Luận văn công nghệ sinh học Vi nhân giống lan gấm anoectochilus formosanus hayata

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của môi trường đến sự

LỜI CẢM ƠN

Đề tài tốt nghiệp này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi trường, Trường Đại học Lạc Hồng dưới sự hướng dẫn của Ths Vưu Ngọc Dung và Ths Mai Hương Trà, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi trường Trường Đại học Lạc Hồng

Để hoàn thành tốt bài báo cáo nghiên cứu này chúng tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể

Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Lạc Hồng cho phép chúng tôi thực hiện đề tài này

Cảm ơn cô Vưu Ngọc Dung và cô Mai Hương Trà, người trực tiếp hướng dẫn đề tài nghiên cứu của chúng tôi đã đóng góp nhiều ý kiến và tận tình hướng dẫn cho chúng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, trình bày báo cáo

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu

Cảm ơn các bạn, anh chị trong nhóm sinh viên thực tập tốt nghiệp đã giúp đỡ chúng tôi hoàn thành đề tài

Và cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn dành sự cảm thông chia sẻ, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn!

Biên Hòa, ngày 24 tháng 11 năm 2013

Sinh viên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU 2

1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 2

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 3

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 3

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

1.5 KẾT CẤU CỦA ĐỀ TÀI 3

PHẦN II: NỘI DUNG 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 4

1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô 4

1.1.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 5

1.1.3 Các bước nhân giống in vitro 6

1.1.3.1 Tạo thể nhân giống in vitro 6

1.1.3.2 Nhân giống in vitro 6

1.1.3.3 Chuyển cây in vitro ra vườn ươm 7

1.1.3.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro 7

1.1.4 Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro 7

1.1.4.1 Ưu điểm 7

1.1.4.2 Hạn chế 8

1.1.5 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô 8

1.1.5.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản 8

1.1.5.2 Về mặt thực tiễn sản xuất 9

1.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 9

1.2.1 Một số loại môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô 9

1.2.2 Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy 10

1.2.2.1 Các chất khoáng 11

1.2.2.2 Các Vitamin 11

1.2.2.3 Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy 11

1.2.2.4 Yếu tố làm đặc môi trường 12

1.2.2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng 12

1.2.2.6 Các chất kháng sinh 13

1.2.3 Độ pH môi trường 14

1.3 TỔNG QUAN VỀ LAN GẤM 14

1.3.1 Tình hình sản xuất 14

1.3.2 Nhu cầu thị trường lan 15

1.3.3 Nguồn gốc và kỹ thuật trồng lan 16

1.3.3.1 Vị trí phân loại 16

1.3.3.2 Nguồn gốc và phân bố 16

1.3.3.3 Đặc điểm hình thái 17

1.3.3.4 Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến lan Gấm 17

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ NUÔI CẤY LAN GẤM 18

1.4.1 Trên thế giới 18

1.4.2 Ở Việt Nam 19

1.4.3 Kết luận 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22

2.1.1 Mẫu mô 22

2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị 22

2.1.2.1 Chuẩn bị phòng thí nghiệm 22

2.1.2.2 Chuẩn bị dụng cụ 22

2.1.2.3 Các thao tác trong phòng cấy 23

2.1.2.4 Điều kiện 24

2.2 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 24

2.2.1 Môi trường Knudson C 24

2.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng 25

2.2.3 Dịch chiết khoai tây 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 25

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 26

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi 26

2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi 27

2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ 29

2.3.3 Xử lý số liệu: 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 KẾT QUẢ 31

3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi 31

3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi 35

3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ 39

3.2 THẢO LUẬN 46

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 KẾT LUẬN 49

4.2 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn

Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy

Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân nhanh chồi và phát triển chồi Biểu đồ 3.4: Biểu diễn số chồi nhân nhanh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.5: Biểu diễn chiều cao của chồi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của môi trưởng đến sự ra rễ và phát triển rễ

Biểu đồ 3.7: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy

Biểu đồ 3.8: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc và môi trường nuôi cấy

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường Knusond C

Bảng 2.2: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và Kinetin trong môi

trường tái sinh chồi

Bảng 2.3: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và NAA trong môi trường

nhân nhanh chồi

Bảng 2.4: Bảng bố trí thí nghiệm phân bố nồng độ BAP và NAA trong môi trường

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata

Hình 1.2: Các dạng sản phẩm lan Gấm thô và lan Gấm chế biến

Hình 1.3: Lan Gấm

Hình 2.1: Sơ đồ Phòng nuôi cấy mô, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường Hình 2.2: Nồi hấp Autoclave

Hình 2.3: Cân phân tích

Hình 3.1: Số chồi hình thành trên môi trường TS5 sau 2,4,6 tuần

Hình 3.2: Số chồi hình thành trên môi trường KC7 sau 2,4,6 tuần

Hình 3.4: Sự phát triển của rễ sau 6 tuần

Hình 3.5: Quy trình vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BAP: 6 – Benzylamino – purine

IBA: Indol Butyric Acid

KT: Forchlorfenuron

CĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng

CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

1

LỜI MỞ ĐẦU

Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được du nhập vào nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và vào đầu những năm 1970 tại miền Bắc Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ mô - tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đang không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây giống Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trên thị trường quốc tế

Nhiều loài hoa quý được phục tráng nhằm bảo tồn giống Như các loài hoa khác, hiện nay hoa lan đã được phục hồi rất nhiều chủng loại Không chỉ bởi vì bảo quản nguồn giống mà bản thân hoa lan cũng mang lại nhiều lợi ích như làm cảnh, chiết xuất dược liệu, làm thuốc,

