nghiên cứu khả năng tái sinhn chồi hoa mười giờ ( portulaca grandiflora ) qua trung gian mô sẹo

Khái niệm Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các cơ quan của thực vật trong ốngnghiệm có chứa môi trường dinh

Chương 1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc

dù là một loài cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng vàmàu sắc sặc sỡ mà loài cây này mới giúp tôn lên vẻ đẹp của những khu vườn haykhuôn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ

Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười

giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngoài, ở bên ngoài môitrường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh

nhưng khi tiến hành nuôi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là

khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ Đây là loài cây thân cónhiều lông nhỏ gây khó khăn trong việc tạo nguồn mẫu vô trùng Đó là những bướcnghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười giờ ra hoatrong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, cóthể kinh doanh được, không phải chăm sóc như hoa ngoài tự nhiên mà cây vẫn tươitốt Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở

rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại có tậptính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đó chính là điều đặc biệt củaloài cây này nhưng khi nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện không có oxy câyvẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều không dễ chút nào vì nóphá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đó là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở Đây là vấn

đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian

Là loài cây rất phổ biến và dễ trồng nên nó có giá trị kinh tế không cao khi

chưa tiến hành nuôi cấy in vitro Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của loài

cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất công dụngcùng với một số cây thuốc khác trong họ của nó như loài rau sam rất tốt cho sứckhỏe

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu khả năng nuôi cấy mô cây hoa mười giờ nhằm tạo nguồn mẫu vôtrùng ban đầu để cung cấp mẫu thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là ra hoa trongống nghiệm

1.2.2 Yêu cầu

Phải đưa được mẫu vào để tạo mẫu vô trùng, khảo sát mẫu ban đầu ở các môitrường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng

Chương 2: Tổng quan

2.1 Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống

2.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật

ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các cơ quan của thực vật trong ốngnghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin,đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng(Dương Công Kiên, 2002)

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan

từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người tadùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sựphân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và

mô trong quá trình nuôi cấy

Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh họcthực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nó là công cụnghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học Điều quan trọng nhất trong vi nhângiống là việc nghiên cứu vai trò và tác động của các chất điều hòa sinh trưởngthực vật nhằm kích thích sự hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ chocông tác nhân giống

Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống đã làm được một cuộccách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tớimục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại Vi nhângiống đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối vớinhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, câydược liệu, cây ăn trái và rau xanh Phương pháp này có những ưu điểm vượttrội so với phương pháp truyền thống:

Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau củacây (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) màngoài tự nhiên không thể thực hiện được.

Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn,trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại

Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền

Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnhnhư nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,…

Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện

tích rất nhỏ

Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm

Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn đực (cây măng tây) theomong muốn

Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen

Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đãđược đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểmcần phải được khắc phục:

Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao

Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cầnkhoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm

Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây contạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình

Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm nhất trong việc áp dụng kỹ thuật vi nhângiống vào sản xuất thương mại là giá thành sản phẩm tạo ra còn quá cao TheoKozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính của vấn đề này là sự thất thoát

do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của câytrong giai đoạn chuyển ra vườn ươm, giá nhân công lao động chiếm 60 – 70%

tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sangmôi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình nuôi cấy,…)

và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,…) còn khá cao Việc cấy chuyền lặp lạinhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khicòn làm tăng tính bất thường về di truyền của tế bào Tuy nhiên, hạn chếnghiêm trọng nhất trong kỹ thuật vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây consau khi chuyển ra vườn ươm thường rất thấp do sự khác biệt lớn giữa điều

kiện môi trường in vitro và ex vitro.

2.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy

đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sungchất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảngthời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi.Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh.Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phânhóa của các tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sựhiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trongđiều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năngnhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặctính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúcnhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bàosoma lại cao hơn

Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc

có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bàođơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối.Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khảnăng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn đượctách ra và trải trên môi trường thạch

- Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từngcụm tế bào mô sẹo

- Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khảnăng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Nuôi cấy protoplast – chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống

và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tếbào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật).Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dunghợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng.Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loàihay khác loài

Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành

mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

2.1.3 Những vấn đề trong nhân giống vô tính in vitro

- Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy.

