Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và bảo quản hạt nhân tạo in vitro cây lan gấm (anoectochilus lylei rolfe ex downie)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CHẾ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CHẾ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 Mã học viên 58CH258 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ-ĐHNT ngày 27/3/2018 Quyết định thành lập hội đồng: 1140/QĐ-ĐHNT ngày 10/9/2019 Ngày bảo vệ: 27/9/2019 Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN XUÂN HUYÊN TS PHẠM THI MINH THU Chủ tịch Hội Đồng: PGS TS NGUYỄN VĂN DUY Phịng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HỊA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn: “Nghiên cứu khả tái sinh chồi bảo quản hạt nhân tạo in vitro lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie)” cơng trình nghiên cứu thân tơi Phịng Công nghệ thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, hướng dẫn TS Phan Xuân Huyên TS Phạm Thị Minh Thu, chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Đà Lạt, tháng 10 năm 2019 Tác giả Chế Văn Dũng iii LỜI CẢM ƠN Trước hết xin gửi lời trân trọng cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang; Khoa sau Đại học – Trường Đại học Nha Trang; Lãnh đạo Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại học Nha Trang quan tâm giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu thực nghiệm tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học tự hào học thạc sỹ ngành Công nghệ Sinh học Đại học Nha Trang Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun; Phịng Cơng nghệ thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên tạo điều kiện cho nghiên cứu thực nghiệm phịng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật để hoàn thành kết luận văn; đặc biệt cho tơi xin trân trọng bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Phan Xuân Huyên TS Phạm Thị Minh Thu tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt trình thực đề cương, thực nội dung thực nghiệm để hoàn thành luận văn Qua đây, xin gửi lời trân trọng cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm đề tài cấp tỉnh, với tên đề tài: “Ứng dụng Công nghệ Sinh học nhân giống Lan gấm (Anoectochilus spp.) địa bàn tỉnh Đắk Lắk” tạo điều kiện kinh phí, hóa chất thiết bị khác liên quan đến trình nghiên cứu thực nghiệm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất bạn bè, động nghiệp giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Lạt, tháng 10 năm 2019 Tác giả Chế Văn Dũng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU CỦA LUẬN VĂN x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu hạt nhân tạo .3 1.1.1 Tổng quan hạt nhân tạo 1.1.2 Sự nảy mầm hạt nhân tạo 1.1.3 Ứng dụng hạt nhân tạo 1.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hạt nhân tạo 1.2 Giới thiệu lan gấm .14 1.2.1 Vị trí phân loại 14 1.2.2 Nguồn gốc phân bố .14 1.2.3 Đặc điểm hình thái 15 1.2.4 Đặc điểm sinh thái .16 1.3 Công dụng y dược lan gấm 16 1.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống lan gấm giới 19 1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống lan gấm nước 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 v 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Môi trường thực thí nghiệm .22 2.2.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 25 2.2.3 Phương pháp xác định tiêu cần nghiên cứu 32 2.3 Xử lý số liệu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Ảnh hưởng giá thể đến tái sinh chồi hạt nhân tạo .34 3.2 Ảnh hưởng mơi trường rắn có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 36 3.2.1 Ảnh hưởng Benzyl Adenin 36 3.2.2 Ảnh hưởng Kinetin 39 3.2.3 Ảnh hưởng Thidiazuron 42 3.3 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến tái sinh chồi hạt nhân tạo .44 3.4 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 40C 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận .51 4.2 Kiến nghị .