bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20
Mẫu đốt thân hoa mười giờ sau khi được khử trùng sơ bộ bên ngồi dưới vịi nước chảy và nước rửa chén sunlight pha lỗng sẽ được đưa vào tủ cấy để tiến hành khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung vài giọt Tween 20 với các khoảng thời gian khác nhau.
Mẫu đốt thân sau khi khử trùng sẽ được cắt bỏ hai đầu của đốt thân cĩ màu trắng đục do tác dụng của chất khử trùng, sau đĩ cắt từng đoạn ngắn khoảng 0.5cm và cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA. Tỉ lệ mẫu nhiễm được ghi nhận sau 1 tuần nuơi cấy và trình bày trong bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) 5 7 10 15 10.4c (*) 4.2b 0a 0a 0a 35.4b 43.75c 68.75d 89.6a 60.4b 56.25b 31.25c
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05.
Từ bảng kết quả cho thấy thời gian khử trùng ở 5 phút thì tỉ lệ mẫu bị nhiễm cao (10,4%) so với các khoảng thời gian khác nhưng mẫu khơng bị chết. Ở thời gian 10 và 15 phút thì tỉ lệ mẫu chết lại cao (tương ứng là 43,75% và 68,75%), ở 15 phút mẫu chết khá nhiều vì để mẫu lâu trong dung dịch Javel
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 45
7% thì mẫu cấy bị tổn thương và dẫn đến chết mẫu cấy sau đĩ. Do đĩ thời gian khử trùng tốt nhất đối với mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ là 5 phút với Javel 7% cĩ bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween 20.
Khi tiến hành nuơi cấy mơ thực vật thì vấn đề quan trọng nhất là phải tạo được nguồn mẫu ban đầu đảm bảo vơ trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ đảm bảo vơ trùng và vẫn cĩ khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm tiếp theo. Cĩ rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng trong quá trình nuơi cấy như từ mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy. Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin rất thích hợp cho các lồi nấm và vi khuẩn phát triển, tốc độ phát triển của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật nên rất dễ nhiễm nấm hay vi khuẩn và tốc độ lan truyền rất nhanh gây ảnh hưởng lớn đến mẫu hoặc thường gây chết mẫu. Nếu nhiễm vi khuẩn thì sẽ thấy trên bề mặt lớp mơi trường cĩ một lớp màng mỏng cĩ màu trắng đục, màu vàng, hồng, cam,… Những loại vi khuẩn thường gặp ở
mơ thực vật là: Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas,… Nếu
nhiễm nấm thì thường thấy một lớp dày trên bề mặt lớp mơi trường cĩ màu xanh, nâu, xám, trắng, đen,… Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mơ và mơi trường cấy thì đây là nhiễm do mơ cấy. Nếu sự nhiễm đi từ một điểm bất kỳ nào đĩ trong mơi trường thì nguồn nhiễm cĩ thể do khơng khí hoặc sự khử trùng mơi trường khơng tốt hoặc do nhiễm từ khơng khí xung quanh. (Dương Cơng Kiên, 2002).
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khĩ vì mẫu sống khơng thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà mẫu phải giữ được bản chất sinh học của nĩ. Do đĩ, mẫu cấy phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng như: Hypoclorite calcium Ca(OCl)2, Hypochlorite sodium NaOCl, Clorur thủy ngân HgCl2, H2O2,… Ở đây sử dụng dung dịch Javel 7% (Hypochlorite sodium). Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá hủy sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hiệu lực của các chất
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 46
khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mơ cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mơ cấy và cĩ độc tính thấp đối với mơ cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì ta cĩ thể thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mơ thực vật do vậy bề mặt tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá hủy lớp màng phospholipid, phân hủy lipid và acid béo, hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hĩa ức chế khơng thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hơ hấp của tế bào vi sinh vật.
