Dịch chiết khoai tây

Cân 100 g khoai tây đã rửa sạch, gọt vỏ. Xay nhuyễn, lọc lấy dịch chiết. Thêm nước cho đủ 100 ml.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành với ba nội dung nghiên cứu. Các nội dung nghiên cứu được giải quyết lần lượt qua các thí nghiệm.

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA tới môi trường nhân chồi.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới môi trường tạo rễ.

2.3.2. Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm trong đề tài được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với nghiệm thức.

2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi.

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái sinh chồi.

Vật liệu:

Các đốt thân (có chứa chồi ngủ) lan Gấm in vitro từ 1 - 1,5 cm. Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại). Dung tích mỗi bình là 500 ml, thể tích môi trường là 65 ml/ bình. Thời gian theo dõi: 6 tuần

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi cấy 24 ± 20C, sử dụng đèn huỳnh quang, ánh sáng trắng, cường độ sáng từ 1800 – 2000 lux. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày, ẩm độ không khí phòng thí nghiệm duy trì từ 30% - 40%.

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,2 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml/l dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.2: Nồng độ BAP, Kinetin, GA3 trong môi trường tái sinh chồi

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tái sinh, số chồi, hình thái chồi sau 2, 4, 6 tuần.

2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA, B1 đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng và tìm ra các khoảng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự nhân chồi.

Vật liệu:

Chồi non được tái sinh từ thí nghiệm 1. Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại). Dung tích mỗi bình là 500ml, thể

CĐHSTTV

Môi trường BAP (ppm ) Kinetin (ppm ) GA3 (ppm)

TS0 (Đối chứng) 0 0 0 TS1 0 0,2 0,1 TS2 0,5 0 0,1 TS3 1,0 0,2 0 TS4 1,5 0,2 0,1 TS5 2,0 0,2 0,1 TS6 2,5 0,2 0,1 TS7 3,0 0,2 0,1 TS8 3,5 0,2 0,1 TS9 4,0 0,2 0,1

tích môi trường là 65ml/ bình. Thời gian theo dõi: 6 tuần

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; 8 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau:

Bảng 2.3: Nồng độ BAP, NAA, B1 trong môi trường nhân nhanh chồi

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo chồi, số chồi, chiều dài chồi, đặc điểm chồi.

CĐHSTTV

Môi trường BAP ( ppm ) NAA (ppm ) B1 (ppm )

KC0 (Đối chứng) 0 0 0 KC1 0 0,1 0,25 KC2 0,1 0 0,25 KC3 0,15 0,1 0,25 KC4 0,2 0,1 0,25 KC5 0,25 0,1 0,25 KC6 0,3 0,1 0,25 KC7 0,35 0,1 0,25 KC8 0,4 0,1 0,25 KC9 0,45 0,1 0,25

2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp NAA, BAP tới sự phát sinh rễ

Mục đích: Khảo sát và tìm ra các khoảng nồng độ cũng như các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự phát sinh rễ lan Gấm trong điều kiện in vitro.

Vật liệu:

Các chồi xanh tốt từ 4 - 5 cm thu được ở thí nghiệm 2 Số lượng mẫu cấy: 6 mẫu/ bình

Mỗi nghiệm thức pha 3 bình (3 lần lặp lại). Dung tích mỗi bình là 500ml, thể tích môi trường là 65ml/ bình. Thời gian theo dõi: 6 tuần

Bảng 2.4: Nồng độ NAA, BAP trong môi trường phát sinh rễ

CĐHST

Môi trường NAA (ppm) BAP (ppm)

ĐC0 0 0 KR1 0 0,2 KR2 0,2 0 KR3 0,3 0,2 KR4 0,4 0,2 KR5 0,5 0,2 KR6 0,6 0,2

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ tái sinh được trên mỗi chồi sau 2, 4, 6 tuần

2.3.3. Xử lý số liệu:

Số liệu thô được thống kê bằng phần mềm Excel 2010, sau đó được xử lý bằng phần mềm của chương trình thống kê STATGRAPHICS.

KR7 0,7 0,2

KR8 0,8 0,2

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ

3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi.

Biểu đồ 3.1: Số chồi tái sinh qua các giai đoạn

Sau 2 tuần nuôi cấy, hầu như trên tất cả các môi trường đều phát sinh chồi, có sự chênh lệch hệ số nhân chồi giữa các nghiệm thức nhưng không nhiều. Các mẫu đều tái sinh từ 1-2 chồi.

Trên môi trường TS0 không bổ sung thêm CĐHSTTV, nhưng sau 2 tuần nuôi cấy thì một số mẫu vẫn hình thành chồi tuy nhiên chồi hình thành chậm hơn so với các môi trường khác. Chứng tỏ ngoài nguồn hoocmon kích thích sinh trưởng nội sinh có trong mẫu, hàm lượng khoáng Knudson C và nguồn carbonhydrat có trong môi trường đã kích thích sự phân chia tế bào và sự phát sinh hình thái dẫn đến sự phát sinh chồi. [12]

Tuy hệ số chồi không chênh lệch nhiều nhưng vẫn có thể thấy TS5 có số chồi nhiều nhất đạt 2,23 chồi/ mẫu cấy. Cho thấy ở nồng độ BAP 2,0 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm mẫu có tỉ lệ cảm ứng tái sinh chồi nhanh nhất.

Sau 4 tuần nuôi cấy, đã có sự chênh lệch lớn giữa các nghiệm thức. Số chồi đều tăng ở tất cả các nghiệm thức, nhưng hệ số tăng khác nhau đã tạo nên sự khác biệt rõ rệt thể hiện trên biểu đồ.

Số chồi ở môi trường TS0 là thấp nhất đạt 1,2 chồi/ mẫu cấy. Số chồi ở môi trường TS4 là cao nhất đạt 4,1 chồi/ mẫu, kế đến là TS5 đạt 3,95 chồi/ mẫu. Ở giai đoạn này TS4 với nồng độ BAP 1,5 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm là môi trường có hệ số tái sinh chồi cao nhất, vượt qua TS5, nhưng chồi phát triển không đồng đều giữa các chồi trong cùng một mẫu và giữa các mẫu trong cùng nghiệm thức.

Sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi ở các nghiệm thức tăng so với 2 tuần trước đó. Số chồi ở TS0 vẫn ở mức thấp nhất 1,42 chồi/ mẫu cấy. TS5 cao nhất 5,27 chồi/ mẫu cấy. Tiếp đến là TS6 với 5,07 chồi/ mẫu cấy.

Ở môi trường TS1 (chỉ bổ sung 0,2 ppm KIN và 0,1 ppm GA3) và TS2 (chỉ bổ sung 0,5 ppm BAP và 0,1 ppm GA3) số chồi và hình thái chồi được hình thành chênh lệch nhau không đáng kể, do BAP và KIN đều thuộc nhóm Cytokinin nên có hoạt tính tương tự nhau ở nồng độ khác nhau.

Ở TS3, chỉ bổ sung 1,0 ppm BAP và 0,1 ppm KIN với nồng độ cao hơn nghiệm thức trên, số chồi tăng, chồi khá lớn nhưng các chồi hình thành riêng lẻ, không phát triển thành cụm.

Ở nồng độ BAP 2,0 ppm, Kinetin 0,2 ppm, GA3 0,1 ppm TS5 cho hệ số tái sinh chồi cao nhất vượt qua TS4 (1,5 ppm BAP và 0,2 ppm KIN) so với 2 tuần trước đó. Cho thấy sau 4 tuần nuôi cấy TS4 cho hệ số nhân chồi cao nhất, nhưng sau 2 tuần nữa thì lượng hoocmon sinh trưởng không đủ để mẫu tiếp tục tăng vượt trội về hệ số nhân chồi.

Từ biểu đồ cho thấy số chồi được tái sinh phụ thuộc vào nồng độ CĐHSTTV, khi nồng độ tăng thì số chồi tăng, nhưng đến giới hạn nhất định thì số chồi bắt đầu giảm xuống, ưu tiên phát triển hình thái khác, tạo thành pha tăng trưởng và pha suy thoái.

TS6, TS7, TS8, TS9 nồng độ BAP tăng lên từ 2,5 – 4 ppm tỉ lệ nghịch với số chồi. Tuy số chồi giảm không nhiều nhưng cũng thể hiện được ngưỡng phát triển chồi của BAP đang suy thoái.

Khoảng nồng độ BAP từ 1,5 tới 3,5 ppm ở TS4 - TS8 là tốt nhất cho sự tái sinh chồi với tỉ lệ mẫu tái sinh 70 - 93%. Trong đó TS5 là môi trường tối ưu để tái sinh chồi với tỉ lệ mẫu sống sót 98%, tỉ lệ mẫu tái sinh chồi 93%, số chồi tái sinh đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy.

TS0 TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 TS6 TS7 TS8 TS9

Means and 95.0 Percent LSD Intervals

MOI TRUONG 0 1 2 3 4 5 6 S O CH O I

Biểu đồ 3.2: Biểu diễn số chồi tái sinh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy

Theo kết quả bảng phân tích Anova (bảng 1 phụ lục) ảnh hưởng của môi trường lên số chồi của lan Gấm, cho thấy giá trị P -Value bằng 0,0000 < 0,05 như vậy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở độ tin cậy 95%. Điều này cho biết có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường tác động đến số chồi tái sinh của lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata ở độ tin cậy 95%.

Kết quả trắc nghiệm LSD (bảng 2 phụ lục) ảnh hưởng của môi trường lên số chồi đạt được cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trườngnhư: TS0 - TS1, TS0 - TS2, TS0 - TS3, TS0 - TS4, TS0 - TS5, TS0 - TS6, TS0 - TS7, TS0 - TS8, TS0 - TS9, TS1 - TS2, TS1 - TS3, TS1 - TS4, TS1 - TS5, TS1 - TS6, TS1 - TS7, TS1 - TS8, TS1 - TS9, TS2 - TS3, TS2 - TS4, TS2 - TS5, TS2 - TS6, TS2 - TS7, TS2 - TS8, TS2 - TS9, TS3 - TS4, TS3 - TS5, TS3 - TS6, TS3 - TS7, TS3 - TS8, TS4 - TS5, TS5 - TS8, TS5 - TS9, TS6 - TS9, TS7 - TS9, nhưng lại không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường: TS3 - TS9, TS4 - TS6, TS4 - TS7, TS4 - TS8, TS4 - TS9, TS5 - TS6, TS5 - TS7, TS6 - TS7, TS6 -

34 TS8, TS7 - TS8, TS8 - TS9.

Hình 3.1: Số chồi hình thành trên môi trường TS5 sau 2, 4, 6 tuần

Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng các môi trưởng đến hình thái chồi

Môi trường Đặc điểm hình thái của chồi

TS0 Chồi nhỏ, phát triển bình thường, có ít chồi mới hình thành

TS1 Vài cụm chồi được hình thành, phát triển tốt, có thể quan sát được.

TS2 Chồi phát triển mạnh, kích thước khá lớn.

TS3 Chồi phát triển mạnh có thể nhìn thấy nhiều cụm chồi.

TS4 Chồi xanh, khỏe, phát triển mạnh, có chồi mới hình thành.

TS5 Chồi xanh, khỏe, khá đồng đều, phát triển mạnh, có nhiều chồi mới

hình thành.

TS6 Chồi xanh, khỏe, phát triển mạnh, có chồi mới hình thành.

TS7 Chồi xanh tốt, có nhiều chồi mới tạo thành.

TS8

Chồi phát triển mạnh, có nhiều chồi mới hình thành, có những cá thể chồi phát triển cao vượt trội.

TS9 Chồi cao, khỏe, phát triển tốt.

Từ bảng 3.1, môi trường TS 5 cho kết quả hình thái chồi tốt nhất, phù hợp làm nguyên liệu cho quá trình nhân chồi. Kết hợp các chỉ tiêu theo dõi, chọn môi trường TS5 là môi trường phù hợp nhất tái sinh chồi.

3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA, B1 đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân nhanh chồi và phát triển chồi

Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân chồi là khá rõ rệt. Nồng độ các CĐHST khác nhau thì kết quả sự nhân chồi cũng khác nhau.

Trong môi trường đối chứng KC0, tuy không bổ sung CĐHSTTV, mẫu cấy vẫn sống và tạo chồi, nhưng hệ số tạo chồi không cao, quá trình tạo chồi chậm do bản thân mẫu cấy đã có sẵn hàm lượng hoocmon nội sinh nhất định và trong môi trường khoáng bổ sung thêm các chất hữu cơ không rõ thành phần như nước dừa, dịch chiết khoai tây… có hoạt tính đã kích thích tạo chồi.

Đối với những môi trường có bổ sung CĐHSTTV, khả năng tạo chồi mới cao hơn hẳn và quá trình tạo chồi cũng diễn ra nhanh hơn.

Trong môi trường KC1, bổ sung 0,1 ppm NAA, 0,25 ppm B1 hệ số nhân chồi thấp, nhưng chồi phát triển tốt, chồi mập, lá tươi tốt. Từ đó có thể thấy NAA kích thích sự dãn nở tế bào chủ yếu theo chiều ngang.

Trong môi trường KC2, bổ sung 0,1 ppm BAP, 0,25 ppm B1 hệ số nhân chồi 0 1 2 3 4 5 6 7 KC0 KC1 KC2 KC3 KC4 KC5 KC6 KC7 KC8 KC9 số chồi chiều cao chồi (cm)

tăng rõ rệt so với 2 nghiệm thức trên, chồi cao, ốm, lá xoắn. Từ đó có thể thấy được ảnh hưởng của NAA trong phát triển hình thái lá.

Từ môi trường KC3 đến KC7, nồng độ BAP tăng từ 0,15 – 0,35 ppm tỉ lệ thuận với hệ số nhân chồi, chồi phát triển tốt, khỏe. Từ đó cho thấy nồng độ BAP có ảnh hưởng tới hệ số nhân chồi.

KC8 đạt hệ số nhân chồi bằng với KC7, mặc dù nồng độ BAP ở KC8 cao hơn KC7 0,05 ppm. Chiều cao trung bình của chồi tương đương nhau.

Ở KC9 hệ số nhân chồi giảm nhẹ, báo hiệu ngưỡng tối ưu kết thúc, tuy nhiên chiều cao trung bình của chồi lại tăng vượt trội so với tất cả các nghiệm thức trên.

Khoảng nồng độ BAP từ 0,35 – 0,45 ppm là tốt nhất cho sự phát sinh chồi với số chồi hình thành đạt 5,33 – 5,55 chồi/ mẫu cấy. Trong đó KC7 là môi trường thích hợp nhất với tỉ lệ mẫu sống sót 98%, tỉ lệ mẫu tạo chồi 96%, số chồi tạo thành 5,55 chồi/ mẫu cấy, chiều cao trung bình của chồi 5,7 cm.

KC0 KC1 KC2 KC3 KC4 KC5 KC6 KC7 KC8 KC9

Means and 95.0 Percent LSD Intervals

MOI TRUONG 0 1 2 3 4 5 6 S O C H O I

Biểu đồ 3.4: Biểu diễn số chồi nhân nhanh phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Từ kết quả bảng phân tích phương sai cho thấy P -Value bằng 0,0000 < 0,05. Vì vậy, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở độ tin cậy 95%. Điều này cho biết rằng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các môi trường đến quá trình tạo chồi của mẫu cấy lan Gấm ở độ tin cậy 95%.

thống kê giữa các môi trường: KC0 - KC2, KC0 - KC3, KC0 - KC4, KC0 - KC5, KC0 - KC6, KC0 - KC7, KC0 - KC8, KC0 - KC9, KC1 - KC2, KC1 - KC3, KC1 - KC4, KC1 - KC5, KC1 - KC6, KC1 - KC7, KC1 - KC8, KC1 - KC9, KC2 - KC3, KC2 - KC4, KC2 - KC5, KC2 - KC6, KC2 - KC7, KC2 - KC8, KC2 - KC9, KC3 - KC4, KC3 - KC5, KC3 - KC6, KC3 - KC7, KC3 - KC8, KC3 - KC9, KC4 - KC6, KC4 - KC7, KC4 - KC8, KC4 - KC9, KC5 – KC6, KC5 - KC7, KC5 - KC8, KC5 -

Chuẩn bị phòng thí nghiệm

Các thao tác trong phòng cấy