Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên một số loại cây trồng

VSV phân giải P được phân lập từ đất, rễ cây, nốt sần của cây họ đậu, phân trộn và quặng P [2] Để giữ được độ phì nhiêu bền vững của đất, đảm bảo được năng suất cây trồng, cần thiết phải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN TIẾN BƯỚC

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI PHOSPHATE KHÓ TAN LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN TIẾN BƯỚC

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI PHOSPHATE KHÓ TAN LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tăng Thị Chính

THÁI NGUYÊN - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của chúng tôi dưới

sự hướng dẫn của PGS TS Tăng Thị Chính, sự giúp đỡ của các cán bộ phòng Vi Sinh Vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những số liệu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Tiến Bước

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập tại Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên cũng như thời gian thực tập tại Phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, tôi

đã được trang bị một số kiến thức và kinh nghiệm thực tế giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cám ơn những tập thể và cá nhân đã giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin chân thành cám ơn PGS.TS Tăng Thị Chính - Trưởng phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi thực hiện đề tài luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Th.S Đặng Thị Mai Anh và các anh chị

cán bộ Phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn

Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo Khoa Khoa học Sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Tiến Bước

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về photpho đối với cây trồng 3

1.2 Ảnh hưởng của photpho đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng 3

1.3 Nguồn dinh dưỡng cho cây trồng từ phosphate 3

1.4 Sự tồn tại của phosphate trong đất 4

1.4.1 Phosphate hữu cơ 4

1.4.2 Phosphate vô cơ 5

1.4.3 Vòng tuần hoàn của phosphate trong tự nhiên 6

1.5 Vai trò của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan 9

1.5.1 Vi sinh vật phân giải phosphate khó tan 9

1.5.2 Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate lên phân bón 12

1.6 Hiệu quả của phân vi sinh vật phân giải phosphate 14

1.7 Quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate 14

1.7.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate trên thế giới 14

1.7.2 Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan để sản xuất phân vi sinh trên thế giới 16

1.7.3 Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan sản xuất phân vi sinh ở

Việt Nam 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2 Thiết bị (Phụ lục) 20

2.3 Môi trường (Phụ lục) 20

2.4 Hóa chất 20

2.4.1 Các hóa chất chung 20

2.4.2 Dung dịch phân tích 20

2.5 Phương pháp phân tích vi sinh vật 21

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu đất 21

2.5.2 Phương pháp pha loãng 21

2.5.3 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 22

2.6 Phương pháp phân tích hóa học 22

2.6.1 Phương pháp phân tích P tổng số trong đất 22

2.6.2 Phương pháp phân tích phosphate dễ tiêu trong đất (Phương pháp Olsen) 25

2.6.3 Phương pháp xác định độ ẩm và hệ số khô kiệt 27

2.7 Bố trí thí nghiệm 28

2.7.1 Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 28

2.7.2 Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng đỗ xanh trong phòng thí nghiệm 30

3.1.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với hàm lượng photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất 30

3.1.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên các vi sinh vật trong đất 32

3.1.3 Đánh giá tác động của VSV phân giải phosphate khó tan lên sinh trưởng chiều cao, chiều dài rễ và sinh khối của cây đỗ xanh 34

3.2 Kết quả ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng

ngoài thực địa 37

3.2.1 Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan đối với cây Ngô 37

3.2.2 Ảnh hưởng của VSV phân giải phosphate khó tan đối với cây rau bắp cải 42

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

1 Kết luận 47

2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

TT Chữ viết tắt Nội dung

đất trồng cây đỗ xanh 33

Bảng 3.3 Khối lượng và chiều dài của rễ cây đậu xanh 35

đất trồng ngô 40

số trong đất trồng rau bắp cải 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa P trong hệ sinh thái 8

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa P trong đất 8

Hình 1.3 Chu trình P trong tự nhiên 8

Hình 1.4 Các VSV phân giải phosphate 10

Hình 1.5 Một số vi khuẩn Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium 13

Hình 1.6 Vi khuẩn Streptomyces 13

Hình 2.1 Phương pháp lấy mẫu đất 21

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P tổng số (mg/ml) với OD882 23

Hình 2.3 Đồ thị đường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P dễ tiêu (mg/ml) với OD882 26