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hịa IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo
Tác động của các chất điều hịa tăng trưởng thực vật được ghi nhận sau 4 tuần nuơi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2 và 4.3
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh mơ sẹo
Mơi trường Trọng lượng mơ sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l BA 0.4752b (*)
0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l BA 1.0160b
0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 1.6637a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 47
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo
Mơi trường Trọng lượng mơ sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l Kinetine 0.0953b (*)
0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l Kinetine 0.0963b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 0.1608a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05.
Các mẫu cấy trong mơi trường MS khơng bổ sung chất kích thích tăng trưởng thì mẫu cấy chỉ kéo dài ra sau đĩ đen dần và chết.
Các loại auxin và cytokinin khác nhau cĩ tương tác khác nhau. Do đĩ, ảnh hưởng của chúng lên mẫu cấy cũng khác nhau. Trong mơi trường MS cĩ bổ sung thêm IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine dù ở nồng độ nào thì vẫn hình thành mơ sẹo nhưng loại cytokinin khác nhau thì cho loại mơ sẹo khác nhau. Nếu là IBA kết hợp với BA thì hình thành loại mơ sẹo đặc, cĩ màu trắng vàng và nâu nhạt, xốp bơng, mơ sẹo phát triển nhanh. Cịn IBA kết hợp với Kinetine thì hình thành loại mơ sẹo cứng, cĩ màu nâu đen, ít hoặc ko xốp, mơ sẹo phát triển chậm. Điều này cũng được chứng minh bởi Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong mơi trường nuơi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mơ sẹo thay đổi. Tốc độ tăng trưởng của mơ sẹo phụ thuộc vào thành phần, cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martnez, 1995; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo mơ sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mơ sẹo cĩ dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992).
Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự tạo mơ sẹo (Ahloowalia, 1991; Komamin và cộng sự, 1992; Liu và cộng sự, 1993; Zimmerman, 1993). Trong mơi trường nuơi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mơ và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mơ sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 48
ra sự phát sinh phơi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ khơng cĩ sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mơ sẹo (Torres, 1989). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhĩm song tử diệp khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo trong mơi trường chỉ cĩ auxin mà cần phải cĩ một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Đối với cây hoa mười giờ cũng là cây thuộc nhĩm song tử diệp nên mơi trường nuơi cấy cĩ sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là rất cần thiết cho cây để tạo mơ sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu
trên tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0.5 mg/l và BA 1.0 mg/l để cĩ thể tạo mơ sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần cĩ sự
phối hợp giữa 2,4-D 3.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và kinetine 0.2 mg/l cho sự tạo mơ sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Cĩ một số cơng trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey,1977 trên mơ rễ cây đậu nành, ghi nhận cĩ sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu mơi trường chỉ cĩ auxin thì hàm lượng DNA được ghi nhận là khơng thay đổi.
Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mơ sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như khơng tác động trên mơ phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuơi cấy, nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hồng Anh, 2000).
Khả năng tạo mơ sẹo của mơ và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hĩa và kiểu gen (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mơ sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong mơi trường nuơi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985). Do vậy, việc chọn lựa ở cơ quan để tiến hành cấy vơ mẫu ban đầu là rất quan trọng, ở thí nghiệm này mẫu cấy được
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 49
chọn là những đốt thân cịn non ở cây tươi, khỏe, kết quả thu được sau khi vơ mẫu là mơ sẹo để tiến hành thí nghiệm 3.
