái mơ sẹo thay đổi (Mehra Jaidka, 1985; Pal cộng sự, 1985; Shrikhande cộng sự, 1993) Ở thí nghiệm lượng auxin giữ ngun lượng cytokinin tăng (auxin/cytokinin = 1:5) có tạo chồi từ mơ sẹo Những mơ sẹo sau thành lập phát sinh chồi tác động cytokinin ngoại sinh Vì vậy, tổng số chồi tạo kết hai q trình phát sinh trực tiếp gián tiếp Tuy nhiên, hình thành chồi từ mơ sẹo khơng kéo dài hoạt tính cytokinin giảm theo thời gian Do đó, đến thời điểm đó, mơ sẹo chồi khơng phát sinh Lượng auxin nội sinh lúc có tác dụng lên q trình tạo rễ chủ yếu Sự dừng phát sinh chồi từ mơ sẹo sớm số lượng chiều dài rễ tạo lớn sử dụng cytokinin hoạt tính thấp  Khả tái sinh chồi dòng mơ sẹo ghi nhận trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng IBA kết hợp với BA Kinetine lên phát sinh chồi từ hai dạng mơ sẹo khác Nghiệm Mơi trường thức 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine Số chồi Chiều cao trung bình chồi TB (cm) 12a(*) 1.24b 9b 1.34a Ghi chú: (*) Trong cột, giá trị trung bình theo sau chữ khơng kí tự có khác biệt có ý nghĩa mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05  Tuy nhiên, xét mặt hình thái chồi mơi trường có chất điều hòa khác khác nhau.Trên mơi trường có bổ sung IBA BA, mơ sẹo tái sinh chồi, chồi khỏe, có thân màu hồng nhạt, chồi có màu trắng, chồi tươi, có màu xanh; mơi trường có bổ sung IBA SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 52 of 133 52 Header Page 53 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Kinetin, mơ sẹo có khả tái sinh chồi chồi yếu, có màu hồng nhạt, đầu chồi bị đen chồi chết dần từ xuống (Hình 4.3)  Cytokinin thuận lợi cho phân nhánh chồi non thân thảo Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin mơi trường ni cấy giai đoạn tạo chồi in vitro Nhóm cytokinin đẩy nhanh phân chia tế bào, nhân chồi phát triển chồi Các chồi tăng trưởng kích thích mạnh mẽ nồng độ cytokinin Từ nhiều nghiên cứu, người ta rút kết luận vai trò cytokinin ni cấy chồi: tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định, cản tạo rễ (nồng độ cytokinin cao từ 0.5 – 10 mg/l thường cản làm chậm tạo rễ, đồng thời cản tăng trưởng rễ cản hiệu kích thích tạo rễ auxin) Cytokinin nhóm hormon thực vật đặc biệt đóng vai trò chu trình tế bào ảnh hưởng đến nhiều q trình phát triển Srinivasan Mullin phát biểu cytokinin ngoại sinh hoạt hóa cytokinin nội sinh lên mạch mộc Sự thiếu hụt cytokinin thực vật làm xuất chồi bị lùn, đồng thời đỉnh sinh trưởng nhỏ lại, ti thể lạp thể kéo dài ra, tạo tế bào khoảng – 4% so với bình thường Ngồi ra, đỉnh sinh trưởng rễ phình to, phát triển nhanh có nhiều rễ nhánh Tất tượng cho thấy cytokinin yếu tố quan trọng thực vật giúp điều hòa hoạt động kiểm sốt phát sinh hình thái đỉnh sinh trưởng Qua thí nghiệm điều khiển hình thành quan từ đốt thân thuốc lá, Skoog thấy hoạt động cytokinin có ảnh hưởng đáng kể đến ribonucleic acid (RNA), ơng cho cytokinin điều hòa hình thành quan thơng qua việc ảnh hưởng đến sinh tổng hợp yếu tố sinh trưởng khác như: thiamin, auxin, ngồi cytokinin đóng vai trò chất điều hòa sinh tổng hợp protein Qua thấy tượng phổ biến sinh vât, xuất yếu tố làm thay đổi ngưỡng yếu tố khác Ảnh hưởng cytokinin mơ, quan ni cấy phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu ni cấy, lồi thực vật ni cấy mẫu SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 53 of 133 53 Header Page 54 