mười giờ bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20 Mục đích thí nghiệm
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 40
Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy đốt thân để tìm ra thời gian khử trùng cho tỉ lệ nhiễm và chết thấp nhất để mẫu cấy vẫn cĩ khả năng tăng trưởng và phát triển để cĩ nguồn mẫu thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành thí nghiệm
Mẫu sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ và đưa vào tủ cấy, tiến hành khử trùng bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung Tween 20 với các khoảng thời gian lần lượt như trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20
Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút)
1 7 5
2 7 7
3 7 10
4 7 15
Chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ nhiễm của mẫu cấy ứng với các khoảng thời gian khử trùng khác nhau. Ghi nhận kết quả và chọn thời gian khử trùng cĩ tỉ lệ mẫu cấy nhiễm ít nhất đồng thời tỉ lệ mẫu sống sĩt phải cao để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo
Mục đích thí nghiệm
Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 41
Mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ sau khi khử trùng, cắt bỏ hai đầu của đốt thân cĩ màu trắng đục do tác động của chất khử trùng và cắt đốt khoảng 0.5cm để nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 30 g/l đường sucrose, 10 g/l agar và các chất điều hịa tăng trưởng thực vật như trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo của mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ
Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Kinetine (mg/l)
A0 - - - A1 0.1 0.1 - A2 0.25 0.25 - A3 0.5 0.5 - A4 0.1 - 0.1 A5 0.25 - 0.25 A6 0.5 - 0.5
Sau 4 tuần, ghi nhận sự phát sinh mơ sẹo của mẫu cấy. Đánh giá hình thái của mơ sẹo ở từng nồng độ khác nhau. Cân để xác định trọng lượng mơ sẹo ở từng mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát màu sắc, hình dạng, đặc điểm, trọng lượng của mơ sẹo phát sinh sau 4 tuần theo dõi.
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo khác nhau.
Mục đích thí nghiệm
Đánh giá khả năng tái sinh chồi từ hai dịng mơ sẹo khác nhau trên cùng một mơi trường.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 42
Các dịng mơ sẹo thu được ở thí nghiệm 2 được cấy chuyển vào mơi trường bổ sung IBA và BA hoặc Kinetin nhưng với tỉ lệ cytokinin cao hơn (tỉ lệ auxin:cytokinin = 1:5) để đánh giá khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo khác nhau.
Bảng 3.3. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo
Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Kinetine (mg/l) Auxin/cytokinin
B0 - - - -
B1 0.1 0.5 - 1:5
B2 0.1 - 0.5 1:5
Sau 4 tuần, ghi nhận hình thái mơ sẹo, khả năng tái sinh chồi ở hai dịng mơ sẹo khác nhau. Chọn dịng mơ sẹo cĩ khả năng tái sinh chồi tốt nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát khả năng tái sinh chồi, đếm số lượng chồi, đo chiều cao chồi, hình thái chồi.
3.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo
Mục đích thí nghiệm
Đánh giá khả năng tái sinh chồi của dịng mơ sẹo từ thí nghiệm trên khi được nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung các chất kích thích tăng trưởng IBA và BA ở các nồng độ khác nhau.
Tiến hành thí nghiệm
Từ thí nghiệm 3, chọn dịng mơ sẹo cĩ khả năng tái sinh chồi tốt nhất và nuơi cấy trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau như trong bảng 3.4.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 43
Bảng 3.4. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo ở các nồng độ khác nhau
Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Auxin/cytokinin
C1 0.1 0.25 1:2.5 C2 0.1 0.5 1:5 C3 0.1 0.75 1:7.5 C4 0.1 1.0 1:10 C5 0.25 0.5 1:2 C6 0.25 0.75 1:3 C7 0.25 1.0 1:4 C8 0.25 1.25 1:5
Sau 4 tuần, ghi nhận khả năng tái sinh chồi của mơ sẹo trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau, tiến hành đếm số lượng chồi thu được và đo chiều cao chồi.
Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát khả năng tái sinh chồi, đặc điểm chồi, số lượng chồi thu được, đo chiều cao chồi.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu sau khi được đo đạc, tính tốn ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được phân tích, xử lý thống kê bằng chương trình MS – EXCEL biểu diễn dưới dạng trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn và xử lý bằng chương trình Statgraphics.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 44 Chương 4: Kết quả - Thảo luận
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20 bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20
Mẫu đốt thân hoa mười giờ sau khi được khử trùng sơ bộ bên ngồi dưới vịi nước chảy và nước rửa chén sunlight pha lỗng sẽ được đưa vào tủ cấy để tiến hành khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung vài giọt Tween 20 với các khoảng thời gian khác nhau.
Mẫu đốt thân sau khi khử trùng sẽ được cắt bỏ hai đầu của đốt thân cĩ màu trắng đục do tác dụng của chất khử trùng, sau đĩ cắt từng đoạn ngắn khoảng 0.5cm và cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA. Tỉ lệ mẫu nhiễm được ghi nhận sau 1 tuần nuơi cấy và trình bày trong bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) 5 7 10 15 10.4c (*) 4.2b 0a 0a 0a 35.4b 43.75c 68.75d 89.6a 60.4b 56.25b 31.25c
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05.
Từ bảng kết quả cho thấy thời gian khử trùng ở 5 phút thì tỉ lệ mẫu bị nhiễm cao (10,4%) so với các khoảng thời gian khác nhưng mẫu khơng bị chết. Ở thời gian 10 và 15 phút thì tỉ lệ mẫu chết lại cao (tương ứng là 43,75% và 68,75%), ở 15 phút mẫu chết khá nhiều vì để mẫu lâu trong dung dịch Javel
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 45
7% thì mẫu cấy bị tổn thương và dẫn đến chết mẫu cấy sau đĩ. Do đĩ thời gian khử trùng tốt nhất đối với mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ là 5 phút với Javel 7% cĩ bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween 20.