Hình 3.1 Hàm lượng photpho tổng số trong mẫu đất trồng cây đỗ xanh 30

Hình 3.2 Hàm lượng photpho dễ tiêu trong các mẫu đất trồng cây đỗ xanh 31

Hình 3.3 Đồ thị mô tả sự tăng trưởng chiều cao của cây đỗ xanh trong các mẫu thí nghiệm 34

Hình 3.4 Biều đồ mô tả khối lượng và chiều dài rễ cây đỗ xanh 35

Hình 3.5 Ảnh chụp quả đỗ xanh thu hoạchngày cuối ở quy mô phòng thí nghiệm 36

Hình 3.6 Tỷ lệ quả chắc, khối lượng quả chắc và năng suất quả của cây đỗ xanh 36

Hình 3.7 Ảnh hưởng của VK phân giải phosphate lên hàm lượng P tổng số trong đất trồng cây ngô 38

Hình 3.8 Ảnh hưởng của VK phân giải phosphate khó tan lên hàm lượng P dễ tiêu trong đất trồng ngô 39

Hình 3.9 Hình ảnh cây ngô ở quy mô ngoài đồng ruộng 41

Hình 3.10 Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan và mùn hữu cơ từ rác thải sinh hoạt lên năng suất của cây ngô 41

Hình 3.11 Kết quả phân tích hàm lượng photpho tổng số trong mẫu đất trồng cây rau bắp cải 43

Hình 3.12 Kết quả phân tích hàm lượng photpho dễ tiêu 44

Hình 3.13 Ảnh hưởng của VK phân giải P lên sự phát triển sinh khối và rễ của cây rau bắp cải 46

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Phospho (P) là một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng Nó là một trong những thành phần chính cấu tạo nên tế bào thực vật bao gồm axit nucleic, phospholipid, coenzyme, đường phosphoryl, nucleotide và phytate P có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình trao đổi chất liên quan đến sinh trưởng và phát triển của cây [8] Nhưng trong đất P thường tồn tại ở các dạng muối phosphate khó tan mà cây trồng không thể hấp thụ được P tồn tại trong đất dưới dạng hợp chất hữu cơ và hợp chất vô cơ Tỉ lệ của hai dạng này là khác nhau ở các loại đất, thường xấp xỉ 2/3 là P vô cơ, phần còn lại

là P hữu cơ [3]

Xuất phát từ thực tế nước ta có trữ lượng P rất lớn Chúng ta đã sản xuất được một số loại phân hóa học có chất lượng tốt Tuy nhiên, việc lạm dụng phân hóa học kéo theo nhiều nguy hại cho môi trường, đất bị bạc màu, cạn kiệt chất dinh dưỡng Do đó, sử dụng phân bón vi sinh thay thế một phần phân hóa học là giải pháp tốt hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững sinh thái [8]

Để đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của nông nghiệp và để góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón hóa học, từ những năm đầu thế kỉ XX nhiều nước trên thế giới đã và đang làm quen với việc sử dụng phân bón VSV thay thế một phần phân bón hóa học [2] Việc sử dụng phân bón vi sinh tận dụng được nguồn P có sẵn trong đất, nâng cao hiệu quả của nguồn P đã bón, đáp ứng một phần nhu cầu của P đối với cây trồng Thông qua hoạt động của VSV mà P cũng như các nguyên tố khác tồn tại trong đất được chuyển biến từ dạng khó hấp thụ sang dễ hấp thụ cho cây trồng Chính VSV có ý nghĩa quyết định trong việc tạo năng suất cây trồng [33]

VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa P khó tiêu để cung cấp cho cây từ nguồn P khó tiêu sẵn có trong đất VSV phân giải phosphate khó tiêu phân bố rộng rãi trong đất đặc biệt là vùng rễ [3]

Nhiều VSV có khả năng phân giải Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, hydroxy apatit

và quặng phosphate [17] Những VSV này gồm VK và nấm men VSV phân giải P được phân lập từ đất, rễ cây, nốt sần của cây họ đậu, phân trộn và quặng P [2]