- Loại mô cấy

- Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽxuất hiện cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài Số lần cấy chuyền ít và thờigian cấy chuyền giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị

Sự nhiễm mẫu

Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật Có thể giảm khả năng lại mẫu bằng cách:

- Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh

- Sử dụng các loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin,Vacomicin hoặc Penicillin với nồng độ phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy

Sự hóa thủy tinh thể

Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi

chuyển cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài.

Nguyên nhân là do cây in vitro có lớp sáp ở bên ngoài biểu bì mỏng, tế bào

chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận các phân tử nước, về cấu tạo khí khổngcủa cây thường có hình tròn thay vì hình elip như cây trong tự nhiên, khí khổng

mở suốt trong quá trình nuôi cấy và mật độ khí khổng cao Ngoài ra nhu mô thịt

lá và lớp mô bảo vệ mặt ngoài của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc,diệp lục ít so với các cây bình thường nên khi đưa cây ra môi trường ngoài vớiđiều kiện tự nhiên hoàn toàn khác, cây không thể thích nghi dẫn đến stress vàchết

Có một số phương pháp hạn chế quá trình hóa thủy tinh thể như sau:

- Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường

trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao Tuynhiên, điều này có thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sựhình thành chồi

- Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với môitrường cấy ít nhất

- Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA

- Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy

- Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánhsáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.

2.1.4 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnhvực như:

Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp(nuôi cấy tế bào trần)

Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cấy huyền phù tế bào)trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp

Chọn lọc tế bào có những đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành cây conthay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn)

Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn)

Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại

Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp

Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử

Nuôi cấy quang tự dưỡng

2.1.5 Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro cây thân thảo và cây thân gỗ

Các loài cây thân gỗ ít có khả năng tái sinh hơn các loài cây thân thảo

Các nghiên cứu nhân giống trên cây thân gỗ được bắt đầu trễ hơn so với câythân thảo

Việc cảm ứng sự trẻ hóa ở cây thân gỗ khó hơn ở cây thân thảo

Tốc độ nhân giống cây thân gỗ thấp hơn cây thân thảo

Tác động của trạng thái hưu miên trên sự tăng trưởng của chồi và sự kéo dàicủa thân cây thân gỗ theo từng thời kì trong năm

Cây thân gỗ dễ bị ảnh hưởng bởi các chất độc tiết ra trong môi trường nuôicấy

Mô của cây thân gỗ khó khử trùng hơn vì đại đa số mọc ở ngoài thiên nhiên

Cây thân gỗ và cây bụi thường được chọn lọc để nhân dòng sau khi cây đãtrưởng thành Ở giai đoạn này các mô của cây thường rất khó hoặc không thể

sử dụng được trong nhân giống in vitro

Sự đa dạng về mặt di truyền của cây thân gỗ lớn hơn so với cây nông nghiệp

và các loại cây thân thảo khác, do đó sau khi nhân giống sẽ thu được nhiều kếtquả khác nhau khó kiểm soát

Cây thân gỗ không thể trồng được trong nhà kính, vì vậy việc thu mẫu bị ảnhhưởng rất nhiều bởi điều kiện khí hậu và các điều kiện tăng trưởng khác

2.1.6 Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro và nhân giống in vivo

Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.

Có thể tạo được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô.

Sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn những cây được nhân giống vô tính in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa

và sạch bệnh

Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọc

các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý mẫucấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau docây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất

Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên

có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng

Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống

in vivo và giảm các chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các loại cây

cần được nhân giống trong nhà kính

Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn

dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanhnăm

Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân

giống kế tiếp

Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy

Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng

phương pháp nhân giống in vitro.