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid BA : 6-Benzyl Adenin BAP/BA : Benzyl adenine purin CCC : Cycocel IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid ISSP : Inter simple sequence repeat ½ MS : Môi trường MS mà thành phần giảm nửa MS : Môi trường Murashige Skoog, 1962 NAA : Acid α-naphtaleneacetic PLB : Protocorm-like-body RADP : Random amplified DNA polymorphism TDZ : Thidiazuron tRNA : Transport RNA (ARN vận chuyển) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Số liệu pha chế môi trường nuôi cấy 23 Bảng 2.2 Ảnh hưởng giá thể đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 27 Bảng 2.3 Ảnh hưởng Benzyl Adenin đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 28 Bảng 2.4 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 29 Bảng 2.5 Ảnh hưởng Thidiazuron đến tái sinh chồi hạt nhân tạo .30 Bảng 2.6 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 31 Bảng 2.7 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo 32 Bảng 3.1 Ảnh hưởng giá thể đến tái sinh chồi 34 Bảng 3.2 Ảnh hưởng Benzyl Adenin đến tái sinh chồi 36 Bảng 3.3 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi .39 Bảng 3.4 Ảnh hưởng Thidiazuron đến tái sinh chồi .42 Bảng 3.5 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến tái sinh chồi 45 Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo 47 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hạt nhân tạo điển hình Hình 1.2 Cơ chế trình tự vỡ hạt nhân tạo Hình 1.3 Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie 14 Hình 2.1 Tạo vật liệu hạt nhân tạo đốt thân lan gấm 22 Hình 2.2 Hạt nhân tạo mang chồi ngủ đốt thân lan gấm hồn chỉnh 25 Hình 3.1 Ảnh hưởng giá thể đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 35 Hình 3.2 Ảnh hưởng Benzyl Adenin đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 39 Hình 3.3 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 42 Hình 3.4 Ảnh hưởng Thidiazuron lên tái sinh chồi hạt nhân tạo 44 Hình 3.5 Ảnh hưởng mơi trường lỏng đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 47 Hình 3.6 Ảnh hưởng mơi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối 4OC sau tháng 49 Hình 3.7 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối 4OC sau 12 tháng 49 Hình 3.8 Sự sinh trưởng chồi hạt nhân tạo chuyển từ điều kiện bảo quản tối, 4OC điều kiện cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC 50 ix TRÍCH YẾU CỦA LUẬN VĂN Lan gấm lồi dược liệu q cơng dụng số hợp chất lồi lan gấm hỗ trợ điều trị ung thư, chữa bệnh đái tháo đường, làm giảm mỡ máu, bảo vệ gan…, lồi dược liệu q nên có giá trị kinh tế cao Do lan gấm tự nhiên bị khai thác cách triệt để qua hoạt động thu hái nhiều để bán làm thuốc, dẫn đến nguy tuyệt chủng cao khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Vì vậy, việc bảo tồn nguồn gen q lan gấm vấn đề cấp thiết biện pháp tạo hạt nhân tạo Đề tài thực nhằm đánh giá khả tái sinh chồi bảo quản hạt nhân tạo in vitro lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie) Phương pháp sử dụng tạo hạt nhân tạo từ đốt thân mang chồi ngủ tách từ lan gấm nuôi cấy in vitro khảo sát khả nẩy mầm hạt môi trường khác khả bảo quản hạt điều kiện tối, nhiệt độ mát Kết cho thấy khả tái sinh chồi hạt nhân tạo lan gấm tốt trên: giá thể agar không bổ sung dinh dưỡng; môi trường MS rắn có bổ sung 1,0 mg/l BA; mơi trường nước Sử dụng môi trường nước với điều kiện tối, 4C bảo quản hạt nhân tạo tới 12 tháng với tỉ lệ nảy mầm 100% Nghiên cứu cung cấp kết Việt Nam mơi trường thích hợp cho việc bảo quản tái sinh chồi hạt nhân tạo lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie), tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo; góp phần bảo tồn, bảo quản nguồn gen dược liệu quý in vitro phát triển lan gấm, dễ dàng thuận tiện việc vận chuyển, trao đổi giống quốc tế, làm nguồn nguyên liệu chiếu xạ gây đột biến tạo giống Từ khóa: lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie), tái sinh chồi, bảo quản hạt nhân tạo, in vitro, BA, agar, môi trường lỏng x Về tái sinh chồi, tất thí nghiệm tái sinh chồi/hạt, nhiên thí nghiệm mồi trường trạng thái lỏng nên chồi chuyển sang màu nâu vàng có biểu chết Hình thái chồi thí nghiệm 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3 giống Về chiều cao chồi, thí nghiệm 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3 trạng thái rắn, chiều cao chồi thí nghiệm 3.2.2; 3.2.3 tương dương nhau, thí nghiệm chồi cao chồi thấp Điều giải thích, ngẫu nhiên hạt nhân tạo thí nghiệm tái sinh sinh trưởng tăng Ở thí nghiệm trạng tháng