Để giữ được độ phì nhiêu bền vững của đất, đảm bảo được năng suất cây trồng, cần thiết phải sử dụng một cách hợp lý giữa phân vô cơ, hữu cơ và phân vi sinh, kết hợp với hệ thống trồng trọt đa dạng thích hợp với môi trường [2]

Phân vi sinh là chế phẩm có chứa các VSV sống có hoạt lực cao đã được tuyển chọn Thông qua các hoạt động trao đổi chất chúng tạo ra các chất dinh dưỡng cho đất

và cây trồng Để đảm bảo lượng phân vi sinh cần có sự kiểm tra chặt chẽ, thường xuyên về mật độ cũng như chất lượng của chủng VSV hữu ích có trong phân bón để tránh gây lãng phí, thiệt hại cho người tiêu dùng [2], [4] Sử dụng chế phẩm VSV thường tăng năng suất cho cây trồng, đồng thời có thể tiết kiệm lượng phân hóa học đáng kể, góp phần tạo sản phẩm sạch cho nông nghiệp và bảo vệ môi trường [13], [17]

Việc đánh giá được mức độ ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan làm cho đất có độ phì nhiêu cao và cây trồng đạt năng suất cao Trên cơ sở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên một số loại

cây trồng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan cao phục

vụ cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh

3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

Đánh giá mật độ vi sinh vật phân giải phosphate trong đất trồng đỗ xanh trong phòng thí nghiệm và mật độ vi sinh vật trong đất trồng ngô và rau bắp cải ở ngoài đồng ruộng

Phân tích hàm lượng P tổng số và P dễ tiêu trong đất trồng đỗ xanh phòng thí nghiệm và đất trồng ngô, đất trồng rau bắp cải ngoài đồng ruộng

Đánh giá ảnh hưởng của vi sinh vật lên năng suất cây trồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về photpho đối với cây trồng

Nguyên tố P được Brandt phát hiện đầu tiên vào năm 1669, sau đó Lippic - tác giả của học thuyết chất khoáng, là người đầu tiên thấy được sự cần thiết của P đối với cây trồng Tuy nhiên, phải đến những năm 40 của thế kỉ XIX những bằng chứng thực sự về sự cần thiết của P đối với cây trồng mới được Gortmare đưa ra [16]

P là chất dinh dưỡng cần thiết cho thực vật đứng thứ hai sau nitơ (N) Nó là một trong những thành phần chính cấu tạo nên tế bào thực vật bao gồm axit nucleic, phospholipid, coenzyme, đường phosphoryl, nucleotide và phytate Nó liên quan đến sự biến đổi năng lượng trong cây và những cơ thể khác và là một thành phần quan trọng của vật liệu di truyền P có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình trao đổi chất liên quan đến sinh trưởng và phát triển của cây Việc cung cấp nguyên tố này cho cây là cần thiết để thu được năng suất mùa màng tối ưu [8], [27]

1.2 Ảnh hưởng của photpho đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Do P có vai trò quan trọng đối với thực vật như vậy, cho nên việc cung cấp P cho cây ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển bình thường của cây trồng

Khi cây đủ P: sẽ tăng cường sự phát triển của bộ rễ, kích thích sự tạo nốt sần

ở cây bộ đậu, làm tăng cường phẩm chất nông sản, giúp cho hạt giống nảy mầm nhanh và có sức sống cao Ngoài ra, P còn làm cho cây mau chín, rút ngắn thời gian sinh trưởng, tăng khả năng chịu rét và tăng tỷ lệ hạt [5]

Khi cây thiếu P: sẽ làm cho cây lúa có đặc điểm lá mềm yếu, rễ kém phát triển và cây sinh trưởng kém, khả năng đẻ nhánh và phân cành kém, lá có màu xanh đậm, có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành quả và hạt Ngoài ra khi thiếu P còn hạn chế hình thành nốt sần của cây bộ đậu [2]

1.3 Nguồn dinh dưỡng cho cây trồng từ phosphate

Có ba dạng axit phosphoric quan trọng đối với dinh dưỡng cây trồng đó là: metaphosphoric, pyrophosphoric và octophosphoric Cả ba loại này được tạo thành bằng con đường hóa học anhydriophosphoric với số lượng khác nhau