Những bất lợi của phương pháp nhân giống vô tính in vitro:

- Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy

- Tạo ra những cây không hoàn toàn đúng như mong muốn: mọc um tùm vìmột số cây còn giữ được khả năng trẻ hóa trong quá trình nuôi cấy

- Đặc biệt, đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện

Trong một số trường hợp, có những loại cây tạo được rễ in vitro nhưng những

rễ này không phù hợp do đó những cây này sẽ tạo mới rễ sau khi được chuyển

- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyền mô sẹo và huyềnphù tế bào được lặp lại nhiều lần

- Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện

- Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành

của cây tăng lên Hiện nay, các kỹ thuật hiện đại đang được tiến hành nhưtăng sinh tế bào trong các thiết bị lên men nhưng vẫn còn trong giai đoạn thínghiệm

2.1.7 Các bước nhân giống in vitro

Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy Để

tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi

sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, mùa vụ lấy mẫu, chất lượng củacây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu cấy đó Mẫu cấy sau khi chọn lựađược rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùnghóa học như calcium hypocloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủyngân,…

Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân

giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của

cây trồng Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thườngnhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo) Trong môi trườngnhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác

Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương phápnuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môitrường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợpvới quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá

trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và

được duy trì trong thời gian dài

Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn

bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ramôi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào

đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện

tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện

in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ

C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền Người ta thường bổ sung

auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.

Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặttrong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ ánh sáng thấp,… Saukhoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này cóthể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm Đây là giai đoạn rất quan trọngtrong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt

về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro Cây in vitro được nuôi cấy trong

điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển rađất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng

có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mấtnước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết Để tránh tình trạng này, vườn ươmcây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao Cây con thườngđược cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được

ẩm, trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá(thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy

mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễbằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độthấp để rút ngắn thời gian ra rễ

2.1.8 Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro

Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro là một quá trình phức tạp vì:

Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và nhữngmối tương quan mới được hình thành

Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:

Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa

tế bào)

Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành

cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra

Sự hình thành cơ quan

Sự phát triển cơ quan

Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố: nguồn mẫucấy ban đầu, sự tăng trưởng của mẫu cấy trong điều kiện nhà kính hay ngoàiđồng ruộng, vị trí của mẫu cấy trên cây, thời điểm lấy mẫu cấy, hàm lượnghormone nội sinh, kích thước mẫu cấy, phương pháp cấy, chất dinh dưỡng,chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện sinh lý, một số hợp chất được tiết ra trongquá trình nuôi cấy,…

Tất cả những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh rất phức tạp, chúng takhông thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý một số vấn đềsau:

Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau(môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,

Sự hình thành rễ bất định thườn đối lập với sự hình thành chồi bất định Nếu

cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiềuthiếu sót Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bấtđịnh trước sau đó cảm ứng tạo rễ

2.1.8.1 Sự hình thành chồi bất định

Sự hình thành chồi bất định được xem là một trong những phương pháp nhân

giống sinh dưỡng trong nuôi cấy mô Ngày nay một số loài như Saintpaulia,

Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lilium, Ferine đang được nhân giống

bằng phương pháp này

Có nhiều điểm giống nhau giữa sự hình thành chồi bất định và rễ bất định: cácnhân tố có ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành rễ bất định cũng thúc đẩy sựhình thành chồi bất định Điều này được thể hiện qua một số điểm sau:

Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các

bộ phận của cây con (Anonymous, 1984)

Đường đóng vai trò rất quan trọng trong sự hình thành chồi và rễ

Sự hình thành chồi hay rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic

Trong đa số trường hợp, ánh sáng thúc đẩy sự hình thành chồi bất định Tuynhiên một số loài cây cần điều kiện tối để hình thành chồi bất định: chồi hoa

Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), các mẫu cấy từ cuống hoa Nerine bowdemi (Pierik và Steegmans, 1985) Economou và Read (1986) cho rằng

các mẫu lá của Petunia hybrida tăng trưởng trên môi trường không có

cytokinin và được xử lý ánh sáng đỏ tạo ra nhiều chồi hơn những mẫu cấyđược xử lý ánh sáng đỏ xa Tuy nhiên trên môi trường có BA, các mẫu cấyđược xử lý ánh sáng đỏ và đỏ xa tạo ra số lượng chồi bằng nhau và nhiều hơncác mẫu cấy trên môi trường không có cytokinin

Nhiệt độ cao thường cần thiết cho sự hình thành chồi nhưng cũng có một số

trường hợp ngoại lệ đối với BegoniaI (Heide, 1965) và Streptocarpus

(Appelgren và Heide, 1972)

Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành chồi bất định rất phứctạp:

Một số cây không cần auxin hay cytokinin để hình thành chồi bất định như

Cardamine pratensis (Pierik và Segers, 1972), Streptocarpus (Appenlgren và

Heide, 1972) Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cytokinin và auxin đều

có ảnh hưởng đến quá trình tạo chồi

Hầu hết thực vật cần cytokinin để thúc đẩy tạo chồi trong khi auxin có tácdụng ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Nitsch, 1968)

Một số loài cần auxin ngoại sinh cho sự tạo chồi như Lilium (Aartrijk, 1984), Hyacinth (Pierik và Steegmans, 1975).