Trên thị trường hiện nay, bên cạnh những loài hoa truyền thống, hoa lan ngày càng được ưa chuộng bởi vẻ hiện đại, sang trọng, ưu điểm lâu tàn, hương thơm đặc biệt, đa dạng mà hầu như không có loại hương liệu nhân tạo nào sánh được

Lan Gấm (Anoectochilus sp) ngoài những ưu điểm trên, nó còn có giá trị y học

và tiềm năng kinh tế rất lớn

Việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Gấm được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn nhằm mục đích đáp ứng nhu cầu về số lượng cũng như chất lượng cây giống loài lan này cho thị trường trong nước và ngoài nước

2

PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU

1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Sự phát triển của y học cổ truyền đặc biệt là Đông y Trung Quốc đã khiến cho

lan Gấm Anoectochilus formosanus trở thành một loài dược liệu quý, đặc biệt

Anoectochilus formosanus Hayata là loài có giá trị dược liệu và thương mại cao trên

thế giới Để đáp ứng nhu cầu sử dụng, Trung Quốc đầu tư phát triển nền công nghiệp Anoectochilus Với nhu cầu nguyên liệu lớn, Trung Quốc tận thu nguồn lan

Gấm từ các nước trong khu vực mà chủ yếu ở Việt Nam

Năm 2011, trên những cánh rừng Tây Nguyên, người dân kéo nhau đi săn tìm cây lan Gấm để bán cho thương lái Trung Quốc Chỉ trong thời gian ngắn loài lan này đã có nguy cơ biến mất khỏi Việt Nam nếu như các cơ quan chức năng không vào cuộc khôi phục lại nguồn giống Năm 2007, lan Gấm được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, xếp hạng EN A1a, c, d

Tài liệu nghiên cứu của Đài Loan cho biết, đây là loài cây quý giá có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, chữa trị vết thương do rắn độc cắn

Có tính kháng khuẩn, chữa bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính Ngoài ra còn dùng chữa thần kinh suy nhược, ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận, di tinh, đau lưng, phong thấp, tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt Dùng cây (khô, tươi) nấu nước uống chữa đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt cao, tăng huyết áp, liệt dương, rối loạn chức năng gan, lá lách và bệnh ung thư…[1]

Nhờ quý hiếm và có tính dược liệu quý nên giá cây lan Gấm tươi được bán trên thị trường thế giới từ 200 - 300 USD/kg (thân, rễ, lá, hoa) Cây khô có giá từ 3.200 USD/kg, nếu thu hái trong tự nhiên giá cao gấp 3 lần Trung Quốc, Đài Loan, Nhật

đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn Tiềm năng sản xuất và xuất khẩu cây lan Gấm rất lớn nếu được đầu tư đúng mức.[1]

Ở Việt Nam do việc khai thác quá mức mà loại lan này gần như cạn kiệt ngoài tự nhiên Chính vì thế để đáp ứng được nhu cầu giống với số lượng lớn của thị trường người ta áp dụng nhân giống bằng nuôi cấy mô

Nhận thức được vấn đề và góp phần đáp ứng nhu cầu thực tiễn chúng tôi thực

3

hiện đề tài “Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Nhân được số lượng lớn cây lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata, cây

khỏe và phát triển tốt trong điều kiện in vitro

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là lan

Gấm Anoectochilus formosanus Hayata do

Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí

Minh cung cấp

Phạm vi nghiên cứu của đề tài là xây

dựng quy trình nhân giống lan Gấm từ mẫu

cây con in vitro (Cây in vitroTái sinh

chồi  Nhân chồi Ra rễ  Cây con )

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí

nghiệm nuôi cấy mô trường Đại học Lạc

Hồng

Hình 1.1: Lan Gấm Anoectochilusformosanus Hayata

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tổng quan tài liệu

Thực nghiệm

Bố trí thí nghiệm

Nuôi cấy mô thực vật

Phân tích và xử lý số liệu thống kê

1.5 KẾT CẤU CỦA ĐỀ TÀI

Gồm các chương mục và nội dung sơ lược của chương mục

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4

PHẦN II: NỘI DUNG

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô [2]

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật đưa một mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có kiểm soát về: thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm

để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đích của người nuôi cấy Kỹ thuật này dựa trên hai nguyên tắc sau:

1.1.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

Năm 1922 con người đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo trong 12 ngày Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng minh bằng thực nghiệm Sau 43 năm (năm 1965), đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm Kết quả này chứng minh đầy đủ tính toàn năng của tế bào

1.1.1.2 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào

đó Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật,

tế bào thần kinh động vật Người ta đã kết rằng: những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu

5

Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc Các tế bào động vật nói chung khó nuôi cấy hơn do chúng đã được biệt hóa quá sâu sắc và vì thế quá trình phản biệt hóa rất khó thực hiện

1.1.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro [3]

1.1.2.1 Nuôi cấy đốt thân

Sử dụng mẫu cấy là một đoạn thân ngắn có chứa chồi ngủ

Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá được hình thành

Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp đến khi đủ số lượng cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển

ra trồng trong đất

1.1.2.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh trưởng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 – 1 cm Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh

6

Để nâng cao tỉ lệ nảy mầm của hạt lan gấm, hiện nay người ta dùng nấm

Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỉ lệ nảy mầm lên 80% trong môi trường

OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar

1.1.3 Các bước nhân giống in vitro [4]

Để nhân giống được một cây con hoàn chỉnh có khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên bằng phương pháp nhân giống in vitro thì trải qua 4 bước:

Tạo thể nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro

Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

1.1.3.1 Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi và thể cắt đốt, ngoài ra còn

có thể giò Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người

ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác

1.1.3.2 Nhân giống in vitro

Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn

1.1.3.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển

ra ngoài vườn ươm Cây con phải mạnh khỏe nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy

7

ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro Thường dùng các chất thuộc nhóm Auxin kích thích ra rễ

1.1.3.4 Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước Rễ được tạo thành trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ

1.1.4 Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro [4]

1.1.4.1 Ưu điểm

So với các phương pháp nhân giống khác thì phương pháp nhân giống in vitro

có một số thuận lợi là:

Những cây nhân giống in vitro đồng nhất về di truyền

Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được

Hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại

Được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm

Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm

Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn

Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen

8

Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống còn giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dữ trữ lâu dài và chiếm ít thời gian so với phương pháp nhân giống truyền thống

1.1.4.2 Hạn chế

Hạn chế chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất

cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quí hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo tồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy mô và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo

Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiêu hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

1.1.5 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô [5]

1.1.5.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản

Nuôi cấy mô đã sớm mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống

Thông qua nuôi cấy mô và tế bào chúng ta đã tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể và các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể Thực tế đã chứng minh là cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó là nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo và từ mô sẹo có thể kích thích thành cây hoàn chỉnh Bằng phương pháp nuôi cấy mô chúng ta có thể tiến hành tìm hiểu và nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ vì vậy mà bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản

Những lợi ích trong nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp: Kiểm soát được dịch bệnh hại cây trồng, ta có thể loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh

Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất

Kiểm soát được từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch

Tạo sự đồng loạt về giống, cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch

Làm tăng năng suất chất lượng cao giúp tiêu thụ nhanh và đem lại thu nhập cao

1.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY [6]

1.2.1 Một số loại môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô

Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy mô như:

Môi trường Murashige và Skoog (1962) (môi trường MS)

Môi trường Lloyd và McCoown (1981) (môi trường WP)

Môi trường White (1954) (môi trường W)

Môi trường Nitsch (1951)

10

Môi trường Gamborg, Miller và Ojima (môi trường B5)

Môi trường Schengk và Hilderbrant (1972) (môi trường SH)

Môi trường Nitsch và Nitsch (1969)

Môi trường Ahuja’s Aspen Culture (1983)

Môi trường Chu (1975)

Môi trường Knop (1884)

Môi trường Knudson C (1946)

Môi trường Heller (1953, 1955)

Môi trường Vacin và Went (1949)

1.2.2 Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy phải cung cấp các nguyên tố quan trọng và dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây in vitro Sự lựa chọn hay phát triển môi trường nuôi cấy là một bước quan trọng trong bất cứ đề tài nuôi cấy mô tế bào nào

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một

số thành phần cơ bản sau:

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Các vitamin

Các amino acid

Nguồn carbon: một số loại đường

Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,

Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường

11

Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)

Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…)

1.2.2.1 Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng

Nguyên tố đa lượng bao gồm N, P, K, Mg, S và Ca Các nguyên tố đa lượng này thường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch Đây là nguyên liệu để những

tế bào hình thành nên cấu trúc của mình

Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn,

Mn, Bo, I, Co Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát triển bình thường Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác cho phản ứng sinh hóa diễn ra trong tế bào

1.2.2.2 Các Vitamin

Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin

cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Trong các loại vitamin, B1 được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy tăng cường sức sinh trưởng của mô

1.2.2.3 Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính

là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v)

Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng Nước dừa đã được sử dụng để kích thích

1.2.2.4 Yếu tố làm đặc môi trường

Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường Nguyên liệu phổ biến nhất trong nuôi cấy mô là agar Người ta hoà agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên 60C) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng Ngoài ra tuỳ thuộc từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy lọc, vải, một số màng nhân tạo

Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có những tác động sinh lý trên mô thực vật Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường

do các chất cặn trong agar gây nên Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60 - 1000 C, đặc lại khi nhiệt độ còn 350C vì vậy agar

ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân huỷ bởi enzym thực vật Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường

1.2.2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như Auxin, Cytokinin và Giberellin là rất cần thiết

để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

13

Nhóm Auxin: Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái… đặc biệt có hoạt tính cao khi phối hợp sử dụng với các Cytokinin

Nhóm Cytokinin: Các Cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Chức năng chủ yếu của các Cytokinin là kích thích phân chia tế bào, tạo và nhân callus, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

Nhóm Gibberellin: Trong đời sống thực vật Gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý của thực vật Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Gibberellin có các chức năng cơ bản như kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, phá ngủ hạt giống, kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi

1.2.2.6 Các chất kháng sinh

Chất kháng sinh là chất được sản xuất bởi các loài vi sinh vật khác nhau, hoặc làcác chất kháng sinh tổng hợp Chúng có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác và cuối cùng làm tiêu huỷ chúng

Vai trò của các loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy tế bào và

mô thực vật

Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy

Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô nuôi cấy (sau nuôi cấy, hỗn hợp Agrobacterium với tế bào thực vật để chuyển gen hoàn thành)

Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô

đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh) Các tế bào không được chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh ở nồng độ thích hợp

14

1.2.3 Độ pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng Nhìn chung nếu độ pH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn 5 thì agar khó đông

1.3 TỔNG QUAN VỀ LAN GẤM

1.3.1 Tình hình sản xuất [7]

Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước

uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực (Lin và Wu 2007) Đại học Công nghệ Y dược và Cao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử

dụng A formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể

và kháng virus cúm A Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A formosanus Hayata chứa

hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch Dịch

chiết A formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sung viêm và bảo vệ gan Chiết xuất của cây A formosanus khô có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-

sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid (Takatsuki,S., 1992) Trung Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn

Sau hơn hai mươi năm nghiên cứu, đầu tư và phát triển, lan Gấm dần trở thành đặc sản của Đài Loan Đài Loan trở thành nơi cung cấp giống chất lượng cao và chuyển giao công nghệ cho các thành phố khác của Trung Quốc, cũng như các nước trong khu vực

Nam Kinh với hàng trăm công ty sản xuất lan Gấm với giá trị sản lượng hàng năm trên sáu trăm triệu đô la Mỹ

Phúc Kiến đã đầu tư 160 triệu nhân dân tệ cho việc xây dựng các nghiên cứu và phát triển nuôi cấy mô, trồng trọt, sản xuất, chế biến và khai thác với sản lượng hàng năm là 5 tỷ cây [19]

15

Tiềm năng sản xuất và xuất khẩu cây lan Gấm rất lớn nếu được đầu tư đúng mức Việt Nam đã tìm thấy 15 loài lan Gấm phân bố rải rác tại Kon Tum, Cúc Phương, Kẻ Bàng, Lai Châu, Tam Đảo, Sapa… Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu đánh giá nào về mặt dược liệu Vài năm gần đây, nhiều người dân một

số tỉnh Tây Nguyên đã và đang tìm kiếm, tận thu cây lan Gấm bán cho thương lái đưa qua Trung Quốc, nhiều học sinh thôn bản nghỉ học săn tìm vì mức giá hấp dẫn, giá thu mua ban đầu 600.000 đồng/kg tăng lên vài triệu đồng/kg Bị săn tìm quá mức, loại lan này gần như cạn kiệt ngoài tự nhiên

Nhận thức được tiềm năng, giá trị kinh tế của loài lan này, Công ty CP công nghệ cao Bắc Nam đang xúc tiến đầu tư trồng lan Gấm theo hướng dược liệu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, hiện đã hoàn thành quy trình nhân giống và chuẩn bị triển khai sản xuất quy mô công nghiệp Các địa bàn tiềm năng triển khai là Kon Tum, Lâm Đồng…

Cây lan Gấm sau thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sản phẩm gồm thân, rễ

và lá phơi khô xuất khẩu cho các nước chế biến trà dược, thực phẩm chức năng, thạch lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide

để từ A formosanus và A koshunensis để sản xuất biệt dược kinsenoside chữa trị

tăng huyết áp

Hình 1.2: Các dạng sản phẩm lan Gấm thô và lan Gấm chế biến

1.3.2 Nhu cầu thị trường lan

16

Ở Việt Nam, lan Gấm là một vị thuốc Đông y có vị ngọt, hơi chát, tính mát

Có tác dụng tư âm nhuận phế, thanh nhiệt lương huyết nhưng không thông dụng, chủ yếu được săn tìm làm cảnh Giới sành lan xem lan Gấm như một loài lan cảnh phong thủy, xua đuổi tà ma trong nhà và có thể chữa bách bệnh Vì thế, cây này đang từ vài chục đến vài trăm nghìn/cây thành món hàng độc được "săn" với giá rẻ nhất là 1 triệu đồng/cây

Vài năm trở lại đây, với nhu cầu sử dụng dược phẩm từ thiên nhiên, lan Gấm được xem như loài thảo dược quý, có giá trị thương mại cao trên thế giới Trung Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và xuất khẩu lan Gấm mang lại nguồn thu lớn Nước

ta có tiềm năng trồng, sản xuất và xuất khẩu cây lan Gấm rất lớn nhưng chưa được đầu tư đúng mức

1.3.3 Nguồn gốc và kỹ thuật trồng lan

Cây lan Gấm (Anoectochilus sp) còn gọi là cây Kim cương, Kim tuyến, Mộc sơn thạch tùng, thuộc họ Orchidaceae, gồm bốn chi: Ludisia, Anoectochilus, Goodyera,

Macodes và trên 50 loài Trong đó chi Anoectochilus có số loài phong phú nhất

(30-40 loài) và loài có giá trị dược liệu và thương mại cao trên thế giới hiện nay là

Anoectochilus formosanus Hayata Loài này được phát hiện ở Srilanka, Malaysia,

Ấn Độ, Nhật Bản, Nam Trung Quốc, Australia và quần đảo Nam Thái Bình Dương Việt Nam đã tìm thấy 15 loài lan Gấm phân bố rải rác tại Kon Tum, Cúc Phương, Kẻ Bàng, Lai Châu, Tam Đảo, Sapa, Lâm Đồng…

17

1.3.3.3 Đặc điểm hình thái

Thân cây thuộc loại địa lan thân bò rồi đứng cao khoảng 20 cm, thân tròn có nhiều nách, màu tím, mọng nước, phần cây non có nhiều lông mềm, mang 2-6 lá mọc cách, xòe trên mặt đất

Lá hình trái xoan hoặc hình trứng, gần tròn ở gốc và nhọn ở đầu, dài 3–4 cm và rộng 2 – 3 cm, trên mỗi chiếc lá có 3 - 5 sọc gân dọc Mặt trên màu nâu sậm có vệt vàng ở giữa và mạng gân màu hồng nhạt, mặt dưới màu nâu nhạt Cuống lá dài 2