1.4 Sự tồn tại của phosphate trong đất

Hàm lượng P trong vỏ trái đất tính theo khối lượng là 0,8% P dễ bị oxi hóa nên không tồn tại ở trạng thái tự do P là tài nguyên thiên nhiên không tái tạo và P tồn tại trong đất (chiếm 0,02 - 0,2% tùy theo từng loại đất) có nguồn gốc từ các khoáng chất chứa P như apatit, phosphorit, vivianit…hoặc cũng có thể có nguồn gốc từ sự phân hủy xác chết của sinh vật Tùy vào nguồn gốc và quá trình tạo thành

mà hàm lượng P trong các loại đất, các tầng đất khác nhau là khác nhau [9]

P trong đất cung cấp cho cây qua đất, phân phosphate vô cơ, phân chuồng động vật, các chất thải nông nghiệp, xác động thực vật cũng như VSV, rác thải hữu

cơ, rác thải sinh hoạt và quặng phosphate [21], [26]

Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng, P tồn tại ở hai dạng chủ yếu

là P hữu cơ và P vô cơ Tỉ lệ của hai dạng này là khác nhau ở các loại đất, thường xấp xỉ 2/3 là P vô cơ, phần còn lại là P hữu cơ [3]

1.4.1 Phosphate hữu cơ

Tùy theo loại đất, tỷ lệ P hữu cơ thường chiếm từ 20 - 80% P tổng số trong đất Ở lớp đất mặt, P chiếm khoảng 50% Những nhóm hợp chất P hữu cơ tồn tại trong đất gồm: phospholipid, axit nucleic, inositol phosphate, nucleoprotein và phytate [12]

P hữu cơ chuyển sang phosphate vô cơ bởi quá trình khoáng hóa nhờ VSV VSV phân hủy những hợp chất này và tạo ra P dễ tiêu cho cây trồng dưới dạng axit phosphoric và muối dễ tan của nó [29], [32] Nhưng các dạng lân này lại bị đất hấp

phụ và VSV hút lại, nên trong đất có rất ít phosphate ở dạng hòa tan Nhiều tác giả nghiên cứu cho rằng: nếu chất hữu cơ vùi trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate thì qua quá trình phân giải hàm lượng P hữu cơ trong đất không tăng mà còn giảm xuống [10]

Theo những công trình nghiên cứu của Kalia (1954): nếu chất hữu cơ vùi

lượng phosphate dễ tan cho cây vì VSV sẽ hút hết Cường độ hút P hữu cơ của đất thông qua sự phân giải của VSV phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo Sepfe - Satsaben (1960) trong điều kiện nhiệt độ bình thường, ở các nước ôn đới, sự khoáng hóa P hữu cơ diễn ra rất chậm và lượng P cung cấp cho cây từ những hợp chất hữu

lên rất mạnh và cung cấp cho cây được nhiều P từ những hợp chất hữu cơ Vì thế, ở nước ta bón phân chuồng cũng là giải pháp cung cấp P cho cây trồng [10]

1.4.2 Phosphate vô cơ

P vô cơ chiếm khoảng 2/3 so với P hữu cơ trên P tổng số P vô cơ ở trong đất

là các hợp chất khác nhau của axit phosphoric do vậy tùy thuộc vào loại đất mà xuất hiện các hợp chất của axit phosphoric khác nhau Theo khả năng hòa tan, P vô cơ trong đất được chia thành 3 dạng chính [12]:

P không tan: chiếm phần lớn, hầu như không tan trong nước hoặc muối trung

Mg3(PO4)2

P tan trong axit yếu: loại này thực vật có thể sử dụng được nhưng chậm

Sự tồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate chuyển đổi hóa trị [10]

còn lại thường là những dạng khó tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn cây trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan Dưới tác dụng của VSV, P hữu cơ được vô cơ hóa biến thành các dạng muối của axit phosphoric Các dạng P này một phần được cây trồng sử dụng biến thành dạng P

Những dạng khó tan này trong các môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển thành dạng dễ tan Trong quá trình này, VSV đóng vai trò quan trọng [10]

1.4.3 Vòng tuần hoàn của phosphate trong tự nhiên

Trong tự nhiên vật chất chuyển động theo một vòng tuần hoàn gọi là chu trình sinh địa hóa Như các nguyên tố hóa học có vai trò quan trọng trong tự nhiên: C, H,