lỏng không phù hợp đến tái sinh sinh trưởng nên chiều cao chồi Về tỷ lệ nảy mầm, thí nghiệm 3.2.1; 3.2.2; 3.2.3 trạng thái rắn, tỷ lệ nảy mầm hạt thí nghiệm tương dương nhau, thí nghiệm tỷ lệ nảy mầm hạt cao Điều giải thích, ngẫu nhiên hạt nhân tạo thí nghiệm có tỷ lệ nảy mầm Ở thí nghiệm trạng tháng lỏng không phù hợp đến tái sinh sinh trưởng nên tỷ lệ nảy mầm hạt thấp Đốt thân mang chồi ngủ lan gấm đốt thân gần chồi đỉnh nên thường đốt thân phát sinh chồi Theo Đỗ Mạnh Cường cộng (2015) nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lên trình sinh trưởng phát triển lan gấm kim tuyến (Anoectochilus cetaceus Blume) đốt thân xa gốc khả hooc mơn tham gia vào trình tái sinh chồi lan gấm Vì thí nghiệm Đỗ Mạnh Cường cộng (2015) chủ yếu dùng đốt thân lan gấm kim tuyến đốt thân thứ từ gốc lên đỉnh chồi thân Số chồi tái sinh hạt nhân tạo môi trường nước, ½ MS MS có khác biệt, môi trường nước, hạt nhân tạo tái sinh chồi nhiều (1,40 chồi/hạt), mơi trường ½ MS hạt tái sinh chồi thấp (1,2 chồi/hạt) môi trưởng MS hạt tái sinh chồi thấp (1 chồi/hạt) Hình thái chồi hạt nhân tạo mơi trường nước có màu xanh (Hình 3.5a) Chồi hạt mơi trường ½ MS chưa có màu xanh nhạt, số hạt khơng nảy chồi có màu nâu có biểu hạt bị chết (Hình 3.5b) Chồi hạt mơi trường MS chưa có màu trắng nhạt, đa số hạt khơng nảy chồi, có màu nâu có biểu hạt bị chết (Hình 3.5c) Hiện chưa thấy công bố nghiên cứu môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng chồi hạt nhân tạo lan gấm, đối tượng trồng khác có cơng bố Kết nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu 46 Trần Văn Thịnh cộng (2015) nghiên cứu nảy mầm tái sinh chồi hạt nhân tạo đảng sâm môi trường nước, kết 100% hạt nảy mầm sau 20 ngày gieo hạt Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Cao Đình Hùng cộng (2013) tiến hành nghiên cứu nảy mầm hạt nhân tạo hóa cúc môi trường lỏng nước, kết cho thấy, 100% hạt nảy mầm sau 30 ngày gieo hạt Như vậy, môi trường nước tốt đến nảy mầm sinh trưởng chồi hạt nhân tạo lan gấm Hình 3.5 Ảnh hưởng mơi trường lỏng đến tái sinh chồi hạt nhân tạo (a; b; c tương ứng với mơi trường: nước; ½ MS; MS) 3.4 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 40C Khả bảo quản hạt nhân tạo đốt thân lan gấm điều kiện tối, 4OC sau thời gian bảo quản tháng 12 đem điều kiện phịng thí nghiệm thể Bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo Môi trường bảo quản Nước 1/2 MS lỏng MS lỏng MS rắn MS + mg/l BA Sau tháng bảo quản Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%) 100 33,33 ± 0,26 0 47 Sau 12 tháng bảo quản Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%) 100 0 0 Hạt sau tháng bảo quản môi trường nước điều kiện tối, 4OC chuyển sang điều kiện có cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC sau 60 ngày Tỉ lệ mẫu sống môi trường nước đạt 100%, mơi trường ½ MS đạt 33,33%, tất hạt mơi trường MS lỏng, MS rắn MS bổ sung mg/l BA chết Điều giải thích, mơi trường giàu khoáng đa vi lượng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng khơng phù hợp đến bảo quản hạt nhân tạo lan gấm Ở môi trường bảo quản nước ½ MS chưa thấy hạt nảy mầm, điều cho thấy nhiệt độ thấp (4OC) làm chậm trình nảy mầm hạt, điều kiện gieo hạt bình thường (cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC) hạt nảy mầm sinh trưởng chồi sau 60 ngày Sau tháng bảo quản, màu sắc môi trường nước thay đổi, mơi trường lỏng ½ MS MS chuyển màu nâu tím, hạt mơi trường khác chuyển màu nâu chết (Hình 3.6) Hạt sau 12 tháng bảo quản môi trường nước điều kiện tối, 4OC chuyển sang điều kiện có cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC, kết cho thấy, tỉ lệ mẫu sống môi trường nước đạt 100% có thân chồi cứng (Hình 3.8), tất hạt mơi trường ½ MS lỏng, MS lỏng, MS rắn, MS bổ sung BA điều chết Điều cho thấy, mơi trường có bổ sung khống đa vi lượng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng khơng phù hợp đến bảo quản hạt nhân tạo lan gấm Việc bảo quản hạt nhân tạo giống trồng có ý nghĩa thực tiễn sản xuất, vận chuyển, trao đổi giống Vì vậy, giới có nhiều cơng bố nghiên cứu bảo quản hạt nhân tạo nhiệt độ thấp, theo Ghosh Sen (1994) công bố nghiên cứu bảo quản hạt nhân tạo Asparagus cooperi Baker với tỷ lệ 8,3% hạt nảy mầm sau 90 ngày bảo quản ở 