Chuẩn bị phòng thí nghiệm - Luận văn công nghệ sin- 123docz.net

Khu vực rửa dụng cụ Khu vực khử trùng Khu vực chuẩn bị

Phòng cấy mô, cấy mẫu, quan sát và thu thập số liệu

Hình 2.1: Sơ đồ Phòng nuôi cấy mô, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường

2.1.2.2. Thiết bị và dụng cụ Phòng chuẩn bị: Máy cất nước 2 lần Nồi hấp vô trùng Tủ lạnh Bể rửa chai lọ Bếp điện

Bình chứa môi trường nuôi cấy, pipet, ống đong Cân phân tích 4 số ( chính xác đến 0,0001g) Cân kỹ thuật 2 số ( chính xác đến 0,01g) pH kế

Máy khuấy từ Tủ sấy 60 – 2000C

23 Phòng nuôi cấy:

Tủ cấy vô trùng, quạt thông gió, đèn tử ngoại treo tường. Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang

Máy điều hòa nhiệt độ

Các dụng cụ thao tác: Kẹp lớn, kẹp nhỏ, dao, đĩa petri, mâm inox, erlen, becher, bông gòn thấm nước. Tất cả đã được hấp khử trùng.

Hình 2.2: Nồi hấp autoclave Hình 2.3: Cân phân tích

2.1.2.3. Các thao tác trong phòng cấy

Trước khi đưa vào sử dụng buồng cấy cần được xử lí bằng hơi Formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự nhiên. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde dư bằng dung dịch NH3 25% trong 24 giờ. Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo…Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và một cốc đựng cồn 96 % để nhúng dụng cụ làm việc.

Trước khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 70º. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử ngoại treo trên trần.

Phòng cấy được khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực tím. Thời gian khử trùng tùy theo kích thước của phòng và đèn cực tím chỉ được sử dụng khi không có người. Tủ cấy thổi gió được khử trùng bằng cách mở quạt gió và lau tất cả các bề

mặt bằng cồn 95% trong 15 phút trước khi bắt đầu làm việc.

Lau cồn 70º các bình đựng môi trường, chai mẫu và các vật dụng khi đưa vào tủ cấy. Đốt các dụng cụ bằng cồn 96º sau mỗi lần thay đổi thao tác và gác lên kệ để nguội mới tiến hành tách hoặc cấy. Các mẫu cây bị rơi trên mặt bàn không được sử dụng cấy lại. Hơ kỹ miệng và nắp chai trước và sau khi cấy mẫu, thao tác cấy mẫu phải nhanh nhẹ. Khi cấy hạn chế vơ tay qua mẫu nhằm hạn chế nhiễm nấm. Tránh để tay mới lau cồn gần đèn cồn khi đang cháy. Mẫu sau khi được cấy vào bình, dùng bút lông ghi lại tên giống và ngày cấy, tên người cấy. Ghi lại các thông tin này trong sổ thí nghiệm. Vệ sinh sạch sẽ tủ cấy bằng cồn 70º sau khi kết thúc công việc.

2.1.2.4. Điều kiện

Nhiệt độ phòng nuôi mô và cây in vitro là 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40%. Giàn nuôi cấy gồm 3 tầng, kích thước mỗi tầng là 30×120cm, mỗi tàng cách nhau 25cm.

2.2. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Các chất hóa học sử dụng trong quá trình Nuôi cấy mô được nhập khẩu từ Merck KgaA – Đức với độ tinh khiết 98%.

2.2.1. Môi trường Knudson C

Bảng 2.1: Thành phần môi trường Knudson C

Thành phần Nồng độ ( mg/l)

Thành phần Nồng độ (mg/l)

1. Khoáng đa lượng

Ca(NO3)2.4H2O KH2PO4 MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 1000 250 250 500 2. Khoáng vi lượng FeSO4.7H2O MnSO4. 4H2O 7.5 25 Với các thành phần khoáng đa lượng thì tiến hành pha thành 4 dung dịch mẹ. Tiến hành pha riêng cho từng chất để tránh kết tủa trong thời gian dài sử dụng. Mỗi dung dịch mẹ pha thành 250 ml. Nồng độ khi cho vào môi trường là 25ml/l.