O, N, … thì P cũng chuyển động theo một chu trình sinh địa hóa nhưng chu trình của

nó rất đặc biệt đó là không có sự chuyển hóa sang pha khí Vòng tuần hoàn của P không giống vòng tuần hoàn của nitơ Trong khi nitơ luôn khan hiếm trong đất thì P tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải [27], [35] Nitơ được đưa vào đất nhờ VSV cố định đạm từ không khí, còn đối với P chúng được các VSV phân giải từ các nguồn P vô cơ và hữu cơ khác nhau P dự trữ chủ yếu trong sinh quyển đặc biệt là ở lớp vỏ của Trái đất và với các điều kiện thời tiết khác nhau thì nó phân tán dưới các dạng phosphate Sau đó, P thấm vào đất và thực vật hấp thụ P thông qua rễ của chúng Thực vật lại bị động vật ăn thực vật tiêu thụ Động vật ăn thịt lại thu nhận P thông qua việc ăn thịt động vật ăn cỏ… P trở thành các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sống Trong cơ thể động vật, P là thành phần cấu tạo của xương, của các liên kết, các enzyme… Sau đó, khi động vật phát thải (nước tiểu và phân) hoặc chết đi thì P hữu

cơ được chuyển trở lại môi trường đất, nước Khi trả lại đất, P hữu cơ này được giải phóng thành P vô cơ hoặc tạo thành vật liệu hữu cơ đất bền vững hơn Sự giải phóng

P vô cơ từ P hữu cơ gọi là sự khoáng hóa và nhờ VSV phá vỡ những hợp chất hữu cơ phosphorit thành những dạng vô cơ dễ tiêu Vì vậy, thực vật lại có thể sử dụng lại tiếp, cứ lặp đi lặp lại như thế tạo thành một chu trình [5]

Một phần P đi vào chu trình nước trong đại dương Mưa làm P trong đất bị hòa tan vào nước chảy qua sông, suối rồi ra biển Một phần P được sử dụng bởi sinh vật phù du dưới đại dương Cá, tôm ăn phù du lại trả lại cho động vật ăn cá và cuối cùng lại trả lại P cho môi trường đất Một nguyên tử P nhỏ có thể quay vòng qua chu trình nước và các sinh vật sống dưới nước trung bình xấp xỉ 100.000 năm cho đến khi nó cuối cùng nghỉ ngơi dưới đáy đại dương trong thành các trầm tích [8]

P có thể ở lại bên trong trầm tích hơn 100 triệu năm và trái với chu trình carbon và nitơ, P không lọc qua bầu khí quyển của Trái đất Chu trình P lần lượt là một chu trình trầm tích P trong các đại dương và trầm tích sông được nâng lên bởi các thành phần bên ngoài địa chất và có thể lại trở lại bề mặt trái đất một lần nữa Mọi thứ cứ quay vòng như thế tạo chu trình to nhỏ [8]

Tác động của con người đã làm thay đổi rất lớn tới chu trình P trong tự nhiên thông qua các hoạt động như khai thác mỏ, các hoạt động nông nghiệp: trồng cây và bón phân (đặc biệt là các sản phẩm phân bón hóa học) Trong phân bón có chứa một lượng lớn P Lượng P khi sử dụng sẽ đi vào chu trình P thông qua các con đường khác nhau Nguồn phosphate làm phân bón được khai thác từ quặng apatit chứa chủ yếu là canxi phosphate Trong quá trình sản xuất phân bón super phosphate, axit sulfuric giúp chuyển hóa đá chứa phosphate thành phân bón Hàng năm, P trả lại cho chu trình đại sinh thái là 60.000 tấn Trong khi đó đầu vào của chu trình là khoảng 2.000.000 tấn (qua phân bón) Thực vật không hấp thu hoàn toàn lượng phân bón phosphate sử dụng chứng tỏ lượng hao hụt qua chu trình là khá lớn, một lượng lớn còn lại bị rửa trôi vào nguồn nước và tích tụ ở nền đáy ao hồ gây ô nhiễm nguồn nước P bổ sung quá nhiều không chỉ gây ảnh hưởng tới môi trường nước mà còn có thể làm tăng sự phát triển của sinh vật (ví dụ hiện tượng phú dưỡng gây hiện tượng tảo nở hoa) và làm thay đổi

sự cân bằng sinh vật trong các hệ sinh thái [1], [8]

