phát triển của thực vật
Chất điều hịa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại.
Các chất điều hịa nội sinh cĩ thể được kiểm sốt do cơ chế chuyển hĩa của tế bào nên chúng được kiểm sốt hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hịa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế.
Auxin
Auxin là nhĩm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuơi cấy mơ – tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nĩ được sử dụng phối hợp với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong mơi trường nuơi cấy phụ thuộc vào:
Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.
Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 21
Auxin là hợp chất cĩ nhân indole, cĩ cơng thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm cĩ hai loại là auxin cĩ nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA; NAA; 2,4-D;…). IAA tổng hợp được sử dụng trong nuơi cấy mơ nhưng nĩ dễ bị biến tính trong mơi trường nuơi cấy và nhanh chĩng thối biến ở trong mơ. Tuy nhiên những đặc tính này cĩ thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA cùng với cytokinin sau khi cảm ứng sự hình thành mơ sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phơi khi hàm lượng của nĩ trong mơ giảm dần. IAA thường được sử dụng phối hợp với các chất điều hịa sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp. Tuy nhiên, tùy theo mục đích thí nghiệm mà người ta cĩ thể sử dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nĩ cĩ những hoạt động hơi khác với auxin như: IBA, 2,4 – D, NAA. 2,4 – D thường được sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng sự tạo mơ sẹo và huyền phù tế bào và nĩ sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái. IBA và NAA là loại auxin thích hợp trong nuơi cấy chồi. IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA khơng ổn định trong mơi trường nuơi cấy cho dù nĩ được lọc qua màng lọc vơ trùng. Nồng độ của IAA cĩ thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuơi cấy ở trong tối nếu khơng được bổ sung thêm, tốc độ phân hủy của auxin ở ngồi sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệt trong mơi trường MS. IBA ổn định trong mơi trường hơn là IAA, mức độ giảm của IBA thấp. Cịn NAA và 2,4 – D khơng bị biến tính trong mơi trường nuơi cấy. Ngồi ra, cịn cĩ một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụng như: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram.
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nĩ tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hịa tăng trưởng khác.
Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 22
Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phĩng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+.
Auxin tác động lên các quá trình chuyển hĩa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome.
Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mơ sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phơi sinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy mơ sẹo.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả cịn non và lưu thơng từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật cịn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hĩa do hoạt động của các enzyme auxin - oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luơn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng.
Đối với một số lồi, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004).
Cytokinin
Cytokinin là một trong nhĩm chất điều hịa sinh trưởng thực vật. Cytokinin ít cĩ ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nĩ cĩ hiệu quả trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein.
Cytokinin được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong mơi trường nuơi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, cĩ 2 nhĩm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngồi ra cịn cĩ 2 nhĩm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuơi cấy mơ thực vật là Kinetin và BAP. Các loại cytokinin tự nhiên như
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 23
zeatin và IPA ít được sử dụng trong các thí nghiệm vì giá thành cao, chỉ thường sử dụng Kinetine và BAP.
Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi cĩ sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đơi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể.
Trong nuơi cấy mơ, nếu lượng cytokinin khơng đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Khi cấy chuyển mơ sang mơi trường mới cĩ chứa cytokinin thì tế bào sẽ phân chia liên tục sau giai đoạn nghỉ. Người ta cịn cho rằng sự phân chia tế bào trong mơ sẹo xảy ra khi khơng cĩ sự hiện diện của cytokinin trong mơi trường nuơi cấy là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nĩ
Cytokinin rất cĩ hiệu quả trong vai trị kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc
gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mơ thực vật nuơi cấy in
vitro. Tác dụng này của cytokinin đơi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp
với auxin. Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ cĩ hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Cytokinin cũng cĩ khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuơi cấy chồi của những lồi cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào mơi trường nuơi cấy. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này khơng thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mơ sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin.
Cytokinin cĩ vai trị trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ. Đơi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích sự tạo
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 24
thành rễ bất định khi khơng cĩ sự hiện diện của auxin. Trong hầu hết các trường hợp, chỉ cĩ nồng độ cytokinin thấp là cĩ hiệu quả.
Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào mơi trường nuơi cấy để cảm ứng sự tạo mơ sẹo cĩ khả năng sinh phơi đặc biệt là những cây lá rộng. Tuy nhiên, cũng cĩ vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinh phơi ở cây một lá mầm ví dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 µM đủ để ngăn cản sự sinh phơi ở Dactylis glomerata. Cytokinin nội sinh cũng cĩ thể ngăn cản sự tạo phơi ở một số lồi thực vật.
Cytokinin kích thích quá trình chuyển hĩa, bảo vệ các chất chuyển hĩa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hĩa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn.