2OC; Bustam cộng (2013) nghiên cứu bảo quản hạt nhân tạo Dendrobium shavin White nhiệt độ 4OC 10OC thời gian 75 ngày, trì tỷ lệ sống 80 – 92% Hạt nhân tạo Catharanthus reseus L sau 30 ngày bảo quản 4OC có 81% hạt nảy mầm sau 10 tuần bảo quản hạt trì sức sống (Maqsood cộng sự, 2012) Như vậy, hạt nhân tạo đốt thân lan gấm bảo quản kéo dài 12 tháng môi trường nước điều kiện tối, 4OC chồi hạt sinh trưởng tốt chuyển từ điều kiện bảo quản tối, 4OC điều kiện cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC 48 Hình 3.6 Ảnh hưởng mơi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối 4OC sau tháng (a; b; c; d; e: Tương ứng với khả sống nảy mầm hạt nhân tạo bảo quản môi trường nước; ½ MS; MS; MS rắn; MS + 1mgBA) Hình 3.7 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối 4OC sau 12 tháng (a; b; c; d; e: Tương ứng với khả sống nảy mầm hạt nhân tạo bảo quản mơi trường nước; ½ MS; MS; MS rắn; MS + 1mg/l) 49 Hình 3.8 Sự sinh trưởng chồi hạt nhân tạo chuyển từ điều kiện bảo quản tối, 4OC điều kiện cường độ ánh sáng 34 µmol/m2/s, nhiệt độ 25±2OC 50 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dựa vào kết thu từ thí nghiệm trên, kết luận rút sau: Trong loại giá thể khảo sát agar tốt cho khả tái sinh chồi hạt nhân tạo: 93,33% hạt nảy chồi, số lượng 4,7 chồi/hạt, chồi cao 1,96 cm sau 60 ngày gieo hạt Môi trường MS rắn bổ sung mg/l BA thích hợp đến khả tái sinh chồi hạt nhân tạo: 93,33% hạt nảy chồi, số lượng 4,8 chồi/hạt, đạt chiều cao 2,11 cm sau 60 ngày gieo hạt Trong mơi trường lỏng mơi trường nước thích hợp đến khả tái sinh chồi hạt nhân tạo: 100% hạt nảy chồi với số lượng 1,4 chồi/hạt, đạt chiều cao 1,41 cm sau 60 ngày gieo hạt Môi trường tốt để bảo quản hạt nhân tạo kiện kiện tối, 4OC bảo quản nước Hạt tái sinh chồi 100% sau 12 tháng bảo quản 4.2 Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường nước có bổ sung nhóm chất kích thích sinh trường thực vật thuộc nhóm cytokinin tới khả tái sinh chồi hạt nhân tạo lan gấm - Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí đốt thân mang chồi ngủ lan gấm tới khả tái sinh chồi hạt nhân tạo - Nghiên cứu khả sinh trưởng Lan gấm nảy mầm từ hạt nhân tạo điều kiện vườn ươm 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Khoa học Công nghệ (2007) Sách đỏ Việt Nam - Phần thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Hà Nội Chính phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2006) Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Võ Văn Chi (1997) Từ điển Cây thuốc Việt Nam NXB Y học Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhựt, Nguyên Thị Kim Ly (2014) Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu lên trình sinh trưởng phát triển lan hài hồng (paphiopedilum delenatii) Tạp chí Khoa học Phát triển, 6(2) 112-121 Đỗ Mạnh Cường, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Hồng Hoàng, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Xuân Tuấn, Trần Hiếu, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Thị Kim Loan, Dương Tấn Nhựt (2015) Ảnh hưởng số yếu tố lên trình sinh trưởng phát triển lan gấm kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(3) 337-344 Nguyễn Thị Thanh Hiền, Mai Thị Ngọc Hương, Trần Ngọc Thủy Tiên, Phan Xuân Huyên, Dương Tấn Nhựt Ðỗ Năng Vịnh (2003) Bước đầu nghiên cứu việc tạo hạt nhân tạo ứng dụng nhân giống vơ tính bảo quản hoa địa lan, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội 935-938 Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt Nam, III, NXB TP Hồ Chí Minh Cao Đình Hùng, Phan Xn Huyên, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Nguyễn Trí Minh Đinh Văn Khiêm (2013) Nghiên cứu sản xuất hạt nhân tạo hoa cúc Đóa vàng (Chrysanthenum morifolium Ramat), Đề tài nghiên cứu khoa học cấp sở, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Phan Xuân Huyên (2017) Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15(3) 515-524 10 Phan Xuân Huyên, Nguyễn Văn Kết, Phan Hoàng Đại, Nguyễn Thị Cúc (2016) Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) điều kiện ex vitro, Tạp chí Khoa học Đại học Đà Lạt, 6(4) 481-492 52 11 Phan Xuân Huyên, Trần Văn Thịnh, Cao Đình Hùng (2014) Bước đầu nghiên cứu khả tái sinh bảo quản hạt nhân tạo đảng sâm (Codonopsis javanica Blume), Kỷ yếu Hội nghị Khoa học lần thứ – Hội Sinh lý thực vật Việt Nam, NXB Đại học Nông nghiệp 286-294 12 Phan Xuân Huyên, Vũ Thị Hà (2015) Nghiên cứu nhân giống nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies), Tạp chí Khoa học trường Đại học Tây Nguyên, 20 68-74 13 Phan Xuân Huyên (2017) Đề tài “Nghiên cứu nuôi trồng Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) thương phẩm kỹ thuật thủy canh Đà Lạt - Lâm Đồng”, Mã số đề tài: VAST02.04/16-17 14 Phan Xuân Huyên (2018) Nghiên cứu nhân giống in vitro ảnh hưởng phân bón đến sinh trưởng lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) Lâm Đồng, Hội thảo khoa học Sinh học – Nông nghiệp, Đại học Đà Lạt 15 Phan Xuân Huyên, Nguyễn Văn Kết, Phan Hoàng Đại, Nguyễn Thị Cúc (2016) Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng ex vitro Lan gấm (Anoectochilus lylei rolfe ex downies), Hội thảo khoa học Sinh học – Nông nghiệp, Đại học Đà Lạt 16 Phan Xuân Huyên, Trần Thị Hoàn Anh, Nguyễn Thị Phượng Hoàng, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Đinh Văn Khiêm, Hoàng Văn Cương (2018) Nhân giống in vitro ảnh hưởng phân bón đến sinh trưởng lan gấm Lâm Đồng, Tạp chí Dược liệu, 23 52-59 (thống format, có ghi “tập” hay khơng? Dấu – hay -?) 17 Phan Xuân Huyên, Phạm Thị Thanh Hải, Nguyễn Văn Duy, Phan Minh Hiển, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Nguyễn Thị Phượng Hoàng, Đinh Văn Khiêm (2018) Nghiên cứu nuôi trồng xác định hoạt chất kinsenoside loài lan gấm Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie phân bố Đắk Lắk, Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học tồn quốc 2018 1532-1538 18 Trần Cơng Khanh (2011) Cây sói rừng lan kim tuyến, Tạp chí thuốc sức khỏe, 431(3) ISSN 1859-1922 19 Trần Thị Ngọc Lan, Hoàng Văn Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Du Sanh, Dương Tấn Nhựt (2011) Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo địa lan (Cymbidium madrit Forest king) phục vụ công tác nhân giống bảo quản, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 9(4) 465-474 53 20 Đỗ Tất Lợi (2013), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức 811-813 21 Vũ Quốc Luận, Trần Đình Phương, Trần Cơng Luận, Dương Tấn Nhựt (2015) Vi nhân giống định tính hoạt chất β-sitosterol lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4) 1113-1125 22 Vũ Quốc Luận, Trần Đình Phương, Trần Công Luận (2015) Nghiên cứu khả tạo rễ tái sinh chồi từ đốt thân loài A.setaceus Blume mơi trường rắn 23 Phan Xn Bình Minh, Phạm Hương Sơn, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Vân (2015) Nghiên cứu bảo tồn phát triển loài A Lylei, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội 695-699 24 Trần Văn Minh (2005), Đề tài “Ứng dụng công nghệ phôi soma hạt nhân tạo nhân nhanh Trầm Hương Teak”, Viện Sinh học Nhiệt Đới, Mã số: KC04.19 42-45 25 Phí Thị Cẩm Miện (2012) Nhân nhanh in vitro loài Lan Anoectochilus Setaceus Blume Luận văn Thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội 26 Dương Tấn Nhựt (2011) Công nghệ Sinh học Thực vật: Nghiên cứu ứng dụng, tập 1, Nhà xuất Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 27 Dương Tấn Nhựt, Trần Ngọc Thủy Tiên, Mai Thị Ngọc Hương, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phan Xuân Huyên, Bùi Văn Lệ Ðỗ Năng Vịnh (2004) Một số nghiên cứu hạt nhân tạo hoa Lily (Lilium spp), Tạp chí cơng nghệ sinh học, (3) 359-370 28 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Tuyền, Nguyễn Duy, Mai Xuân Phán (2007) Tái sinh bảo quản hạt nhân tạo lan hồ điệp (Phalaenoois amabilis), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(1) 85-95 29 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành (2010) Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl), Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 26 248-253 30 Trương Thị Bích Phượng, Phan Ngọc Khoa (2013) Nhân giống in vitro lan kim tuyến (Anoetochilus roxburghii (Wall.) Lind), Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 79(1) 41-46 54 31 Nguyễn Quang Thạch Phí Thị Cẩm Miện (2012) Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quí, Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(4) 579-603 32 Trần Văn Thịnh, Phan Xuân Huyên, Cao Đình Hùng (2015) Ứng dụng hạt nhân tạo