3 cm, gốc cuống tạo thành bẹ lá ôm lấy thân

Hoa mọc thành từng cụm, với cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 5 - 10 hoa màu hồng phủ lông đỏ, dài 2,5 cm với cánh môi dài 1,5 cm mang 6-8 ria mỗi bên, đầu môi chẻ thành 2 thùy thuôn đầu tròn Bầu dài 13 mm, có lông thưa [17]

1.3.3.4 Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến lan Gấm [9]

Ánh sáng: Lan Gấm cần nhiều ánh nắng, nhưng phải che lưới để phòng bị cháy

lá Nhiều ánh sáng sẽ dễ ra hoa, có nhiều hoa hơn và mầu sắc sẽ trung thực hơn,

thiếu ánh sáng sẽ làm cho hoa nhạt đi

Nhiệt độ: Lan Gấm cần nhiệt độ thay đổi ngày nóng, đêm lạnh Ban ngày 32°C, ban đêm 10-15°C Lan có thể chịu nóng tới 38°C và lạnh tới -1°C miễn là không đóng băng, ngoài ra nếu không có sự cách biệt giữa ngày và đêm tối thiểu từ

27-13-16°C, hầu như lan sẽ không ra hoa

Nước: Tưới nước mỗi tuần một lần, nhưng mùa hè cần tưới nhiều hơn, có thể tưới 2-3 lần tùy theo địa phương, không nên để cây bị thiếu nước lúc cây đang phát triển, khi cây đã ngưng tăng trưởng bớt tưới nước, nhưng đừng để cây bị khô rễ, sẽ làm cho cây bị khựng lại, và có thể sẽ không ra hoa

Độ ẩm: Từ 40-70%, mùa hè cần tưới nước xuống giá thể hay phun sương vào buổi sáng hay chiều để tăng thêm độ ẩm

Giá thể: Giá thể thoáng nhưng vẫn giữ ẩm tốt như xơ dừa, vỏ thông…

Phân bón: Khi mùa phát triển cho cây con, cần bón phân 30-10-10 mỗi tuần một lần, chỉ dùng ¼ của công thức của nhà sản xuất để tránh cây bị cháy lá Khi cuối tháng 8 dùng phân bón 6 – 30 -30 hay 10 – 52 - 10, cuối tháng 11 ngưng tưới phân,

Năm 1992, Chen ZY và cộng sự nghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp ra rễ lan Gấm là môi trường ½ MS, 0,7 μg/l NAA, 30 g/l sucrose, 6,5 g thạch/l, pH 5,5

Bổ sung BA, IBA và zeatin có thể thúc đẩy sự hình thành và phát triển chồi Nồng

độ BA 1,0-2,0 μg/l, IBA 0,5-0,7 μg/l chồi phát triển tốt nhất Nếu bổ sung thêm 0,5 μg/l zeatin, chồi hình thành và phát triển thuận lợi hơn.[14]

0,1-Năm 1993, Ninh Hạ Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Đài Loan đã nhân giống thành công lan từ hạt và thân trong điều kiện in vitro

Năm 1997, Fan Zinan và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đối với sự phát triển rễ của lan Gấm, kết quả cho thấy bổ sung 0,2% than hoạt tính giúp

rễ phát triển tốt, lão hóa chậm [16]

Năm 2003, Ling-Chin Chou và Doris Chi-Ning Chang thực hiện thành công kĩ

thuật dùng nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt để tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt trên

môi trường OMA, gồm yến mạch, nấm men và agar.[17]

Đến năm 2005, Wang Yaying, Linrong Yao đã chỉ ra nếu bổ sung 3,5 ppm BA, 0,5 mg/l KT, 0,2 ppm NAA vào môi trường ½ MS là tốt nhất cho sự phát triển rễ lan Gấm [18]

Nhiều công trình nghiên cứu đã xác định được hoạt tính của các thành phần hóa học có trong lan Gấm

Nam Kinh với hàng trăm công ty sản xuất lan Gấm với giá trị sản lượng hàng năm trên sáu trăm triệu đô la Mỹ

Phúc Kiến đã đầu tư 160 triệu nhân dân tệ cho việc xây dựng các nghiên cứu và phát triển nuôi cấy mô, trồng trọt, sản xuất, chế biến và khai thác với sản lượng hàng năm là 5 tỷ cây [19]

1.4.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hơn một thập niên trở lại đây lan Gấm mới được chú ý nhân giống

và trồng thử nghiệm ở một số vùng như Lâm Đồng, Kom Tum…

Năm 2011, Trung tâm sinh học thực nghiệm, Viện Ứng dụng công nghệ đã nhân giống in vitro thành công cây dược liệu lan Gấm thuộc Sách đỏ Việt Nam

Cây giống lan Gấm có thể tạo từ nhân in vitro các nốt thân, hạt giống và các bộ phận sinh dưỡng của cây Tuy nhiên sự sinh trưởng các của cây lan Gấm in vitro chậm, kéo dài thời gian nhân giống Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây lan Gấm từ nuôi cấy hạt in vitro

Các trường Đại học như Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh, Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội, Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã có những kết quả nghiên cứu về lan Gấm như:

Đề tài: “Ảnh hưởng của agar và một số chất điều hòa sinh trưởng trong môi

trường vi nhân giống đến sinh trưởng, phát triển cây lan Gấm (Anoectochilus

formosanus Hayata” [11] đưa ra kết quả:

Ở hầu hết các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển chồi lan Gấm trên cả hai môi trường nền có bổ sung BA và TDZ cho thấy có agar tốt hơn không có agar

Nồng độ BA 2,0 ppm và TDZ 1,5 ppm trên môi trường MS có agar là tốt

20

nhất cho việc nhân chồi lan Gấm

Có thể sử dụng các môi trường sau để nhân chồi lan Gấm:

Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 8,0 g/l agar + 2,0 ppm BA

Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 2,0 ppm BA

Môi trường MS + 30 g/l đường + 0,2 g/l than hoạt tính +100 ml/l nước dừa + 8,0 g/l agar + 1,5 ppm TDZ

Đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến

Anoectochilus roxburghii (Wall.)Lindl’’[10] đã đưa ra kết luận:

Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan kim tuyến in vitro là Knudson C

Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knudson C bổ sung 0,5 ppm BAP + 0,3 ppm Kinetin + 0,3 ppm NAA + 100 ml/l nước dừa + 100g/l dịch chiết khoai tây + 20g/l sucrose + 7g/l Agar + 0.5 g/l than hoạt tính

Đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý” [13]

cho thấy:

Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 0,5g/l than hoạt tính + 7g agar/l cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu Các chồi có chiều cao từ 3-4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1mg/l αNAA

1.4.3 Kết luận

Kế thừa kết quả những nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn môi trường nền

sử dụng trong các thí nghiệm là: Knudson C, bổ sung nước dừa, dịch chiết khoai tây, đường sucrose, than hoạt tính, agar và các chất điều hòa sinh trưởng Trong môi trường tái sinh chồi, sử dụng CĐHSTTV BAP, Kinetin, GA3

21

BAP và Kinetin thuộc nhóm Cytokinin sẽ kích thích sự tổng hợp các Cytokinin nội sinh dẫn đến hàm lượng Cytokinin nội sinh cao nên kích thích sự phân chia phân hóa và gia tăng kích thước của tế bào GA3 thuộc nhóm Giberelin kết hợp với Cytokinin làm tăng hiệu quả tạo chồi

Trong môi trường nhân chồi, sử dụng CĐHSTTV BAP, NAA và bổ sung vitamin B1 B1 là vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả tế bào, xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, để mô có sức sinh trưởng tốt

Trong môi trường ra rễ, sử dụng CĐHSTTV BAP, NAA NAA là một Auxin

có hoạt tính khá mạnh so với các Auxin khác nên khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy NAA có tác dụng hoạt hóa sự dãn thành tế bào cũng như sự tổng hợp các chất tham gia cấu tạo nên chất nguyên sinh và thành tế bào, cảm ứng cho sự tổng hợp chuỗi polyamine dẫn đến các tế bào vùng rễ xuất hiện để tạo nên mầm rễ sau đó các mầm rễ này sẽ dài ra và chui ra khỏi vỏ tế bào và hình thành rễ

22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu mô

Là cây lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata in vitro do Viện Sinh học

nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Hình 2.1: Sơ đồ Phòng nuôi cấy mô,

Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường

Bình chứa môi trường nuôi cấy, pipet, ống đong

Cân phân tích 4 số ( chính xác đến 0,0001g)

Cân kỹ thuật 2 số ( chính xác đến 0,01g)

pH kế

Máy khuấy từ

Tủ sấy 60 – 2000C

23

Phòng nuôi cấy:

Tủ cấy vô trùng, quạt thông gió, đèn tử ngoại treo tường

Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang

Máy điều hòa nhiệt độ

Các dụng cụ thao tác: Kẹp lớn, kẹp nhỏ, dao, đĩa petri, mâm inox, erlen, becher, bông gòn thấm nước Tất cả đã được hấp khử trùng

Hình 2.2: Nồi hấp autoclave Hình 2.3: Cân phân tích

2.1.2.3 Các thao tác trong phòng cấy

Trước khi đưa vào sử dụng buồng cấy cần được xử lí bằng hơi Formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự nhiên Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde dư bằng dung dịch NH3 25% trong 24 giờ Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo…Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và một cốc đựng cồn 96 % để nhúng dụng cụ làm việc

Trước khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 70º Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử ngoại treo trên trần

Phòng cấy được khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực tím Thời gian khử trùng tùy theo kích thước của phòng và đèn cực tím chỉ được sử dụng khi không có người Tủ cấy thổi gió được khử trùng bằng cách mở quạt gió và lau tất cả các bề

24

mặt bằng cồn 95% trong 15 phút trước khi bắt đầu làm việc

Lau cồn 70º các bình đựng môi trường, chai mẫu và các vật dụng khi đưa vào tủ cấy Đốt các dụng cụ bằng cồn 96º sau mỗi lần thay đổi thao tác và gác lên kệ để nguội mới tiến hành tách hoặc cấy Các mẫu cây bị rơi trên mặt bàn không được sử dụng cấy lại Hơ kỹ miệng và nắp chai trước và sau khi cấy mẫu, thao tác cấy mẫu phải nhanh nhẹ Khi cấy hạn chế vơ tay qua mẫu nhằm hạn chế nhiễm nấm Tránh

để tay mới lau cồn gần đèn cồn khi đang cháy Mẫu sau khi được cấy vào bình, dùng bút lông ghi lại tên giống và ngày cấy, tên người cấy Ghi lại các thông tin này trong sổ thí nghiệm Vệ sinh sạch sẽ tủ cấy bằng cồn 70º sau khi kết thúc công việc

2.1.2.4 Điều kiện

Nhiệt độ phòng nuôi mô và cây in vitro là 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40% Giàn nuôi cấy gồm

3 tầng, kích thước mỗi tầng là 30×120cm, mỗi tàng cách nhau 25cm

2.2 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Các chất hóa học sử dụng trong quá trình Nuôi cấy mô được nhập khẩu từ Merck KgaA – Đức với độ tinh khiết 98%