25 Khoáng đa lượng I: Ca(NO3)2.4H2O Khoáng đa lượng II: KH2PO4

Khoáng đa lượng III: MgSO4.7H2O Khoáng đa lượng IV: (NH4)2SO4

Các thành phần vi lượng tiến hành pha chung thành 1 lít và nồng độ dùng trong môi trường nuôi cấy là 10ml/l gồm: FeSO4.7H2O và MnSO4. 4H2O.

2.2.2. Các chất điều hòa sinh trưởng

Dung dịch BAP (1mg/ml): Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong 5ml NaOH 1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100 ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg BAP

Dung dịch Kinetin (1mg/ml): Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5 ml NaOH 1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg KIN.

Dung dịch NAA (1mg/ml): Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5ml NaOH 1N. Cho thêm nước cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg NAA.

Dung dịch 2,4 - D (1mg/ml): Cân 100mg 2,4 - D (2,4 - dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan trong 50ml ethanol 50%. Cho thêm nước cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg 2,4-D.

Dung dịch Thiamin – HCl (B1) (10 mg/ml): Cân 1000mg B1 hòa tan trong nước cất cho đủ 100ml.

Dung dịch GA3 (1mg/ml): Cân 100mg GA3 hòa tan trong 50ml ethanol 50%. Cho thêm nước cất cho đủ 100ml. Mỗi ml dung dịch có chứa 1mg GA3.

2.2.3. Dịch chiết khoai tây.

Cân 100 g khoai tây đã rửa sạch, gọt vỏ. Xay nhuyễn, lọc lấy dịch chiết. Thêm nước cho đủ 100 ml.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành với ba nội dung nghiên cứu. Các nội dung nghiên cứu được giải quyết lần lượt qua các thí nghiệm.

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới môi trường nhân chồi.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới môi trường tạo rễ.

2.3.2. Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm trong đề tài được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với nghiệm thức.

2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi.

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái sinh chồi.

Vật liệu:

Các đốt thân (có chứa chồi ngủ) lan Gấm in vitro từ 1 - 1,5 cm. Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại). Dung tích mỗi bình là 500 ml, thể tích môi trường là 65 ml/ bình. Thời gian theo dõi: 6 tuần

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40%.

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,2 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml/l dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.2: Nồng độ BAP, Kinetin, GA3 trong môi trường tái sinh chồi

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tái sinh, số chồi, hình thái chồi sau 2, 4, 6 tuần.

2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA, B1 đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự nhân chồi.

Vật liệu:

Chồi non được tái sinh từ thí nghiệm 1. Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại). Dung tích mỗi bình là 500ml, thể

CĐHSTTV

Môi trường BAP (ppm ) Kinetin (ppm ) GA3 (ppm)

TS0 (Đối chứng) 0 0 0 TS1 0 0,2 0,1 TS2 0,5 0 0,1 TS3 1,0 0,2 0 TS4 1,5 0,2 0,1 TS5 2,0 0,2 0,1 TS6 2,5 0,2 0,1 TS7 3,0 0,2 0,1 TS8 3,5 0,2 0,1 TS9 4,0 0,2 0,1

tích môi trường là 65ml/ bình. Thời gian theo dõi: 6 tuần

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.3: Nồng độ BAP, NAA, B1 trong môi trường nhân nhanh chồi

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo chồi, số chồi, chiều dài chồi, đặc điểm chồi.