Khi tiến hành nuơi cấy mơ thực vật thì vấn đề quan trọng nhất là phải tạo được nguồn mẫu ban đầu đảm bảo vơ trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ đảm bảo vơ trùng và vẫn cĩ khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm tiếp theo. Cĩ rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng trong quá trình nuơi cấy như từ mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy. Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin rất thích hợp cho các lồi nấm và vi khuẩn phát triển, tốc độ phát triển của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật nên rất dễ nhiễm nấm hay vi khuẩn và tốc độ lan truyền rất nhanh gây ảnh hưởng lớn đến mẫu hoặc thường gây chết mẫu. Nếu nhiễm vi khuẩn thì sẽ thấy trên bề mặt lớp mơi trường cĩ một lớp màng mỏng cĩ màu trắng đục, màu vàng, hồng, cam,… Những loại vi khuẩn thường gặp ở
mơ thực vật là: Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas,… Nếu
nhiễm nấm thì thường thấy một lớp dày trên bề mặt lớp mơi trường cĩ màu xanh, nâu, xám, trắng, đen,… Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mơ và mơi trường cấy thì đây là nhiễm do mơ cấy. Nếu sự nhiễm đi từ một điểm bất kỳ nào đĩ trong mơi trường thì nguồn nhiễm cĩ thể do khơng khí hoặc sự khử trùng mơi trường khơng tốt hoặc do nhiễm từ khơng khí xung quanh. (Dương Cơng Kiên, 2002).
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khĩ vì mẫu sống khơng thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà mẫu phải giữ được bản chất sinh học của nĩ. Do đĩ, mẫu cấy phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng như: Hypoclorite calcium Ca(OCl)2, Hypochlorite sodium NaOCl, Clorur thủy ngân HgCl2, H2O2,… Ở đây sử dụng dung dịch Javel 7% (Hypochlorite sodium). Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá hủy sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hiệu lực của các chất
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 46
khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mơ cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mơ cấy và cĩ độc tính thấp đối với mơ cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì ta cĩ thể thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mơ thực vật do vậy bề mặt tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá hủy lớp màng phospholipid, phân hủy lipid và acid béo, hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hĩa ức chế khơng thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hơ hấp của tế bào vi sinh vật.
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hịa IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo
Tác động của các chất điều hịa tăng trưởng thực vật được ghi nhận sau 4 tuần nuơi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2 và 4.3
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh mơ sẹo
Mơi trường Trọng lượng mơ sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l BA 0.4752b (*)
0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l BA 1.0160b
0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 1.6637a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 47
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo
Mơi trường Trọng lượng mơ sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l Kinetine 0.0953b (*)
0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l Kinetine 0.0963b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 0.1608a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05.
Các mẫu cấy trong mơi trường MS khơng bổ sung chất kích thích tăng trưởng thì mẫu cấy chỉ kéo dài ra sau đĩ đen dần và chết.
Các loại auxin và cytokinin khác nhau cĩ tương tác khác nhau. Do đĩ, ảnh hưởng của chúng lên mẫu cấy cũng khác nhau. Trong mơi trường MS cĩ bổ sung thêm IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine dù ở nồng độ nào thì vẫn hình thành mơ sẹo nhưng loại cytokinin khác nhau thì cho loại mơ sẹo khác nhau. Nếu là IBA kết hợp với BA thì hình thành loại mơ sẹo đặc, cĩ màu trắng vàng và nâu nhạt, xốp bơng, mơ sẹo phát triển nhanh. Cịn IBA kết hợp với Kinetine thì hình thành loại mơ sẹo cứng, cĩ màu nâu đen, ít hoặc ko xốp, mơ sẹo phát triển chậm. Điều này cũng được chứng minh bởi Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong mơi trường nuơi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mơ sẹo thay đổi. Tốc độ tăng trưởng của mơ sẹo phụ thuộc vào thành phần, cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martnez, 1995; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo mơ sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mơ sẹo cĩ dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992).
Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự tạo mơ sẹo (Ahloowalia, 1991; Komamin và cộng sự, 1992; Liu và cộng sự, 1993; Zimmerman, 1993). Trong mơi trường nuơi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mơ và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mơ sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 48
ra sự phát sinh phơi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ khơng cĩ sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mơ sẹo (Torres, 1989). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhĩm song tử diệp khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo trong mơi trường chỉ cĩ auxin mà cần phải cĩ một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Đối với cây hoa mười giờ cũng là cây thuộc nhĩm song tử diệp nên mơi trường nuơi cấy cĩ sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là rất cần thiết cho cây để tạo mơ sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu
trên tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0.5 mg/l và BA 1.0 mg/l để cĩ thể tạo mơ sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần cĩ sự
phối hợp giữa 2,4-D 3.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và kinetine 0.2 mg/l cho sự tạo mơ sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Cĩ một số cơng trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey,1977 trên mơ rễ cây đậu nành, ghi nhận cĩ sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu mơi trường chỉ cĩ auxin thì hàm lượng DNA được ghi nhận là khơng thay đổi.
Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mơ sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như khơng tác động trên mơ phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuơi cấy, nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hồng Anh, 2000).
Khả năng tạo mơ sẹo của mơ và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hĩa và kiểu gen (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mơ sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong mơi trường nuơi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985). Do vậy, việc chọn lựa ở cơ quan để tiến hành cấy vơ mẫu ban đầu là rất quan trọng, ở thí nghiệm này mẫu cấy được
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 49
chọn là những đốt thân cịn non ở cây tươi, khỏe, kết quả thu được sau khi vơ