nhân giống in vitro bảo quản đảng sâm (Codonopsis javanica Blume) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 11(1) 83-91 33 Trần Thị Hồng Thúy, Đỗ Thị Gấm, Nguyễn Khắc Hưng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2015) Nghiên cứu nhân nhanh in vitro lồi lan kim tuyến (Anoecchilus setaceus Blume) thơng qua cảm ứng tạo protocorm like bodies, Tạp chí Sinh học, 37(1) 67-83 34 Lê Ngọc Triệu, Lê Tiến Thành, Khuất Hữu Trung Lê Huy Hàm (2011) Ảnh hưởng xạ tia X, tia Gamma chùm tia Proton đến khả sống phát sinh số đột biến kiểu hình hoa cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat), Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, 14 16-21 Tài liệu tiếng nước 35 Ahmad AN, Ali EAM, Rizkalla AA (2007) Synthetic seeds of pear (Pyrus communis L.) Rootstock storage in vitro Australian Journal of Basic and Applipe Sciences, 262- 270 36 Anand Y, Bansal YK (2002) Synthetic Seeds: Novel Aapproach of in vitro plantlet formation in Vasaka (Adhotada vasica Nees) Plant Biotechnology 19(3) 159-162 37 Andlib A, Verma RN, Batra A (2011) Synthetic seeds an alternative source for quick regeneration of a zero calorie herb - Stevia rebaudiana Bertoni Journal of Pharmacy Research, 2007-2009 38 Ballester A, Janeiro LV, Vieitez AM (1997) Cold storage of shoot cultures and alginate encapsulation of shoot tips of Camellia japonica L and Camellia reticulata Lindley Scientia Horticulturae, 71 67-78 39 Bustam S, Sinniah UR, Kadir MA, Zaman FQ, Subramaniam S (2013) Selection of optimal stage for protocorm-like bodies and production of artificial seeds for direct regeneration on different media and short term storage of Dendrobium shavin White Plant Growth Regul, 9(3) 215-224 55 40 Chang HT (2007) New cultivation methyods for Anoectochilus formosanus Hayata Orchid Science and Biotechnology, 1(2) 56-60 41 Cheng SF, Chang DCN (2009) Growth responses and changes of active components as influenced by elevations and orchid mycorrhizae on Anoectochilus formosanus Hayata Botanical Studies, 50 459-466 42 Chow HT, Hsieh WC, Chang CS (1982) In vitro propagation of Anoectochilus formosanus J Sci Eng, 19 155-166 43 Devendra BN, Srinivas N, Naik GR (2011) Direct somatic embryogenesis and synthetic seed production from Tylophora indica (Burm.f.) Merrill An endangered, medicinally important plant International Journal of Botany, 216-222 44 Du XM, Sun NY, Irino N, Shoyama Y (2000) Glycosidic constituents from in vitro Anoectochilus formosanus Hayata Chem Pharm Bull, 48(11) 1803-1804 45 Du XM, Sun NY, Tamura T, Mohri A, Sugiura M, Yoshizawa T, Irino N, Hayashi J, Shoyama Y (2001) Higher yielding isolation of Kinsenoside in Anoectochilus and its anti-hyerliposis effect Biol Pharm Bull, 24 65-69 46 Du XM, Irino N, Uto T, Morinaga O, Shoyama Y (2008) Micropropagation of Anoectochilus formosanus Hayata in vitro and pharmacological and chemical investigations, Phytochemistry, 79-87 47 Gangaprasad A, Latha PG, Seeni S (2000) Micropropagation of terrestrial orchids, Anoectochilus sikkimensis and Anoectochilus regalis Indian J Exp biol, 38(2) 149-154 48 Gangopadhyay G, Bandyopadhyay T, Poddar R, Gangopadhyay SB, Mukherjee KK (2005) Encapsulation of pineapple microshoots in alginate beads for temporary storage, Current Science, 88 972-976 49 Ghosh B, Sen S (1994) Plant regeneration from alginate encapsulated somatic embryos of Asparagus cooperi Baker, Plant Cell Rep, 13 381-385 50 Giri CC, Reddy GM (1994) Alginate encapsulation technique for indica rice protoplast culture and plant regeneration, Current Science, 67 542-545 51 Ho CK, Chang SH, Chen ZZ (1987) Tissue culture and acclimatization in Anoectochilus formosanus Hayata Bull Taiwan For Res Inst, 83-105 56 52 Hung CD, Trueman ST (2011) Alginate encapsulation of shoot tips and nodal segments for short-term storage and distribution of the eucalypt Corymbia torelliana × C citriodora, Acta Physiologiae Plantarum, 34(1) 117-128 53 Hung CD, Trueman ST (2011) Encapsulation technology for short-term preservation and germplasm distribution of the African mahogany Khaya senegalensis, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 107(3) 397-405 54 Huyen PX, Hien TD (2015) Effect of culture media on