Nồng độ cytokinin/auxin cao rất quan trọng cho sự tạo chồi ở nhiều loài

thực vật khác nhau, ví dụ như ở loài Begonia (Heide, 1965), Súp lơ (Margara,

1969)

Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự táisinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin Tỉ lệ củahai chất điều hòa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog

và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953) Cytokinin BA rất hiệu quả trong việcthúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao

sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng)

Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽtăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1975; Nitsch và cộng sự, 1969).Trong một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm

ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây Thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948), Plumbago indica (Nitsch, 1968).

Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid

abscisic ức chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm

ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas.

2.1.8.2 Sự hình thành rễ bất định

Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô củachúng còn giữ khả năng phân sinh

Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót

của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyềnloài, tuổi của mẫu, vị trí mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương,

số lần cấy chuyền, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng,than hoạt tính, đường, agar, pH,…

2.1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro

2.1.9.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển in vitro:

Kiểu di truyền

Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thôngthường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khótái sinh (trừ khi chúng còn non) Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae,Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễtái sinh nhất Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các

giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có

thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy.Tuổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người tathường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già đi, khả năngtái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơnnhư trong trường hợp cây bụi Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác nhau về khả

năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro: Hedera

helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj và Pierik, 1974) và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974) Khi mô phân sinh và chồi

đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non

trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều lần cấy

chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và

phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus

vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica.

Tuổi của mô và cơ quan

Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứngnhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống lá còn nontái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơnnên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm Khả năng tái sinh của nhữngloài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa

còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974),

Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica (Coumans và

cộng sự, 1979)

Tình trạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế

bào in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ

tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ởgiai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản(Robb, 1957) Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông)

khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này

(vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển)

Vị trí của mẫu cấy trên cây

Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh

trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii,

ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát

triển trong môi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn

chồi nách Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hươngđược tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều này cũngxảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957) Điều đáng lưu ý là những mô sẹophát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như

rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.

Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng đểtăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rờikhỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích

thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứanhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi

trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ Đối với những mẫu bị cắt,

phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Ảnhhưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã đượcAartrijk (1984) chứng minh

Vết thương

Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự táisinh mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinhdưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn Ngoài

ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thường

Phương pháp cấy

Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau:

có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực(cắm phần ngọn xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanhkhi mẫu được cấy không cực (Pierik và Steegmans, 1975) Mẫu tái sinh tốtkhi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai tròquan trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khảnăng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường Như ở

trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974),

sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy khôngcực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy cócực

Ảnh hưởng của nguồn carbon dioxide và ánh sáng

Ở vùng lạnh, những thay đổi trong quá trình sinh trưởng của mẫu cấy xảy

ra suốt mùa đông có thể giải thích dựa trên những thay đổi bức xạ Khi giảm1% ánh sáng sẽ làm giảm 1% năng suất trong nhà kính nhưng mối tương quannày không đóng vai trò trong trường hợp với những cây con Điều kiện ánhsáng trong nhân giống những cây cấy ghép có thể đem lại nhiều lợi ích khôngchỉ trong giai đoạn vườn ươm mà còn có lợi sau khi trong bên ngoài

Ảnh hưởng của nhân tố khoáng

Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc nhiều vào loại câythí nghiệm Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi trường phổ biếnnhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được Tuy nhiên, cần lưu ý rằngdung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng

và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao Ví dụ cây

đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger, 1972).