CĐHSTTV

Môi trường BAP ( ppm ) NAA (ppm ) B1 (ppm )

KC0 (Đối chứng) 0 0 0 KC1 0 0,1 0,25 KC2 0,1 0 0,25 KC3 0,15 0,1 0,25 KC4 0,2 0,1 0,25 KC5 0,25 0,1 0,25 KC6 0,3 0,1 0,25 KC7 0,35 0,1 0,25 KC8 0,4 0,1 0,25 KC9 0,45 0,1 0,25

2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ

Mục đích: Khảo sát và tìm ra các khoảng nồng độ cũng như các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự phát sinh rễ lan Gấm trong điều kiện in vitro.

Vật liệu:

Các chồi xanh tốt từ 4 - 5 cm thu được ở thí nghiệm 2 Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại). Dung tích mỗi bình là 500ml, thể tích môi trường là 65ml/ bình. Thời gian theo dõi: 6 tuần

Bảng 2.4: Nồng độ NAA, BAP trong môi trường phát sinh rễ

CĐHST

Môi trường NAA (ppm) BAP (ppm)

ĐC0 0 0 KR1 0 0,2 KR2 0,2 0 KR3 0,3 0,2 KR4 0,4 0,2 KR5 0,5 0,2 KR6 0,6 0,2

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ tái sinh được trên mỗi chồi sau 2, 4, 6 tuần

2.3.3. Xử lý số liệu:

Số liệu thô được thống kê bằng phần mềm Excel 2010, sau đó được xử lý bằng phần mềm của chương trình thống kê STATGRAPHICS.

KR7 0,7 0,2

KR8 0,8 0,2

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ

3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi.

Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn

Sau 2 tuần nuôi cấy, hầu như trên tất cả các môi trường đều phát sinh chồi, có sự chênh lệch hệ số nhân chồi giữa các nghiệm thức nhưng không nhiều. Các mẫu đều tái sinh từ 1-2 chồi.

Trên môi trường TS0 không bổ sung thêm CĐHSTTV, nhưng sau 2 tuần nuôi cấy thì một số mẫu vẫn hình thành chồi tuy nhiên chồi hình thành chậm hơn so với các môi trường khác. Chứng tỏ ngoài nguồn hoocmon kích thích sinh trưởng nội sinh có trong mẫu, hàm lượng khoáng Knudson C và nguồn carbonhydrat có trong môi trường đã kích thích sự phân chia tế bào và sự phát sinh hình thái dẫn đến sự phát sinh chồi. [12]

Tuy hệ số chồi không chênh lệch nhiều nhưng vẫn có thể thấy TS5 có số chồi nhiều nhất đạt 2,23 chồi/ mẫu cấy. Cho thấy ở nồng độ BAP 2,0 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm mẫu có tỉ lệ cảm ứng tái sinh chồi nhanh nhất.

Sau 4 tuần nuôi cấy, đã có sự chênh lệch lớn giữa các nghiệm thức. Số chồi đều tăng ở tất cả các nghiệm thức, nhưng hệ số tăng khác nhau đã tạo nên sự khác biệt rõ rệt thể hiện trên biểu đồ.

Số chồi ở môi trường TS0 là thấp nhất đạt 1,2 chồi/ mẫu cấy. Số chồi ở môi trường TS4 là cao nhất đạt 4,1 chồi/ mẫu, kế đến là TS5 đạt 3,95 chồi/ mẫu. Ở giai đoạn này TS4 với nồng độ BAP 1,5 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm là môi trường có hệ số tái sinh chồi cao nhất, vượt qua TS5, nhưng chồi phát triển không đồng đều giữa các chồi trong cùng một mẫu và giữa các mẫu trong cùng nghiệm thức.

Sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi ở các nghiệm thức tăng so với 2 tuần trước đó. Số chồi ở TS0 vẫn ở mức thấp nhất 1,42 chồi/ mẫu cấy. TS5 cao nhất 5,27 chồi/ mẫu cấy. Tiếp đến là TS6 với 5,07 chồi/ mẫu cấy.