Ảnh hưởng của cytokinin trên sự nuơi cấy mơ và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuơi cấy, lồi thực vật được nuơi cấy và mẫu cấy được thu từ mơ cịn non hay mơ đã trưởng thành.
Trường hợp duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng cĩ thể làm tăng hiệu quả của auxin. Hầu như sự tăng trưởng chồi khơng xảy ra ở 30oC.
Tĩm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mơ, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hĩa, tạo điều kiện thuận lợi
cho nuơi cấy in vitro.
2.1.9.3. Ảnh hưởng của vitamin lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật
Vitamin thường cĩ chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme. Vitamin được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật là thiamine (vitamin B1). Các vitamin khác như acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng cĩ thể được thêm vào mơi trường nuơi cấy bởi chúng cĩ thể tăng cường sự đáp ứng của tế bào.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 25
Các dung dịch vitamin được bảo quản tốt nhất trong tủ lạnh và dùng 10 ml cho 1 lít mơi trường. Các dung dịch vitamin sử dụng trong các thí nghiệm. Hiện nay, trong quá trình pha chế mơi trường ta thường thêm các dung dịch
vitamin vào mơi trường trước khi hấp khử trùng. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu đặc biệt về vitamin thì ta nhận thấy rằng tốt nhất là nên lọc khử trùng các dung dịch vitamin và sau đĩ thêm vào mơi trường đã hấp khử trùng.
2.1.9.4. Ảnh hưởng của đường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật
Khi được nuơi cấy in vitro, thường thì các tế bào thực vật khơng cĩ khả năng
quang hợp và do đĩ nĩ địi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào.
Trong nuơi cấy protoplast (nuơi cấy tế bào trần) thì lượng đường sử dụng thường thấp, ngược lại trong nuơi cấy phơi và bao phấn thì dùng đường nhiều hơn.
Đường cĩ thể bị caramel hĩa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino. Sự caramel hĩa xảy ra khi đường bị đun nĩng, thối biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và cĩ phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào.
2.1.10. Các chất khử trùng hĩa học được sử dụng trong nuơi cấy mơ
Cĩ thể nĩi, khĩ khăn lớn nhất khi tiến hành nuơi cấy mơ là phải tạo được thể
nhân giống in vitro vơ trùng. Cĩ nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng,
trong quá trình nuơi cấy cĩ thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy.
Mẫu cấy, các mảnh mơ thực vật, dùng để nuơi cấy thường là nguồn nhiễm chính vì cĩ rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số lồi thực vật được bao phủ
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 26
bên ngồi bởi một lớp sáp dày hoặc cĩ lơng tơ thì càng khĩ khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngồi ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mơ mạch thì xem như khơng thể dùng phương pháp khử trùng thơng thường để loại bỏ vi sinh vật được.
Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Để tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thường rửa sơ mơ cấy với xà phịng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng, ngồi ra cĩ thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng 3 – 5 lần.
Một số chất khử trùng thường được sử dụng như:
Chlorur thủy ngân (HgCl2): đây là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0.01% - 0.05%, chất này rất khĩ đào thải, vì vậy cẩn thận khi tiếp xúc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sodium hypochlorite NaOCl: cĩ trong các dung dịch tẩy trắng 5 – 20%. Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất vơ trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mơ thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mơ về sau.
Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: nồng độ khoảng 5 – 10%, xử lý mơ cấy từ 5 – 30 phút.
Ethyl hay isopropyl alcohol 70%: thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuơi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 – 5 phút.
Nước oxy già (H2O2): là một chất oxy hĩa cực mạnh, cĩ thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vơ trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc đối với mơ thực vật, do đĩ phải rửa thật sạch.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 27
Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mơ thực vật, khơng cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng sau khi xử lý bằng chất này.
Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: những kháng sinh này cĩ tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuơi cấy.
Sodium dichloroiso cyanurate (dichloroiso cyanuric acid sodium salt) (NADCC): chất này ít độc đối với mơ thực vật, vốn rất dễ tổn thương bởi Ca(OCl)2 và NaOCl, khơng cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vơ trùng sau khi xử lý bằng chất này.
Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán của viện Plant Cell Technology (Washington DC.) và được quảng cáo là :”… cĩ khả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuơi cấy mơ thực vật”. Cũng đã cĩ những thử nghiệm và khẳng định cơng dụng diệt trùng của chất này nhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật.
Nĩi chung việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn và nồng độ chất khử trùng thấp mà vẫn thu được mẫu cấy sạch là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùng cĩ thể phá hủy mơ của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Cơng Kiên, 2002).