in vitro germination rate and shoot-forming potential of Condonopsis javanica (Blume) Hook f & Thomson artificial seeds 55 Hsieh (1994) A rapid quantitative H NMR analysis of kinsenoside and other bioactive principles from: Anoectochilus formosanus, Anal Methods, 8(28) 5645-5650 56 Ipekci Z, Gozukirmizi N (2003) Direct somatic embryogenesis and synthetic seed production from Paulownia elongata, Plant Cell Reports, 22 16-24 57 Janeiro LV, Ballester A, Vieitez AM (1997) In vitro response of encapsulated somatic embryos of Camellia, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 51 119-125 58 Ket NV, Hahn EJ, Park SY, Chakrabarty D, Paek KY (2004) Micropropagation of an endangered orchid Anoectochilus formosanus”, Biologia Plantarum, 48 (3) 339-344 59 Lata H, Chandra S, Khan IA, Elsohly, Ma (2009) Propagation through alginate encapsulation of axillary buds of Cannabis sativa L an important medicinal plant, Physiology and Molecular Biology of Plants, 15 79-86 60 Lata H, Chandra S, Natascha T, Khan IA, ElSohly MA (2011) Molecular analysis of genetic fidelity in Cannabis sativa L plants grown from synthetic (encapsulated) seeds following in vitro storage, Biotechnology Lettes, 33 2503-2508 61 Lin CC, Huang PC, Lin JM (2000) Antioxidant and Hepatoprotective Effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum, Am J Chin Med, 28 (1) 87-96 62 Lin ZL, Liu Q, Xiao B, Zhou J, Zhang JG, Li Y (2013) The vascular protective properties of kinsenoside isolated from Anoectochilus roxburghii under high glucose condition, Fitoterapia, 86 163-170 63 Ma XM, Wu CF, Wang GR (2011) Application of artificial seeds in rapid multiplication of Pseudostellaria heterophylla African journal of Biotechnology, 10(70) 15744-15748 57 64 Maqsood M, Mujib A, Siddiqui ZH (2012) Synthetic seed development and conversion to plantlet in Catharanthus roseus (L.) G Don, Biotechnology, 11 37-43 65 Matsumoto K, Hirao C, Teixeira J (1995) In vitro growth of encapsulated shoot tips in Banana (Musa Sp.), Acta Horticulturae, 370 13-20 66 Mukunthakumar S, Mathur J (1992) Artificial seed production in the male bamboo Dendrocalamus strictus L, Plant science, 87(1) 109-113 67 Murashige, Skoog (1962) A Revised Medium for Rapid Growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Plant Physiol, 15 (3) 473–497 68 Ket NV (2003) Effect of Environmental Conditions on In vitro and Ex vitro Growth of Jewel Orchid (Anoectochilus formosanus Hayata) PhD Thesis of Philosophy in Agriculre, The Gra duate School of Chungbuk National University, Korea 69 Nhut DT, Tien TNT, Huong MTN, Hien NTT, Huyen PX, Luan VQ, and Silva JAT (2005) Artificial seeds for propagation and preservation of Cymbidium, Propag Ornament Plant, 5(2) 67-73 70 Nower AA (2014) In vitro Propagation and Synthetic Seeds Production: An Effcient Methods for Stevia rebaudiana Bertoni, Journal of Forest Research, 16(1) 100-108 71 Paek KY (2005) Application of bioreactors for large-scale micropropagation systems of platns, In Vitro Cell Deve, Biol, 37 149-157 72 Pandey DM, Yu KW, Wu RZ, Hahn EJ, Paek KY (2006) Effects of different irradiances on the photosynthetic process during ex vitro acclimation of Anoectochilus plantlets Hotosynthetica, 44(3) 419-424 73 Ravi D, Anand P (2012) Production and Applications of Artificial seeds, International Research Journal of Biological Sciences, 1(5) 74-78 74 Ray A, Bhattacharya S (2008) Storage and plant regeneration from encapsulated shoot tips of Rauvolfia serpentinea– an effective way of conservation and mass propagation, South African Journal of Botany, 74 776-779 75 Reddy (2012) Synthetic seeds: a review in agriculture and forestry, African journal of Biotechnology, 11(78) 14254-14275 76 Redenbaugh K cộng (1986) Somatic seed: encapsulation of asexual plant embryo Biotechnology 58 77 Redenbaugh K, Janick J, KimY H, Kitto S, Saranga Y (1993) Desiccation Synthetic Seed, In Synseed, CRC Press, Inc, Boca Raton 11-33 78 Remya M, Bai VN, Mutharaian VN (2013) In vitro regeneration of Aristolochia tagala and production of artificial seeds, Biologia Plantarum, 57(2) 210-218 79 Rihan HZ, Issawi MA, Burchett S, Fuller MP (2012) Artificial Seed Production from Encapsulated Microshoots