Lloyd và McCown (1980) đã tìm ra một môi trường thích hợp cho một số loàithân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium)

Ảnh hưởng của pH

pH của môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh từ 5.5 – 6 pH dưới5.5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại quácứng pH của môi trường thường giảm từ 0.6 – 1.3 đơn vị sau khi hấp khửtrùng Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trườnggiảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong môi trường

Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0.1N và nhỏ từnggiọt vào trong môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo Luôn nhớ phảiđiều chỉnh pH trước khi thêm agar

2.1.9.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúngtrở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng nhưcác chất diệt cỏ dại

Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tếbào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh Trái lại các chất điềuhòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứngdụng trong thực tế

Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thườngxuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với cácthành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăngtrưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặcbiệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin Sự áp dụng loại vànồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của câymẹ: tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm

Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N.Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra(IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA; NAA; 2,4-D;…) IAAtổng hợp được sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó dễ bị biến tính trong môitrường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến ở trong mô Tuy nhiên những đặctính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA cùng với cytokinin saukhi cảm ứng sự hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàmlượng của nó trong mô giảm dần IAA thường được sử dụng phối hợp với cácchất điều hòa sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp.Tuy nhiên, tùy theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể sử dụng các hợpchất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi khác vớiauxin như: IBA, 2,4 – D, NAA 2,4 – D thường được sử dụng phối hợp vớicytokinin để cảm ứng sự tạo mô sẹo và huyền phù tế bào và nó sẽ được thaythế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái IBA và NAA làloại auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ

và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môitrường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng Nồng độ của IAA

có thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ

sung thêm, tốc độ phân hủy của auxin ở ngoài sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệttrong môi trường MS IBA ổn định trong môi trường hơn là IAA, mức độgiảm của IBA thấp Còn NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong môi trườngnuôi cấy Ngoài ra, còn có một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụngnhư: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram.

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộcvào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởngkhác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sựgia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bêntrong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiệnbằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu tráchnhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổnghợp ARN ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trìnhhình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự pháttriển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôicấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển củachúng Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở pháthoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phâncực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trongquá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzymeauxin - oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùngtổng hợp ra chúng

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (VõThị Bạch Mai, 2004)

Cytokinin

Cytokinin là một trong nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật.Cytokinin ít có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quảtrong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein.

Cytokinin được phát hiện sau auxin và gibberellin Người ta biết rằngtrong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợicho sự phân chia tế bào và hình thành chồi Cytokinin là các hợp chất adeninđược thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA,ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trongnuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP Các loại cytokinin tự nhiên nhưzeatin và IPA ít được sử dụng trong các thí nghiệm vì giá thành cao, chỉthường sử dụng Kinetine và BAP

Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diệncủa auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinincho phép tách rời nhiễm sắc thể

Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia củanhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào Khi cấychuyển mô sang môi trường mới có chứa cytokinin thì tế bào sẽ phân chia liêntục sau giai đoạn nghỉ Người ta còn cho rằng sự phân chia tế bào trong môsẹo xảy ra khi không có sự hiện diện của cytokinin trong môi trường nuôi cấy

là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nó

Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc

gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in

vitro Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp

với auxin Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sựphát sinh hình thái của mẫu cấy

Cytokinin cũng có khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làmgiảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng,người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy.Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ

nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặclàm cho chồi chứa nhiều nước.

Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua

sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh

mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cảnhoặc làm chậm sự tạo rễ Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin cũngcảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích sự tạothành rễ bất định khi không có sự hiện diện của auxin Trong hầu hết cáctrường hợp, chỉ có nồng độ cytokinin thấp là có hiệu quả

Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào môi trường nuôicấy để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi đặc biệt là những cây lárộng Tuy nhiên, cũng có vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinhphôi ở cây một lá mầm ví dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 µM đủ để ngăncản sự sinh phôi ở Dactylis glomerata Cytokinin nội sinh cũng có thể ngăncản sự tạo phôi ở một số loài thực vật

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóachống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa Cácchồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồingọn

Ảnh hưởng của cytokinin trên sự nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vàoloại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu cấyđược thu từ mô còn non hay mô đã trưởng thành

Trường hợp duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thìlàm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng có thể làm tăng hiệu quả của auxin.Hầu như sự tăng trưởng chồi không xảy ra ở 30oC

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tếbào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi

cho nuôi cấy in vitro.