Ở môi trường TS1 (chỉ bổ sung 0,2 ppm KIN và 0,1 ppm GA3) và TS2 (chỉ bổ sung 0,5 ppm BAP và 0,1 ppm GA3) số chồi và hình thái chồi được hình thành chênh lệch nhau không đáng kể, do BAP và KIN đều thuộc nhóm Cytokinin nên có hoạt tính tương tự nhau ở nồng độ khác nhau.

Ở TS3, chỉ bổ sung 1,0 ppm BAP và 0,1 ppm KIN với nồng độ cao hơn nghiệm thức trên, số chồi tăng, chồi khá lớn nhưng các chồi hình thành riêng lẻ, không phát triển thành cụm.

Ở nồng độ BAP 2,0 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm TS5 cho hệ số tái sinh chồi cao nhất vượt qua TS4 (1,5 ppm BAP và 0,2 ppm KIN) so với 2 tuần trước đó. Cho thấy sau 4 tuần nuôi cấy TS4 cho hệ số nhân chồi cao nhất, nhưng sau 2 tuần nữa thì lượng hoocmon sinh trưởng không đủ để mẫu tiếp tục tăng vượt trội về hệ số nhân chồi.

Từ biểu đồ cho thấy số chồi được tái sinh phụ thuộc vào nồng độ CĐHSTTV, khi nồng độ tăng thì số chồi tăng, nhưng đến giới hạn nhất định thì số chồi bắt đầu giảm xuống, ưu tiên phát triển hình thái khác, tạo thành pha tăng trưởng và pha suy thoái.

TS6, TS7, TS8, TS9 nồng độ BAP tăng lên từ 2,5 – 4 ppm tỉ lệ nghịch với số chồi. Tuy số chồi giảm không nhiều nhưng cũng thể hiện được ngưỡng phát triển chồi của BAP đang suy thoái.

Khoảng nồng độ BAP từ 1,5 tới 3,5 ppm ở TS4 - TS8 là tốt nhất cho sự tái sinh chồi với tỉ lệ mẫu tái sinh 70 - 93%. Trong đó TS5 là môi trường tối ưu để tái sinh chồi với tỉ lệ mẫu sống sót 98%, tỉ lệ mẫu tái sinh chồi 93%, số chồi tái sinh đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy.

TS0 TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 TS6 TS7 TS8 TS9

Means and 95.0 Percent LSD Intervals

MOI TRUONG 0 1 2 3 4 5 6 S O CH O I

Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy

Theo kết quả bảng phân tích Anova (bảng 1 phụ lục) ảnh hưởng của môi trường lên số chồi của lan Gấm, cho thấy giá trị P -Value bằng 0,0000 < 0,05 như vậy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở độ tin cậy 95%. Điều này cho biết có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường tác động đến số chồi tái sinh của lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata ở độ tin cậy 95%.

Kết quả trắc nghiệm LSD (bảng 2 phụ lục) ảnh hưởng của môi trường lên số chồi đạt được cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trườngnhư: TS0 - TS1, TS0 - TS2, TS0 - TS3, TS0 - TS4, TS0 - TS5, TS0 - TS6, TS0 - TS7, TS0 - TS8, TS0 - TS9, TS1 - TS2, TS1 - TS3, TS1 - TS4, TS1 - TS5, TS1 - TS6, TS1 - TS7, TS1 - TS8, TS1 - TS9, TS2 - TS3, TS2 - TS4, TS2 - TS5, TS2 - TS6, TS2 - TS7, TS2 - TS8, TS2 - TS9, TS3 - TS4, TS3 - TS5, TS3 - TS6, TS3 - TS7, TS3 - TS8, TS4 - TS5, TS5 - TS8, TS5 - TS9, TS6 - TS9, TS7 - TS9, nhưng lại không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường: TS3 - TS9, TS4 - TS6, TS4 - TS7, TS4 - TS8, TS4 - TS9, TS5 - TS6, TS5 - TS7, TS6 - TS7, TS6 -

34 TS8, TS7 - TS8, TS8 - TS9.