of Cauliflower (Brassica oleraceae var botrytis 6th International Symposium on Brassica and 18th Crucifer Genetic Workshop - Catania (Italy) 413-425 80 Roy B, Mandal A (2008) Development of synthetic seeds involving androgenic and pro-embryos in elite Indica rice, Indian Journal of Biotechnology, 515-519 81 Shiau YJ, Sagare AP, Chen UC, Yang SR, Tsay HS (2002) Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross-pollination and in vitro culture of seeds Bot Bull Acad Sin, 43 123-130 82 Shiau YJ, Sagare AP, Chen UC, Yang SR, Tsay HS (2002) Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross-pollination and in vitro culture of seeds, Bot Bull Acad Sin, 43 123-130 83 Shih CC, Wu YW, Lin WC (2005) Aqueous extract of Anoectochilus formosanus attenuate hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats, Phytomedicine, 12(6-7) 453-460 84 Singh AK, Sharma M, Varshney R, Agarwal SS, Bansal KC (2006) Plant regeneration from alginate encapsulated shoot tips of Phyllanthus amarus Schum and Thom A medicinally important plant species, In vitro Cell and Developmental Biology Plant, 42 109-113 85 Singh AK, Chand S (2010) Plant regeneration from alginate-encapsulated somatic embryos of Dalbergia sissoo Roxb, Indian Journal of Biotechnology, 319-324 86 Siong PK, Nohajer S (2012) Production of encapsulated in vitro micro shoots of cauliflower, Brassica oleracea var Botrytis Romanian Biotechnological Letters, 17(4) 87 Suprasanna P, Ganapathi TR, Rao PS (1996) Artificial seeds in rice (Oryzia sativa L.): Encapsulation of somatic embryos from mature embryo callus culture Asia Pacific Journal Moleculer Biology Biotechnology, 90-93 59 88 Taha RM, Mahmad N, Yaacob JS, Abdullah N, Mohajer S (2013) Synthetic seeds production and pegeneration of Oxalis triangularis for mass propagation and conservation International Journal of Environmental Science and Development, 4(5) 461-464 89 Tai KS (1987) In vitro propagation of Anoectochilus formosanus (Hayata) J Agric Asso China, 137 42-54 90 Utomo HS, Wenefrida I, Croughan TP (2001) Smooth cordgrass synthetic seeds: production, storage and potential use for coastal erosion controls TurfGrass Trends 12-15 91 Vdovitchenko MY, Kuzovkina IN (2011) Artificial seed preparation as the efficient method for storage and production of healthy cultured roots of medicinal plants Russian Journal of Plant Physiology, 58(3) 524-530 92 Wu (2007) The hepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilus formosanus PhytotherRes, 21 58-61 93 Wu (2010) A Standardized Aqueous Extract of Anoectochilus formosanus Ameliorated Thioacetamide-Induced Liver Fibrosis in Mice: The Role of Kupffer Cells Biosci Biotechnol Biochem, 74(4) 781-787 94 Wu RZ, Baque MA, Paek KY (2010) Establishment of a large-scale micropropagation system for Anoectochilus formosanus in bioreactors Acta Hort, 878 167-173 95 Yoon YJ, Murthy HN, Hahn EJ, Paek KY (2007) Biomass production of Anoectochilus formosanus Hayata in a bioreactor system J Plant Biol, 50(5) 573-576 96 Zych M, Furmanowa M, Krajewska-patan A, Lowicka A, Dreger M, Mendlewska S (2005) Micropropagation of Rhodiola kirilowii plants using encapsulated axillary buds and callus Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 47 83-87 Nguồn từ internet 97 https://www.google.com/patents/CN103976053A?cl=en (20/4/2018) 98 https://www.google.com/patents/CN103947787A?cl=en (15/7/2018) 99 http://www.academicjournals.org/AJB (03/02/2019) 100 http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/mycorrh.htm (20/5/2019) 101.http://botit.botany.wisc.edu:16080/courses/mpp/OrchidMyco116.htm (15/7/2019) 60 ... ? ?Nghiên cứu khả tái sinh chồi bảo quản hạt nhân tạo in vitro lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie)? ?? Mục đích nghiên cứu Đánh giá khả tái sinh chồi bảo quản hạt nhân tạo in vitro lan gấm. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CHẾ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie) LUẬN VĂN... hưởng giá thể đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 35 Hình 3.2 Ảnh hưởng Benzyl Adenin đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 39 Hình 3.3 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi hạt nhân tạo 42 Hình 3.4