2.1.9.3 Ảnh hưởng của vitamin lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Vitamin thường có chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme Vitaminđược xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật là thiamine (vitaminB1) Các vitamin khác như acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thểđược thêm vào môi trường nuôi cấy bởi chúng có thể tăng cường sự đáp ứngcủa tế bào

Các dung dịch vitamin được bảo quản tốt nhất trong tủ lạnh và dùng 10 mlcho 1 lít môi trường Các dung dịch vitamin sử dụng trong các thí nghiệm

Hiện nay, trong quá trình pha chế môi trường ta thường thêm các dung dịchvitamin vào môi trường trước khi hấp khử trùng Tuy nhiên, trong các nghiêncứu đặc biệt về vitamin thì ta nhận thấy rằng tốt nhất là nên lọc khử trùng cácdung dịch vitamin và sau đó thêm vào môi trường đã hấp khử trùng

2.1.9.4 Ảnh hưởng của đường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Khi được nuôi cấy in vitro, thường thì các tế bào thực vật không có khả năng

quang hợp và do đó nó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt độngbiến dưỡng của tế bào

Trong nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần) thì lượng đường sử dụngthường thấp, ngược lại trong nuôi cấy phôi và bao phấn thì dùng đường nhiềuhơn

Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phảnứng với các hợp chất amino Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng,thoái biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượngcao, ức chế sự phát triển của tế bào

2.1.10 Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô

Có thể nói, khó khăn lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy mô là phải tạo được thể

nhân giống in vitro vô trùng Có nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng,

trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệthống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôicấy.

Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễmchính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặcgiữa các lớp vảy chồi, mầm chồi Đối với một số loài thực vật được bao phủbên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây

là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngaytrong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùngthông thường để loại bỏ vi sinh vật được

Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng

Để tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thườngrửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với cácchất khử trùng, ngoài ra có thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạtđộng bề mặt Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng

3 – 5 lần

Một số chất khử trùng thường được sử dụng như:

Chlorur thủy ngân (HgCl2): đây là chất khử trùng rất hiệu quả, thườngdùng với lượng rất thấp từ 0.01% - 0.05%, chất này rất khó đào thải, vì vậycẩn thận khi tiếp xúc

Sodium hypochlorite NaOCl: có trong các dung dịch tẩy trắng 5 – 20%.Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3– 5 lần Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của

Nước oxy già (H2O2): là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ởnồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi

sử dụng Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc đối với mô thực vật, do đóphải rửa thật sạch

Khí Clo (Cl2): thường sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô

Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mô thựcvật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chấtnày

Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: những kháng sinh này cótác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy Dung dịch khángsinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy.Sodium dichloroiso cyanurate (dichloroiso cyanuric acid sodium salt)(NADCC): chất này ít độc đối với mô thực vật, vốn rất dễ tổn thương bởiCa(OCl)2 và NaOCl, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vô trùng sau khi

xử lý bằng chất này

Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán củaviện Plant Cell Technology (Washington DC.) và được quảng cáo là :”… cókhả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuôi cấy mô thực vật” Cũng

đã có những thử nghiệm và khẳng định công dụng diệt trùng của chất nàynhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật

Nói chung việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn và nồng độ chất khử trùngthấp mà vẫn thu được mẫu cấy sạch là điều rất quan trọng, vì các chất khửtrùng có thể phá hủy mô của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương CôngKiên, 2002)

2.2 Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan thực vật

Kỹ thuật tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầunhững năm 1930, là một trong những phương pháp đầu tiên của kỹ thuật nuôi cấy

mô trong nhiều năm

Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan

đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật,…) Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bàocủa mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên Sựphản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trởlại trạng thái trẻ (trẻ hóa) Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạophôi soma trong điều kiện thích hợp

Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệpthường phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp với mộtcytokinin) để cho ra mô sẹo Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bàonhu mô chịu sự phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáotrộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan

2.2.1 Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ

quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro

Ở các cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối loạn tổ chức của sinh mô ngọn

rễ, làm chậm sự kéo dài rễ Ở thân, auxin kích thích hoạt động của tượng tầng và cóthể cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô vỏ trong, libe 1 và libe 2, cáctia tủy và tủy để tạo nên những vùng mô phân sinh rộng lớn, còn các tế bào vỏ ngoài

và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà không phân chia Tuy nhiên, ở nồng độthích hợp auxin có thể dẫn tới sự tạo những điểm dinh dưỡng mà trong phần lớn cáctrường hợp chúng có thể trở thành mô phân sinh rễ, trong vài trường hợp khác thì là

mô phân sinh chồi Nhìn chung người ta xác nhận sự tạo mô sẹo in vitro nhờ áp dụng

auxin có thể do ba quá trình khác nhau: sự phản phân hóa của vài tế bào nhu mô, sựkích thích hoạt động của các mô phân sinh cấp 2 và sự xáo trộn của các mô phânsinh cấp 1, đặc biệt là các mô phân sinh rễ của các cây con

Tạo mô sẹo từ sự phản phân hóa của vài tế bào nhu mô

Tế bào nhu mô vỏ của thân song tử diệp có thể tạo ra mô sẹo, nhưngthường nhất là các tế bào nhu mô ở sâu bên trong: các tế bào nhu mô của mộc

và libe, các tế bào tiết và các tế bào nhu mô tủy Auxin riêng rẽ không đủ kích

thích sự phân chia của các tế bào nhu mô tủy được cô lập từ vài loại cây màphải dùng phối hợp với một cytokinin để kích thích sự phân chia này Những

tế bào được tạo ra sẽ hợp thành một vùng nhu mô phân sinh, ở giữa vùng nhu

mô này các tế bào phân chia theo mọi hướng và biểu lộ những đặc tính tế bàohọc của các tế bào ở tầng phát sinh Đây có thể là nơi xảy ra hiện tượng táiphân hóa để tạo các mô dẫn truyền hay phản phân hóa dẫn đến sự thành lậpnhững điểm sinh trưởng của thân hay rễ

Tạo mô sẹo từ sự phân chia của các tế bào tượng tầng

Các tế bào tượng tầng của song tử diệp không cần phải qua giai đoạn phảnphân hóa trong quá trình tạo mô sẹo khi có sự hiện diện của auxin trong môitrường nuôi cấy Các tế bào tượng tầng của phần nhiều song tử diệp có thểphân chia trong điều kiện hoàn toàn thiếu auxin ngoại sinh, nhất là đối với cáctrường hợp của các loài cỏ hay dây leo

Tạo mô sẹo từ các xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi

Dù ở đơn tử diệp hay song tử diệp, các mô sinh rễ của những cơ quantrưởng thành có tập tính giống như các mô ở cây mầm Trong thực nghiệm,các xử lý với auxin thường không được áp dụng đối với các rễ cô lập, nhưnglại xử lý trên các cây mầm nguyên vẹn để tạo nên những khối u lớn ở mức cổ

rễ Các khối u này phát triển chủ yếu từ các sơ khởi rễ Các rễ bị biến dạngcũng thường được thấy trong quá trình kích thích tiềm năng sinh rễ của trụ hạdiệp rễ sơ cấp Mặt khác, ở các song tử diệp, rễ thường cho những tổ chức

hình thái thứ cấp rất phát triển như các rễ củ Trong điều kiện nuôi cấy in

vitro, các rễ mới được thành lập, được nuôi cấy liên tục với môi trường có

chứa auxin, các rễ này dính với nhau và có thể tạo nên một mô sẹo Mô sẹođược hình thành sẽ tiếp tục phát triển qua các lần cấy chuyền trên những môitrường thích hợp

2.2.2 Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo

Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo dưới một tácđộng thích hợp nào đó và chỉ có rất ít cơ quan thực vật không thể hiện khả năng này

Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý,sinh hóa và kiểu gen Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạngthái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoạisinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy.