Hình 4.1. Mơ sẹo ở mơi trường cĩ bổ sung IBA kết hợp với BA
[1]: Mơi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA [2]: Mơi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [3]: Mơi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA
Hình 4.2. Mơ sẹo ở mơi trường cĩ bổ sung IBA kết hợp với Kinetine [1]: Mơi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l Kinetine
[2]: Mơi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l Kinetine [3]: Mơi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l Kinetine
Mơ sẹo là một đám tế bào khơng phân hĩa, cĩ đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là
1 2 3
3 2
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 50
trong sự tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000). Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mơ phân sinh, phải chịu một sự phản phân hĩa trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Sự phản phân hĩa cĩ vai trị rất quan trọng, nĩ cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hĩa). Sự trẻ hĩa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phơi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987).Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan đã phân hĩa của các cây song tử diệp thường phản phân hĩa dưới tác động của auxin riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin để cho ra mơ sẹo. Mơ sẹo được tạo ra ngồi nguyên nhân do các tế bào nhu mơ chịu sự phản phân hĩa cịn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mơ phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979). Khi đặt trong mơi trường, các mẫu cấy sẽ phồng ra, dày lên do sự hấp thu nước, dinh dưỡng và các chất điều hịa sinh trưởng thực vật. Cĩ rất nhiều mơ và cơ quan thực vật cĩ thể được sử dụng để làm vật liệu tạo mơ sẹo như: thân, lá, phát hoa, cuống lá, rễ,… (Street, 1969) ; ở thí nghiệm này sử dụng mẫu cấy là đốt thân hoa mười giờ, khi cấy vào mơi trường đã bổ sung auxin và cytokinin thì mẫu cấy phồng ra và chỗ phồng đĩ to dần tạo thành mơ sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Ochatt và Caso (1986) người ta cĩ thể tạo được mơ sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên, với mỗi loại mơ hay cơ quan thường phải sử dụng các chất điều hịa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mơ hay cơ quan đĩ.
Mơ sẹo phát sinh từ gân và cuống cịn sĩt lại trên lá sớm hơn từ phần phiến lá gần như đồng thời với sự phát sinh mơ sẹo từ thân và cuống. Điều này cĩ thể hiểu là do gân cĩ kiểu phân chia giống như thân và cuống (Bùi Trang Việt, 2000), mà thân, cuống (với mơ vỏ) cĩ xu hướng tạo mơ sẹo hơn mơ lá (Dương Cơng Kiên, 2003). Chọn mẫu cấy là đốt thân vì mẫu đốt thân non, cĩ xu hướng tạo mơ sẹo hơn mơ lá, mơ lá hoa mười giờ quá nhỏ nên khĩ tạo mơ sẹo. Cây non (nguyên vẹn hay được cắt đoạn)hay mảnh thân non của cây
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 51
trưởng thành dễ cho mơ sẹo trong điều kiện nuơi cấy in vitro, dưới tác động
của một auxin mạnh được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000). Nhờ vậy trong thân non ‘Sorbone’ cĩ thể tồn tại một lượng auxin nội sinh khá cao nên khi mơi trường khơng chứa bất kì chất điều hịa nào, các mẫu cấy vẫn cĩ thể tạo mơ sẹo và lên chồi.
Sự phát triển của mơ sẹo cĩ thể chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào và phân hĩa. Ở giai đoạn phân chia, tế bào mơ cấy trở về dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hĩa. Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mơ sẹo khác nhau và cĩ thể hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phơi. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất kích thích tăng trưởng ở nồng độ nào cũng đều cảm ứng tạo mơ sẹo, nên sử dụng mơi trường nuơi cấy là 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.1 mg/l BA hoặc 0.1 mg/l Kinetine vì ở mơi trường này vẫn hình thành mơ sẹo mà lại tiết kiệm được lượng chất kích thích điều hịa tăng trưởng thực vật. Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần một đơn vị sẽ thu được sinh tạo mơ sẹo. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao sẽ kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1 sẽ kích thích tạo mơ sẹo, từ những mơ sẹo này sau đĩ hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp sẽ kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C xác định sự tạo cơ quan, tỉ lệ cao tạo chồi, tỉ lệ thấp tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959).
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo khác nhau
Mục đích thí nghiệm xem xét khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo thu được ở thí nghiệm 2 từ đĩ tìm ra được dịng mơ sẹo cĩ khả năng cảm ứng