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh cấy thu từ mơ non hay mơ trưởng thành BA kích thích tăng sinh chồi bên Castanea, kinetine khơng có ảnh hưởng cả, kinetine kích thích tạo chồi bên q trình ni cấy chồi Prunus để tăng sinh chồi cần sử dụng đến BA Qua kết cho thấy vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến phát sinh hình thái thực vật đáng kể khác lồi  Khơng tái sinh chồi thơng qua mơ sẹo mà tái sinh chồi trực tiếp từ quan như: lá, thân, cuống lá, chồi ngủ, đế hoa, lát mỏng tế bào,… Những chồi phát sinh từ mơ trưởng thành khơng liên quan đến mơ phân sinh gọi chồi bất định Về bản, quan thực vật có khả tái sinh mơ phân sinh chồi sinh quan trực tiếp hay gián tiếp Ở hạt kín, nguồn gốc chồi tế bào biểu bì, mơ hàng rào, mơ khuyết hay mơ bao quanh mạch mơ cấy Trước phân hố để tạo chồi tế bào phân hố phải tái hoạt động Sự tái hoạt động q trình phát sinh quan cần phải cảm ứng cách: gỡ hiệu ứng cản tương quan ngun, cắt chồi để gỡ ưu tính ngọn; dùng mơi trường thích hợp cho mơ cấy mơ in vitro  Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết cao sử dụng cytokinin nồng độ cao auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar cs., 2003) Kết ghi nhận nhiều đối tượng Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003) SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 54 of 133 54 Header Page 55 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Hình 4.3 Chồi tái sinh từ dòng mơ sẹo mơi trường khác [1]: Mơi trường có bổ sung IBA BA [2]: Mơi trường có bổ sung IBA Kinetine  Trong khởi đầu điều hồ tăng trưởng quan, chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò quan trọng Khi ni cấy mơi trường có cytokinin auxin phát triển chồi kích thích Cần có cân nồng độ loại hormone loại mơ, vị trí chun biệt Khi tỷ lệ cytokinin/auxin (C/A) cao kích thích tạo chồi; ngược lại tỷ lệ C/A thấp kích thích tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) dựa vào thí nghiệm nên thí nghiệm cấy mẫu mơi trường sử dụng 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.5 mg/l BA 0.5 mg/l Kinetine Sự phát sinh chồi Torenia tn theo ngun tắc tỉ lệ A/C: A/C cao: kích thích tạo rễ, A/C tiến gần 1: kích thích tạo mơ sẹo, từ mơ sẹo sau hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp Tỉ lệ A/C xác định tạo quan: tỉ lệ cao: tạo chồi, tỉ lệ thấp: tạo rễ (Skoog Tsui, 1948; Miller Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959) Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp quan trọng việc tạo chồi nhiều lồi thực vật khác Begonia (Ringe Nitsch, 1968; Heide, 1965), SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 55 of 133 55 Header Page 56 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh cải ốc biển (horse radish) (Wurm, 1960; Sastri, 1963), mao địa hồng (foxglove) (Dolfus Nicolas-Prat, 1969), Atropa belladonna (Zenkteler, 1971) bơng cải (Margara, 1969)  Ngồi ra, tái sinh chồi phụ thuộc vào tượng ưu hình thành mơ phân sinh bên để hình thành chồi bên dọc theo trục chồi Ưu tượng chồi đỉnh ức chế phát triển chồi bên nằm bên Trong điều kiện ni cấy in vitro, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến tăng trưởng phát triển chồi, ức chế mối tương quan chồi đỉnh chồi bên nằm chồi đỉnh Trong loại chất điều hồ tăng trưởng, auxin cytokinin sử dụng để điều hồ tượng ưu tính Theo mơ hình giải thích cổ điển thì: auxin tổng hợp ngọn, sau di chuyển libe (hữu cực) tế bào (vơ cực) đến quan cuối rễ Auxin điều hồ cách trực tiếp gián tiếp thơng qua chế khác bao gồm hoạt hố chất điều hồ thứ cấp, điều hồ tỷ lệ A/C Khi gia tăng hàm lượng cytokinin mơ tượng ưu tính bị phá vỡ bật chồi kích thích cytokinin; trái ngược với tác động auxin (Bùi Trang Việt, 2000) Áp dụng vào thí nghiệm sử dụng auxin (IBA) cytokinin (BA Kinetine)  BA loại cytokinin có hiệu cao cảm ứng tạo chồi nhiều lồi thực vật Các loại cytokinin khác (kinetine, 2i – P, PBA zeatin) sử dụng BA (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Kết thí nghiệm cho thấy kết hợp IBA BA cho số chồi nhiều, kết hợp IBA Kinetine cho số chồi chồi kéo dài thân Để phục vụ cho thí nghiệm cần số chồi để tiến hành tiếp nên tiếp tục khảo sát dải nồng độ khác IBA BA để đưa nồng độ thích hợp cho số chồi nhiều Hầu hết chứng nhu cầu cytokinin đặc biệt thực ni cấy chồi nhiều lồi thực vật khác Cytokinin hoạt hố phân chia tế bào cách kích thích tổng hợp mạnh mẽ acid nucleic, protein chất SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 56 of 133 56 Header Page 57 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh cần thiết cho q trình phân chia tế bào với điều kiện có auxin kết hợp Cytokinin tác động hai bước phân chia tế bào: phân nhân phân bào Cytokinin giúp gia tăng kích thước tế bào sinh tổng hợp protein, cytokinin cản kéo dài tế bào Ở giai đoạn gia tăng kích thước tế bào auxin có vai trò quan trọng, kích thích mạnh kéo dài tế bào diệp tiêu tế bào vùng kéo dài BA kích thích tăng sinh chồi bên Castanea (Vieitez, 1980) kinetine khơng có ảnh hưởng Zeatin có khuynh hướng kích thích tăng trưởng chồi làm tăng nhẹ nảy chồi bên Tương tự, 2-iP kinetine kích thích tạo chồi bên q trình ni cấy chồi Prunus; để tăng sinh chồi cần phải sử dụng đến BA (Martinelli, 1985) Ở thí nghiệm kết hợp IBA BA cho chồi tốt kết hợp IBA Kinetine  Quan sát hình thái số lượng chồi cho thấy mơi trường có bổ sung IBA BA cho số lượng chồi nhiều chồi tươi tốt, mơi trường có bổ sung IBA Kinetine chồi cao số lượng chồi chồi có xu hướng chết Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu tiếp mơi trường có bổ sung IBA BA để tái sinh chồi nhiều nồng độ khác để chọn nồng độ cho tỉ lệ chồi cao để tiến hành thí nghiệm 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng IBA BA lên khả tái sinh chồi từ mơ sẹo  Với mục đích tạo chồi bất đònh kết hợp auxin cytokinin cho kết tốt sử dụng cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999) Ở thí nghiệm sử dụng kết hợp IBA BA với nồng độ khác để tái sinh chồi từ mơ sẹo nhằm thu lượng chồi nhiều phục vụ cho thí nghiệm Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết cao sử dụng cytokinin nồng độ cao auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar cộng sự, 2003), kết ghi nhận nhiều đối tượng Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 57 of 133 57 Header Page 58 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003)  Kết sau tuần nghiên cứu khả bật chồi mơ sẹo mơi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA nhiều nồng độ khác trình bày bảng bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng IBA kết hợp với BA lên phát sinh chồi Mơi trường Số chồi trung bình C1 3.33b (*) C2 20.67ab C3 18b C4 22.33ab C5 20.0b C6 49.33a C7 24.33ab C8 22.67ab Ghi chú: (*) Trong cột, giá trị trung bình theo sau chữ khơng kí tự có khác biệt có ý nghĩa mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05  Trong hầu hết trường hợp, hình thành chồi, rễ từ mơ non dễ từ trưởng thành Tuổi mơ ảnh hưởng đến số lượng chồi hình thành kích thước chồi hay Mơ trẻ cho thấy nguồn mẫu tốt cho vài nghiên cứu Giai đoạn sinh lý mẹ ảnh hưởng đến hình thành chồi mơ ni cấy Các chất điều hòa kích thích hình thành chồi đáng kể tương tác khả tái sinh, tuổi mơ nồng độ chất điều hòa tăng trưởng tối ưu  Sự tạo chồi rễ từ mơ sẹo đòi hỏi cần phải có điều chỉnh lại nồng độ auxin cytokinin cảm ứng ban đầu Khi nồng độ cytokinin cao auxin có tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, nồng độ auxin cao cytokinin xử lý với auxin rễ hình thành Trong tạo rễ SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 58 of 133 58 Header Page 59 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh lượng cytokinin ngoại sinh chất cản Người ta cho auxin cảm ứng tạo rễ cảm ứng tổng hợp polyamine (Friedman cộng sự, 1985) Bởi tỉ lệ auxin cytokinin thí nghiệm có khác biệt rõ ràng để tạo mơ sẹo hay tạo chồi hay rễ từ mẫu cấy Hình 4.4 Chồi tái sinh mơi trường bổ sung IBA BA nồng độ khác [1]: Mơi trường C1 bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.25 mg/l BA [2]: Mơi trường C2 bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.5 mg/l BA [3]: Mơi trường C3bổ sung 0.1 mg/l IBA 0.75 mg/l BA [4]: Mơi trường C4 bổ sung 0.1 mg/l IBA 1.0 mg/l BA [5]: Mơi trường C5 bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.5 mg/l BA [6]: Mơi trường C6 bổ sung 0.25 mg/l IBA 0.75 mg/l BA [7]: Mơi trường C7 bổ sung 0.25 mg/l IBA 1.0 mg/l BA [8]: Mơi trường C8 bổ sung 0.25 mg/l IBA 1.25 mg/l BA  Quan sát hình thái số liệu cho thấy, cố định lượng IBA, thay đổi lượng BA tăng số chồi tăng đến mức định số chồi lại giảm dần, số chồi tăng lên chiều cao chồi lại giảm số chồi q nhiều chồi ko thể kéo dài thân Điều chứng minh Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên (2006), để kích thích tăng trưởng chồi bên làm SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 59 of 133 59 Header Page 60 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh giảm tượng ưu tính ni cấy chồi lồi rộng, người ta thường bổ sung vài loại cytokinin vào mơi trường ni cấy giai đoạn II Cách cảm ứng tăng trưởng vài chồi nhỏ từ mẫu cấy sau khoảng – tuần Nồng độ cytokinin q cao kích thích hình thành nhiều chồi nhỏ chồi khơng thể kéo dài Để kích thích tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy gián tiếp qua tạo mơ sẹo người ta thường phối hợp cytokinin với auxin (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006)  Ở mơi trường có bổ sung 0.25 mg/l IBA kết hợp với 0.75 mg/l BA cho số lượng chồi cao chiều cao chồi thấp số lượng chồi q nhiều Từ cho thấy chọn hai yếu tố số lượng chồi chiều cao chồi, muốn thu số lượng chồi nhiều khơng thể có chồi kéo dài thân  Khi nồng độ cytokinin cao auxin có tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, nồng độ auxin cao xử lý auxin rễ hình thành Trong tạo rễ lượng cytokinin ngoại sinh chất cản Khi phối hợp với auxin cytokinin kích thích phân chia tế bào điều khiển phát sinh hình thái Khi bổ sung vào mơi trường ni cấy chồi hợp chất phá vỡ trạng thái hưu miên chồi non kích thích hoạt động chồi bên Khi khơng có cytokinin mơi trường ni cấy kì chu trình tế bào bị kéo dài người ta cho cytokinin cần thiết điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào tăng trưởng phát triển tế bào Cytokinin có hiệu vai trò kích thích tạo chồi trực tiếp gián tiếp thực vật ngun vẹn mơ thực vật ni cấy in vitro Tác dụng cytokinin đơi trở nên hiệu phối hợp với auxin Trong thí nghiệm, việc kết hợp hai loại chất điều hòa cytokinin auxin cho kết làm tăng số lượng chồi hình thành Đặc biệt kết hợp IBA BA cho lượng chồi hình thành cao SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 60 of 133 60 Header Page 61 of 133 Đồ án tốt nghiệp  GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Sau có số lượng chồi nhiều, chúng tơi tiến hành tách cụm chồi lớn thành cụm nhỏ cấy chuyển sang mơi trường MS khơng bổ sung chất kích thích tăng trưởng để chồi kéo dài thân rễ thành Từ tiến hành nghiên cứu cấy chuyển sang mơi trường kích thích tượng nụ hoa ống nghiệm tiến hành giai đoạn đưa vườn trồng Hình 4.5 Cây hồn chỉnh có chồi rễ SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 61 of 133 61 Header Page 62 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Chương Kết luận – Đề nghị 5.1 Kết luận Nhân giống in vitro hoa mười cơng cụ giúp ích cho việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý cây, quy trình hoa khác với lồi khác ni cấy in vitro hoa tồn ngày với điều kiện hồn tồn khác ngồi tự nhiên Qua q trình làm thí nghiệm tơi rút số kết luận sau: Cơng việc tạo nguồn mẫu vơ trùng khó khăn ảnh hưởng nhiều yếu tố Dung dịch Javel 7% sử dụng thời gian phút điều kiện thích hợp để tạo nguồn mẫu vơ trùng Chỉ cần lượng auxin cytokinin thấp bổ sung vào mơi trường MS cho mẫu hoa mười cảm ứng tạo mơ sẹo Với tỉ lệ cytokinin cao lại cho chồi từ mẫu mơ sẹo cấy Với nồng độ chất kích thích tăng trưởng IBA BA cho số lượng chồi kích thước chồi khác Dựa vào mơi trường tạo chồi để phục vụ cho thí nghiệm nhân chồi, rễ, kéo dài thân, cho hoa ống nghiệm đem lại giá trị kinh tế cao 5.2 Đề nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm thiết bị sử dụng phòng thí nghiệm có hạn nên tơi xin đưa số đề nghị để nghiên cứu hồn thiện  Nghiên cứu thêm loại hóa chất khử trùng khác đưa mẫu từ bên ngồi vào  Nghiên cứu thêm mẫu cấy với loại mười có lớn  Khảo sát thêm ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng khác lên khả tái sinh mơ sẹo SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 62 of 133 62 Header Page 63 of 133 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh  Khảo sát thêm ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng khác lên khả tái sinh chồi  Nghiên cứu giai đoạn nhân chồi, cho rễ  Nghiên cứu cho tượng nụ hoa ống nghiệm  Đưa in vitro vườn ươm, theo dõi sinh trưởng hoa mười giai đoạn vườn ươm đến đạt tiêu chuẩn đem trồng để xem in vitro trồng ngồi tự nhiên khơng SVTH: Trần Thị Thu Hiền Footer Page 63 of 133 63 ... lá, củ, chồi hoa, túi phấn,…  Vai trò tuổi quan thực vật tạo mô sẹo Tuổi mảnh mô hay quan có ảnh hưởng lớn khả tạo mô sẹo Những mảnh quan trưởng thành thường khả tạo quan, khả tạo mô sẹo Ngược... tạo nên mô sẹo Mô sẹo hình thành tiếp tục phát triển qua lần cấy chuyền môi trường thích hợp 2.2.2 Vai trò loại quan, tuổi quan ánh sáng tạo mô sẹo Đa số mô quan thực vật có khả tạo mô sẹo tác... phân hóa Mô sẹo phát triển nhanh môi trường có diện auxin Khối mô sẹo có khả tái sinh thành hoàn chỉnh điều kiện môi trường chất kích thích tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo thực loại thực vật khả nhân