Vai trò của loại cơ quan thực vật thường được sử dụng để tạo mô sẹo

Có thể tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thểthực vật Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng cácchất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theomức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó Các mô và các cơquan khác nhau của một thực vật có thể được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹonhư: rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn,…

Vai trò của tuổi cơ quan thực vật trong sự tạo mô sẹo

Tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khảnăng tạo mô sẹo Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khảnăng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo Ngược lại, câynon hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹotrên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin

Vai trò của ánh sáng trong quá trình tạo mô sẹo

Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời giantạo mô sẹo Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơnngoài sáng, đặc biệt đối với mẫu cấy là lá Ví dụ:

Các trường hợp tạo mô sẹo trong tối như: Lá khoai tây, Lá Vitis

rupestris,…

Các trường hợp tạo mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng như: Lá cây

thuốc lá Nicotiana tabacum, mô củ khoai tây,…

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong thu nhận mô sẹo

Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo Trong môi trường nuôicấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sựphân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phátsinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào Khi nồng độ auxin thấp thì

sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễnhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo.

Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thay đổi khác nhautùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tửdiệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải

có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin Ví dụ:

Sự tạo mô sẹo từ lá Solanum melongena xảy ra trên môi trường có bổ

sung nhiều loại auxin khác nhau như: NAA; 2,4 – D; 2,4,5 – T ở các nồng độthay đổi từ 0.1 – 10 mg/l

Tử diệp cây mầm Azadirachta indica A cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l

và BAP 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo

Lá của Solanum tuberosum L cần có sự phối hợp giữa 2,4 – D 3,0

mg/l; NAA 1,0 mg/l và Kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mô sẹo

Vai trò của auxin trong tăng trưởng của mô sẹo: mô sẹo sau khi hình thànhnếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinhnhanh, nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡngnhưng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo xảy ra rấtchậm Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng nhưnồng độ của auxin

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong phát sinh hình thái

mô sẹo: hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độcủa các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôicấy Qua các thí nghiệm ghi nhận được nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxintrong môi trường nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokininthì hình thái mô sẹo thay đổi Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện củaBAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màunâu và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở

và thường không có khả năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sựtạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt vàchắc

2.2.3 Tạo mô sẹo từ lá song tử diệp

Trong quá trình tạo mô sẹo từ lá song tử diệp, mô sẹo xuất hiện trước hết là ở

vị trí vết cắt, kế đến xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá, hay dọc theo hệthống mạch Mô sẹo ít được tạo ra ở vị trí ngọn lá mà thường ở đó chỉ có sự phânhóa rễ, sự phân hóa rễ cũng xảy ra ở vị trí cuống lá để ngăn chặn sự lão suy củalá

2.2.4 Môi trường nuôi cấy mô sẹo

Sự đáp ứng của những mẫu cấy, việc cung cấp tất cả các nguyên tố khác ởmức độ tối thích phụ thuộc phần lớn vào nồng độ auxin và cytokinin Sự đápứng của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vậtnội sinh và ngoại sinh Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì môsẹo gồm IAA (10-10 ÷ 10-5M) và NAA (10-10 ÷ 10-5M) Một vài mô không thểtạo được mô sẹo khi chỉ có tác dụng của auxin mà đòi hỏi cả sự có mặt củacytokinin

Để duy trì mô sẹo đòi hỏi cần phải có sự hiện diện của các amino acid khácnhau trong môi trường nuôi cấy Các amino acid thường được sử dụng trongmôi trường nuôi cấy là glycine, arginine hoặc hỗn hợp các amino acid nhưtrong casein hydrolysate

Mô sẹo thường tăng trưởng trong môi trường đặc còn môi trường lỏng thì đôikhi cũng được sử dụng Trước đây, người ta đã làm nhiều thí nghiệm tạo môsẹo trên môi trường đặc có agar, gelatine hoặc silicagen Hiện tại có nhữngdạng xác định của acrylamide gel được dùng để làm đặc môi trường Agar làchất làm đặc môi trường thông dụng nhất và được sử dụng với nồng độ 8 ÷ 10g/l Một thuận tiện khi sử dụng agar để làm đặc môi trường là khi cho vàotrong nước thì nó trở thành dạng gel, sẽ lỏng ra ở 100oC và đặc lại ở 45oC.Đặc điểm này giúp cho môi trường agar ổn định trong điều kiện nhiệt độ nuôicấy mẫu Hơn nữa agar không phản ứng với các chất hiện diện trong môitrường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzyme