VI NHÂN GIỐNG LAN GẤM ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA Lê Linh Dung1, Nguyễn Thị Kiều Linh2 linhdungsh@gmail.com1 ,nguyenkieulinh9x@gmail.com2 Khoa công nghệ sinh học – Môi trường, Đại học Lạc Hồng, Biên Hịa, Đồng Nai Tóm tắt: Đề tài: “Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata” khảo sát vai trò chất điều hòa sinh trưởng đến tái sinh lan Gấm hoàn chỉnh điều kiện in vitro Môi trường TS5 sử dụng môi trường Knudson C có bở sung ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin + 0,1 ppm GA3 thích hợp cho tái sinh chồi Kết đạt 94,3 % số lượng mẫu tái sinh Môi trường KC7 sử dụng môi trường Knudson C có bở sung 0,35 ppm BAP + 0,1 ppm NAA + 0,25 ppm B1 thích hợp cho nhân chồi Kết đạt 96,2 % số lượng mẫu tái sinh với 5,55 chồi/ mẫu Các chồi có chiều cao từ - 5cm sử dụng để rễ in vitro Tỷ lệ rễ 98,1 % số rễ/ mẫu ( 4,5 rễ/ mẫu) cao mơi trường có bở sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP Từ khóa: Lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata, nhân giống invitro ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát triển y học cổ truyền đặc biệt Đông y Trung Quốc khiến cho lan Gấm, đặc biệt loài lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata trở thành loài dược liệu quý Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata tươi khô nấu nước uống trị chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lách chứng đau nhói ngực (Lin Wu 2007) Đại học Công nghệ Y dược Cao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan sử dụng A formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược thể kháng virus cúm A A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức tim mạch Dịch chiết A formosanus Hayata có khả kháng virus, kháng sưng viêm bảo vệ gan (Takatsuki, 1992) Ngoài thị trường cịn có số thực phẩm chức chiết xuất từ lan Gấm có tác dụng mát gan giải độc, tăng cường sức khỏe…Ở Việt Nam lan Gấm chủ yếu dùng làm cảnh, chưa có tài liệu nghiên cứu chưa dùng làm thuốc Với nhu cầu nguyên liệu lớn, Trung Quốc tận thu nguồn lan Gấm khu vực Đông Nam Á mà chủ yếu Việt Nam Lan Gấm tươi thu mua từ 200 – 300 USD/ kg (thân, rễ, lá, hoa), khơ có giá 3.200 USD/ kg, thu hái tự nhiên giá cao gấp lần Với giá trị kinh tế cao dẫn đến việc khai thác mức nguồn nguyên liệu khiến lan Gấm đứng trước nguy tuyệt chủng Nhận thức tiềm năng, giá trị kinh tế loài lan này, nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống lồi lan Gấm điều kiện in vitro đời Chen ZY cs (1992) nghiên cứu mơi trường thích hợp rễ lan Gấm mơi trường ½ MS + 0,7 μg/l NAA Nồng độ BA 1,0 – 2,0 μg/l, IBA 0,5 – 0,7μg/l, 0,1 – 0,5 μg/l zeatin cho chồi phát triển tốt Fan Zinan cs (1997) nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đối với phát triển rễ lan Gấm, kết cho thấy bổ sung 0,2% than hoạt tính giúp rễ phát triển tốt, lão hóa chậm Wang Yaying, Linrong Yao (2005) bổ sung 3,5 ppm BA, 0,5 ppm KT, 0,2 ppm NAA vào mơi trường ½ MS tốt cho phát triển rễ lan Gấm Phùng Văn Phê cs (2010) nghiên cứu môi trường phù hợp để nhân nhanh chồi Lan kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl in vitro Knudson C Thể chồi tuần tuổi từ phơi hạt chín, cao 2-3 cm phù hợp để nhân nhanh mơi trường có bổ sung 0,5 ppm BAP + 0,3 ppm Kinetin + 0,3 ppm Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012) nghiên cứu xác định mơi trường thích hợp để nhân nhanh thể chồi mắt đốt ngang thân lan Kim Tuyến - Anoectochilus setaceus Blume Knudson C bổ sung 0,5 ppm BAP + 0,3 ppm Kinetin + 0,3 ppm αNAA Những nghiên cứu đóng góp thiết thực khơi phục bảo tồn nhiều lồi lan Gấm Tuy nhiên, Việt Nam lồi Anoectochilus formosanus - Lồi có giá trị thương mại cao giới chưa quan tâm nghiên cứu Đề tài “Vi nhân giống lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata” thực với mục đích nhân nhanh số lượng lớn lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata in vitro làm sở cho việc nhân nhanh nguồn vật liệu khởi đầu cung cấp sở khoa học nhằm khôi phục lại nguồn giống đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước xuất PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài thực Phịng thí nghiệm Ni cấy mơ trường Đại học Lạc Hồng, thời gian từ 07/2013 - 11/2013 Đề tài “Vi nhân giống lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata” nghiên cứu tái sinh chồi, nhân chồi tái sinh rễ tiến hành qua thí nghiệm, thí nghiệm gồm 10 nghiệm thức, lặp lại lần có nghiệm thức đối chứng Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên Điều kiện ni cấy tất thí nghiệm giống Nhiệt độ nuôi cấy 24 ± 20 C, sử dụng đèn huỳnh quang ánh sáng trắng, cường độ chiếu sáng 1800 - 2000 lux, chiếu sáng 16h/ ngày, pH môi trường 5,5 – 5,8 Tiến hành xác định số chồi, đặc điểm chồi, số rễ, đặc điểm rễ tạo thành sau lần cấy chuyền Số liệu thô thống kê phần mềm Excel 2010, sau xử lý phần mềm chương trình thống kê STATGRAPHICS Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng tìm khoảng nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thích hợp cho tái sinh chồi Vật liệu: Các đốt thân lan Gấm nuôi cấy điều kiện in vitro Số lượng mẫu cấy: mẫu/ bình Mỗi nghiệm thức pha bình (3 lần lặp lại) Dung tích bình 500 ml, thể tích mơi trường 65 ml/ bình Thời gian theo dõi: tuần Môi trường ni cấy: Sử dụng mơi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,2 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml/l dịch chiết khoai tây; g/l agar bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau: Bảng 1: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật môi trường tái sinh chồi CĐHSTTV Môi trường BAP (ppm) Kinetin (ppm) GA3 (ppm) TS0 (Đối chứng) 0 TS1 0,2 0,1 TS2 0,5 0,1 TS3 1,0 0,2 TS4 1,5 0,2 0,1 TS5 2,0 0,2 0,1 TS6 2,5 0,2 0,1 TS7 3,0 0,2 0,1 TS8 3,5 0,2 0,1 TS9 4,0 0,2 0,1 Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tái sinh, số chồi, hình thái chồi sau 2, 4, tuần Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp BAP, NAA, B1 đến phát sinh hình thái hệ số nhân chồi Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng tìm khoảng nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thích hợp cho nhân chồi Vật liệu: Chồi non tái sinh từ thí nghiệm Số lượng mẫu cấy: mẫu/ bình Mỗi nghiệm thức pha bình (3 lần lặp lại) Dung tích bình 500ml, thể tích mơi trường 65ml/ bình Thời gian theo dõi: tuần Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; g/l agar bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau: Bảng 2: Nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thực vật mơi trường nhân nhanh chồi CĐHSTTV BAP ( ppm) Môi trường NAA (ppm) B1(ppm) KC0 (Đối chứng) 0 KC1 0,1 0,25 KC2 0,1 0,25 KC3 0,15 0,1 0,25 KC4 0,2 0,1 0,25 KC5 0,25 0,1 0,25 KC6 0,3 0,1 0,25 KC7 0,35 0,1 0,25 KC8 0,4 0,1 0,25 KC9 0,45 0,1 0,25 Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo chồi, số chồi, chiều dài chồi, đặc điểm chồi Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp NAA, BAP tới phát sinh rễ Mục đích: Khảo sát tìm khoảng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho phát sinh rễ lan Gấm điều kiện in vitro Vật liệu: Các chồi xanh tốt thu thí nghiệm thí nghiệm Số lượng mẫu cấy: mẫu/ bình Mỗi nghiệm thức pha bình (3 lần lặp lại) Dung tích bình 500 ml, thể tích mơi trường 65 ml/ bình Thời gian theo dõi: tuần Môi trường ni cấy: Sử dụng mơi trường Knudson C có bổ sung: 20 g/l sucrose; 0,5 g/l than hoạt tính; 150 ml/l nước dừa; 100 ml dịch chiết khoai tây; g/l agar bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo bảng sau: Bảng 3: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật môi trường phát sinh rễ CĐHST NAA ( ppm) BAP ( ppm) KR0 0 KR1 0,2 KR2 0,2 KR3 0,3 0,2 KR4 0,4 0,2 KR5 0,5 0,2 KR6 0,6 0,2 KR7 0,7 0,2 KR8 0,8 0,2 KR9 0,9 0,2 Môi trường Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống sót, số mẫu tạo rễ, số rễ chiều dài rễ tái sinh chồi sau 2, 4, tuần KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp BAP, Kinetin, GA3 tới môi trường tái sinh chồi Mẫu in vitro cắt thành đoạn có chứa đốt thân cấy vào môi trường khảo sát Kết sau tuần nuôi cấy thể bảng 4 Bảng 4: Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến tái sinh chồi hình thái chồi Mơi trường Số mẫu cấy Số mẫu sống sót Số mẫu tái sinh Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tổng số chồi tái sinh Số chồi / mẫu TS0 54 44 34 77,3 48 1,41 TS1 54 44 36 81,8 104 2,89 TS2 54 45 38 84,4 129 3,4 TS3 54 46 40 86,9 165 4,13 TS4 54 48 45 93,75 211 4,68 TS5 54 53 50 94,3 264 5,27 TS6 54 50 41 82 208 5,07 TS7 54 49 40 81,6 197 4,94 TS8 54 47 38 80,8 177 4,66 TS9 54 46 37 80,4 160 4,33 Kết thí nghiệm sau tuần cho thấy nghiệm thức TS5 gồm Knudson C + 2,0 ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin + 0,1 ppm GA3 cho tỉ lệ tái sinh chồi cao đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy, chồi khỏe, phát triển tốt Hình 1: Số chồi hình thành môi trường TS5 sau 2, 4, tuần 3.2 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp BAP, NAA, B1 đến phát sinh hình thái hệ số nhân chồi Kết thí nghiệm sau tuần ni cấy thể bảng Bảng 5: Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến khả nhân nhanh chồi Mơi trường Số mẫu cấy Số mẫu sống sót Số mẫu tạo chồi Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Tổng số chồi tạo thành Số chồi / mẫu Chiều cao chồi (cm) KC0 54 40 32 80 53 1,66 3,17 KC1 54 44 37 84,1 63 1,7 3,22 KC2 54 46 38 82,6 114 2,99 4,51 KC3 54 47 39 82,9 137 3,5 4,61 KC4 54 49 45 91,8 171 3,8 4,76 KC5 54 50 47 87,5 197 4,2 5,22 KC6 54 51 49 94 230 4,7 5,22 KC7 54 53 52 96,2 289 5,55 5,7 KC8 54 49 39 80 217 5,55 5,66 KC9 54 45 34 75,6 181 5,33 5,73 Sau tuần nuôi cấy cho thấy môi trường nhân nhanh lan Gấm phù hợp môi trường Knudson C + 0,35 ppm BAP + 0,1ppm NAA + 0,25 ppm B1 với tỉ lệ tái sinh chồi đạt 5,27 chồi/ mẫu cấy Hình 2: Số chồi hình thành môi trường KC7 sau 2, 4, tuần 3.3 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp NAA, BAP tới phát sinh rễ Chồi sau tuần nhân nhanh tách chuyển qua môi trường tái sinh rễ để tạo in vitro hoàn chỉnh Kết sau tuần nuôi cấy thể bảng Bảng 6: Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến tái sinh rễ chiều dài rễ Mơi Số mẫu trường cấy Số mẫu sống sót Số mẫu tạo rễ Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) Tổng số rễ tạo thành Số rễ / mẫu Chiều dài rễ (cm) KR0 54 40 34 85 34 1,8 KR1 54 45 38 86,7 38 1,5 KR2 54 46 40 86,9 56 1,4 KR3 54 48 43 89,6 73 1,7 KR4 54 49 45 91,8 122 2,7 2,1 KR5 54 50 47 94 165 3,5 2,2 KR6 54 51 48 94,1 206 4,3 2,5 KR7 54 54 53 98,1 239 4,5 2,8 KR8 54 46 39 84,8 164 4,2 2,3 KR9 54 41 36 87,8 90 2,5 1,9 Hình 3: Sự phát triển rễ sau tuần Kết cho thấy môi trường phù hợp cho số lượng rễ lớn 4,5 rễ/ mẫu cấy chiều dài rễ dài đạt 2,8 cm môi trường Knudson C bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP BÀN LUẬN “Vi nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata” mục đích tái sinh chồi, nhân chồi tạo rễ, sử dụng môi trường tối ưu Knudson C bổ sung 20 g/l sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 150 ml/l nước dừa + 100 ml dịch chiết khoai tây + g/l agar Kết đạt có điểm giống khác nghiên cứu trước phối hợp chất chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác với nồng độ khảo sát không giống Đối tượng nghiên cứu chi (Anoectochilus) khác loài hàm lượng nước dừa, dịch chiết khoai tây khơng xác định góp phần tạo khác biệt Ngoài thời gian nghiên cứu hạn chế ảnh hưởng đến kết sau Quá trình tái sinh chồi sử dụng môi trường Knudson C bổ sung ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin + 0, ppm GA3 cho kết tái sinh chồi tốt với hàm lượng BAP thích hợp kích thích tổng hợp Cytokinin nội sinh dẫn đến hàm lượng Cytokinin nội sinh cao nên kích thích phân chia phân hóa gia tăng kích thước tế , mặt khác BAP cịn có tác dụng kích thích tế bào huy động nguồn dinh dưỡng từ môi trường nhằm thúc đẩy trình tổng hợp protein axit nucleic thúc đẩy tế bào phát sinh chồi Kinetin có hoạt tính tương tự BAP hai Cytokinin BAP Kinetin kết hợp với có vai trị điều phối việc cảm ứng tạo chồi GA3 thuộc nhóm Giberelin kết hợp với Cytokinin làm tăng hiệu tạo chồi Kích thích tổng hợp amylase, protease tăng hoạt tính chúng, tăng trình thủy phân polymer thành monomer tạo điều kiện nguyên liệu lượng cho nảy mầm, phá vỡ ngủ nghỉ hạt chồi Quá trình nhân nhanh chồi tốt mơi trường khống Knudson C bổ sung 0,35 ppm BAP + 0,1 ppm NAA + 0,25 ppm B1 Vì BAP có khả kích thích tạo chồi bên, vượt qua ảnh hưởng ưu ngọn, cân tỉ lệ Auxin Xytokinin có ý nghĩa định trình phát sinh hình thái mơ ni cấy in vitro, thí nghiệm tỉ lệ BAP cao NAA kích thích xuất phát triển chồi NAA phối hợp với BAP giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân sinh chồi từ nhu mô giúp chồi phát triển tốt, cân đối B1 vitamin cần thiết cho tăng trưởng tất tế bào, xúc tác trình biến dưỡng khác nhau, trì phân chia tế bào để mơ có sức sinh trưởng tốt Ghi nhận cho thấy với hàm lượng BAP, NAA nhỏ hệ số nhân chồi tương đương với kết Phí Thị Cẩm Miện (2012) Đối với mơi trường tạo rễ sử dụng mơi trường khống Knudson C bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP cho kết tái sinh rễ tốt NAA Auxin có hoạt tính mạnh so với Auxin khác Khi bổ sung vào mơi trường ni cấy, NAA có tác dụng hoạt hóa dãn thành tế bào tổng hợp chất tham gia cấu tạo nên chất nguyên sinh thành tế bào, cảm ứng cho tổng hợp chuỗi polyamine dẫn đến tế bào vùng xuất rễ để tạo nên mầm rễ, sau mầm rễ dài chui khỏi vỏ tế bào hình thành rễ Tỉ lệ NAA cao BAP kích thích rễ mà đảm bảo phát triển tốt Việc phối hợp Auxin Cytokinin cho hệ số tạo rễ chất lượng cao hẳn sử dụng Auxin mà cơng trình trước nghiên cứu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đề tài rút số kết luận sau: Mơi trường thích hợp cho tái sinh chồi sử dụng môi trường Knudson C + ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin + 0.1 ppm GA3 Kết đạt 94,3 % số lượng mẫu tái sinh Mơi trường thích hợp cho nhân chồi sử dụng môi trường Knudson C + 0,35 ppm BAP + 0,1 ppm NAA + 0,25 ppm B1 Kết đạt 96,2 % số lượng mẫu tái sinh với 5,55 chồi/ mẫu Các chồi có chiều cao từ - 5cm sử dụng để rễ in vitro Tỷ lệ rễ 98,1 % số rễ/ mẫu ( 4,5 rễ/ mẫu) cao mơi trường có bổ sung 0,7 ppm NAA + 0,2 ppm BAP 5.2 Kiến nghị Lặp lại thí nghiệm nhiều lần tăng số nghiệm thức, nhằm mở rộng nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata Nghiên cứu cụ thể tác động riêng lẻ thành phần nước dừa, dịch chiết khoai tây, ánh sáng, nhiệt độ, pH…lên tái sinh chồi, rễ lan Gấm Anoectochilus fiormosanus Hayata Tìm môi trường phù hợp để tạo mơ sẹo nhằm giảm thiểu thối hóa giống Tiến hành đem hóa vườn ươm theo dõi, đánh gia ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh lên sinh trưởng, phát triển lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata Lời cảm ơn Chúng xin trân trọng cảm ơn Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường, trường Đại học Lạc Hồng cho phép giúp đỡ thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Walter Hood Fitch, (1844), "Curtis's botanical magazine", tập 70 tab 4123 Trần Văn Bảo (1999), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, nhà xuất Trẻ Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất Đại học quốc gia HCM Dương Công Kiên (2003),Nuôi cấy mô thực vật(tập 1,2,3), Nhà xuất Đại học quốcgia HCM Guo Qiaosheng, Changlin (08/06/2012), “Agricultural technology in the production of medicinal plants”, Chinesemedicine, truy cập ngày 10 tháng 07 năm 2013, Vưu Ngọc Dung (8/2010), Giáo trình cơng nghệ Ni cấy mơ, Đại học Lạc Hồng, Biên Hịa, Đồng Nai Nguyễn Ngọc Quỳnh, (25/10/2012), “Cây Lan Gấm (Anoectochilus formosanus Hayata), giá trị kinh tế tiềm phát triển vùng đất Tây Ngun”, Phịng Cơng nghệ Sinh học-Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam, truy cập ngày 15 tháng năm2013, Fan Zinan (1997), “Anoectochilus cultured tissue culture studies”, Fujian Normal University, số 13, tr 82-87 Phạm Cường (31/03/2007), “ Cymbidium( sym – BID – ee – um)”, Báo điện tử Hoa lan Việt Nam, truy cập ngày 12 tháng năm 2013, Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất Đại học Nông nghiệp I HàNội Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Vưu Ngọc Dung Lê Linh Dung Mai Hương Trà Nguyễn Thị Kiều Linh 10 ... nhiều loài lan Gấm Tuy nhiên, Vi? ??t Nam lồi Anoectochilus formosanus - Lồi có giá trị thương mại cao giới chưa quan tâm nghiên cứu Đề tài ? ?Vi nhân giống lan gấm Anoectochilus formosanus Hayata? ??... với mục đích nhân nhanh số lượng lớn lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata in vitro làm sở cho vi? ??c nhân nhanh nguồn vật liệu khởi đầu cung cấp sở khoa học nhằm khôi phục lại nguồn giống đáp... trình nhân giống lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata Nghiên cứu cụ thể tác động riêng lẻ thành phần nước dừa, dịch chiết khoai tây, ánh sáng, nhiệt độ, pH…lên tái sinh chồi, rễ lan Gấm Anoectochilus