2.2.1 Môi trường Knudson C

Bảng 2.1: Thành phần môi trường Knudson C

25

Với các thành phần khoáng đa lượng thì tiến hành pha thành 4 dung dịch mẹ Tiến hành pha riêng cho từng chất để tránh kết tủa trong thời gian dài sử dụng Mỗi dung dịch mẹ pha thành 250 ml Nồng độ khi cho vào môi trường là 25ml/l

25

Khoáng đa lượng I: Ca(NO3)2.4H2O

Khoáng đa lượng II: KH2PO4

Khoáng đa lượng III: MgSO4.7H2O

Khoáng đa lượng IV: (NH4)2SO4

Các thành phần vi lượng tiến hành pha chung thành 1 lít và nồng độ dùng trong môi trường nuôi cấy là 10ml/l gồm: FeSO4.7H2O và MnSO4 4H2O

2.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng

Dung dịch BAP (1mg/ml): Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg BAP

Dung dịch Kinetin (1mg/ml): Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5 ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg KIN Dung dịch NAA (1mg/ml): Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg NAA

Dung dịch 2,4 - D (1mg/ml): Cân 100mg 2,4 - D (2,4 - dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan trong 50ml ethanol 50% Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg 2,4-D

Dung dịch Thiamin – HCl (B1) (10 mg/ml): Cân 1000mg B1 hòa tan trong nước cất cho đủ 100ml

Dung dịch GA3 (1mg/ml): Cân 100mg GA3 hòa tan trong 50ml ethanol 50% Cho thêm nước cất cho đủ 100ml Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg GA3

2.2.3 Dịch chiết khoai tây

Cân 100 g khoai tây đã rửa sạch, gọt vỏ Xay nhuyễn, lọc lấy dịch chiết Thêm nước cho đủ 100 ml

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành với ba nội dung nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu được giải quyết lần lượt qua các thí nghiệm

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin,

GA 3 tới môi trường tái sinh chồi

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái sinh chồi

Vật liệu:

Các đốt thân (có chứa chồi ngủ) lan Gấm in vitro từ 1 - 1,5 cm

Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại) Dung tích mỗi bình là 500 ml, thể tích môi trường là 65 ml/ bình Thời gian theo dõi: 6 tuần

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40%

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,2 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml/l dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

27

Bảng 2.2: Nồng độ BAP, Kinetin, GA3 trong môi trường tái sinh chồi

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tái sinh, số chồi, hình thái chồi sau 2, 4,

Chồi non được tái sinh từ thí nghiệm 1

Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại) Dung tích mỗi bình là 500ml, thể

28

tích môi trường là 65ml/ bình Thời gian theo dõi: 6 tuần

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40%

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.3: Nồng độ BAP, NAA, B1 trong môi trường nhân nhanh chồi

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo chồi, số chồi, chiều dài chồi, đặc điểm chồi

29

2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ

Mục đích: Khảo sát và tìm ra các khoảng nồng độ cũng như các chất điều hòa

sinh trưởng thích hợp cho sự phát sinh rễ lan Gấm trong điều kiện in vitro

Vật liệu:

Các chồi xanh tốt từ 4 - 5 cm thu được ở thí nghiệm 2

Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại) Dung tích mỗi bình là 500ml, thể tích môi trường là 65ml/ bình Thời gian theo dõi: 6 tuần

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40%

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.4: Nồng độ NAA, BAP trong môi trường phát sinh rễ

30

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ tái sinh được trên mỗi chồi sau 2, 4, 6 tuần

2.3.3 Xử lý số liệu:

Số liệu thô được thống kê bằng phần mềm Excel 2010, sau đó được xử lý bằng phần mềm của chương trình thống kê STATGRAPHICS

Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn

Sau 2 tuần nuôi cấy, hầu như trên tất cả các môi trường đều phát sinh chồi, có sự chênh lệch hệ số nhân chồi giữa các nghiệm thức nhưng không nhiều Các mẫu đều tái sinh từ 1-2 chồi

Trên môi trường TS0 không bổ sung thêm CĐHSTTV, nhưng sau 2 tuần nuôi cấy thì một số mẫu vẫn hình thành chồi tuy nhiên chồi hình thành chậm hơn so với các môi trường khác Chứng tỏ ngoài nguồn hoocmon kích thích sinh trưởng nội sinh có trong mẫu, hàm lượng khoáng Knudson C và nguồn carbonhydrat có trong môi trường đã kích thích sự phân chia tế bào và sự phát sinh hình thái dẫn đến sự phát sinh chồi [12]

Tuy hệ số chồi không chênh lệch nhiều nhưng vẫn có thể thấy TS5 có số chồi nhiều nhất đạt 2,23 chồi/ mẫu cấy Cho thấy ở nồng độ BAP 2,0 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm mẫu có tỉ lệ cảm ứng tái sinh chồi nhanh nhất

Sau 4 tuần nuôi cấy, đã có sự chênh lệch lớn giữa các nghiệm thức Số chồi đều tăng ở tất cả các nghiệm thức, nhưng hệ số tăng khác nhau đã tạo nên sự khác biệt

rõ rệt thể hiện trên biểu đồ

32

Số chồi ở môi trường TS0 là thấp nhất đạt 1,2 chồi/ mẫu cấy Số chồi ở môi trường TS4 là cao nhất đạt 4,1 chồi/ mẫu, kế đến là TS5 đạt 3,95 chồi/ mẫu Ở giai đoạn này TS4 với nồng độ BAP 1,5 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm là môi trường có hệ số tái sinh chồi cao nhất, vượt qua TS5, nhưng chồi phát triển không đồng đều giữa các chồi trong cùng một mẫu và giữa các mẫu trong cùng nghiệm thức

Sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi ở các nghiệm thức tăng so với 2 tuần trước đó

Số chồi ở TS0 vẫn ở mức thấp nhất 1,42 chồi/ mẫu cấy TS5 cao nhất 5,27 chồi/ mẫu cấy Tiếp đến là TS6 với 5,07 chồi/ mẫu cấy

Ở môi trường TS1 (chỉ bổ sung 0,2 ppm KIN và 0,1 ppm GA3) và TS2 (chỉ bổ sung 0,5 ppm BAP và 0,1 ppm GA3) số chồi và hình thái chồi được hình thành chênh lệch nhau không đáng kể, do BAP và KIN đều thuộc nhóm Cytokinin nên có hoạt tính tương tự nhau ở nồng độ khác nhau

Ở TS3, chỉ bổ sung 1,0 ppm BAP và 0,1 ppm KIN với nồng độ cao hơn nghiệm thức trên, số chồi tăng, chồi khá lớn nhưng các chồi hình thành riêng lẻ, không phát triển thành cụm

Ở nồng độ BAP 2,0 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm TS5 cho hệ số tái sinh chồi cao nhất vượt qua TS4 (1,5 ppm BAP và 0,2 ppm KIN) so với 2 tuần trước đó Cho thấy sau 4 tuần nuôi cấy TS4 cho hệ số nhân chồi cao nhất, nhưng sau 2 tuần nữa thì lượng hoocmon sinh trưởng không đủ để mẫu tiếp tục tăng vượt trội về hệ

số nhân chồi

Từ biểu đồ cho thấy số chồi được tái sinh phụ thuộc vào nồng độ CĐHSTTV, khi nồng độ tăng thì số chồi tăng, nhưng đến giới hạn nhất định thì số chồi bắt đầu giảm xuống, ưu tiên phát triển hình thái khác, tạo thành pha tăng trưởng và pha suy thoái

TS6, TS7, TS8, TS9 nồng độ BAP tăng lên từ 2,5 – 4 ppm tỉ lệ nghịch với số chồi Tuy số chồi giảm không nhiều nhưng cũng thể hiện được ngưỡng phát triển chồi của BAP đang suy thoái

Số chồi tăng mạnh từ TS0 đến TS5, sau đó bắt đầu giảm nhẹ từ TS5 đến TS9

33

Khoảng nồng độ BAP từ 1,5 tới 3,5 ppm ở TS4 - TS8 là tốt nhất cho sự tái sinh chồi với tỉ lệ mẫu tái sinh 70 - 93% Trong đó TS5 là môi trường tối ưu để tái sinh chồi với tỉ lệ mẫu sống sót 98%, tỉ lệ mẫu tái sinh chồi 93%, số chồi tái sinh đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy

TS0 TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 TS6 TS7 TS8 TS9

Means and 95.0 Percent LSD Intervals

MOI TRUONG

0 1 2 3 4 5 6

Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy

Theo kết quả bảng phân tích Anova (bảng 1 phụ lục) ảnh hưởng của môi trường lên số chồi của lan Gấm, cho thấy giá trị P -Value bằng 0,0000 < 0,05 như vậy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở độ tin cậy 95% Điều này cho biết có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường tác động đến số chồi

tái sinh của lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata ở độ tin cậy 95%

Kết quả trắc nghiệm LSD (bảng 2 phụ lục) ảnh hưởng của môi trường lên số chồi đạt được cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trườngnhư: TS0 - TS1, TS0 - TS2, TS0 - TS3, TS0 - TS4, TS0 - TS5, TS0 - TS6, TS0 - TS7, TS0 - TS8, TS0 - TS9, TS1 - TS2, TS1 - TS3, TS1 - TS4, TS1 - TS5, TS1 - TS6, TS1 - TS7, TS1 - TS8, TS1 - TS9, TS2 - TS3, TS2 - TS4, TS2 - TS5, TS2 - TS6, TS2 - TS7, TS2 - TS8, TS2 - TS9, TS3 - TS4, TS3 - TS5, TS3 - TS6, TS3 - TS7, TS3 - TS8, TS4 - TS5, TS5 - TS8, TS5 - TS9, TS6 - TS9, TS7 - TS9, nhưng lại không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường: TS3 - TS9, TS4 -TS6, TS4 - TS7, TS4 - TS8, TS4 - TS9, TS5 - TS6, TS5 - TS7, TS6 - TS7, TS6 -

34 TS8, TS7 - TS8, TS8 - TS9

Hình 3.1: Số chồi hình thành trên môi trường TS5 sau 2, 4, 6 tuần

Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng các môi trưởng đến hình thái chồi

Môi trường Đặc điểm hình thái của chồi

TS0 Chồi nhỏ, phát triển bình thường, có ít chồi mới hình thành

TS1 Vài cụm chồi được hình thành, phát triển tốt, có thể quan sát được

TS2 Chồi phát triển mạnh, kích thước khá lớn

TS3 Chồi phát triển mạnh có thể nhìn thấy nhiều cụm chồi

TS4 Chồi xanh, khỏe, phát triển mạnh, có chồi mới hình thành

TS5 Chồi xanh, khỏe, khá đồng đều, phát triển mạnh, có nhiều chồi mới

hình thành

TS6 Chồi xanh, khỏe, phát triển mạnh, có chồi mới hình thành

TS7 Chồi xanh tốt, có nhiều chồi mới tạo thành