Dưới đây là sơ đồ tóm tắt chu trình tuần hoàn của P giúp ta hiểu phần nào về chu trình này thông qua cả 2 chu trình P trong nước, chu trình P trong đất và tác động của con người tới chu trình [41]

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa P trong hệ sinh thái [41]

Trong đề tài này, chúng ta quan tâm tới chu trình P ở trong đất và vai trò của VSV trong chu trình chuyển hóa Trong đó, VSV phân giải phosphate có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình chuyển hóa P ở trong đất P được giữ lại trong đất dưới dạng các hợp chất khó tan và chỉ được trả lại cho đất dưới dạng dễ tan nhờ vào

sự chuyển hóa của VSV phân giải phosphate [26]

Trong tự nhiên sự chuyển hóa P xảy ra dưới tác dụng của 2 quá trình chính:

- Chuyển hóa hóa học là quá trình xảy ra các hoạt động phong hóa của đất

- Chuyển hóa sinh học là quá trình chu chuyển của P xảy ra dưới tác dụng của các nhân tố sinh học

Trong vòng tuần hoàn P thì quá trình sinh học chiếm ưu thế và quá trình này VSV đóng vai trò quan trọng, giúp chuyển P khó tan thành dễ tan đối với

cây trồng P tích lũy ở động, thực vật và VSV được cố định một cách tạm thời,

khi tế bào chết nó trở thành nguồn P hữu cơ, được giải phóng vào đất và cung cấp trở lại cho thực vật nhờ các VSV đất VSV đất phân giải phosphate khó tan, khoáng hóa các hợp chất P hữu cơ thành dạng vô cơ (octophosphate) để cung cấp cho sinh trưởng và phát triển của cây Thực vật lại trở thành thức ăn của động vật và chu trình P lại lặp lại [18]

1.5 Vai trò của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan

1.5.1 Vi sinh vật phân giải phosphate khó tan

VSV phân giải hợp chất phosphate khó tan là những VSV, thông qua hoạt động của chúng, với các hợp chất P khó tan được chuyển hoá thành dễ tan đối với cây trồng VSV phân giải phosphate khó tan tạo vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (vòng phân giải) trên môi trường chứa nguồn P duy nhất là

Các vi sinh vật phân giải phosphate khó tan được biết đến nay là các

loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Sclelotium,

Aspergillus Các VSV này không chỉ phân giải phosphate canxi, phosphate nhôm,

sắt, mangan và kể cả quặng VSV không chỉ chuyển hóa phosphate vô cơ, mà còn

có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo ra sản phẩm mà cây trồng có thể hấp thu được [36]

Hình 1.4 Các VSV phân giải phosphate [36]

VSV phân giải P khó tan phân bố rộng rãi trong các tầng đất và đặc biệt ở vùng rễ, các loại rễ khác nhau thì khác nhau (các VSV này có thể ở trong rễ, bề mặt

rễ, đất vùng rễ và đất không phải vùng rễ) Đồng thời số lượng VSV phân giải P cũng thay đổi theo điều kiện khí hậu và lịch sử của đất, phụ thuộc vào chất đất, chế

độ canh tác, loại cây trồng, mùa vụ và tuổi của cây… [20]

Theo Jayandra và cộng sự đã tổng kết: “Sự xuất hiện của VSV phân giải phosphate trong rễ cây là cao nhất sau đó là đất quanh rễ Tới nửa số VSV đất được

lớn vượt quá nhu cầu dinh dưỡng của chúng” [31]

và quặng phosphate Những VSV này gồm VK, xạ khuẩn, vi nấm, nấm men cũng như tảo Chúng được phân lập từ các nguồn khác nhau Số lượng các loài phụ thuộc vào nguồn carbon, nitơ, dạng P khó tan, pH, nhiệt độ…[4]

Ngày nay, danh sách các VSV có khả năng phân giải các nguồn P khó tan khác nhau đã được công bố [34]

Bảng 1.1 Các VSV có khả năng phân giải các nguồn phosphate khó tan khác nhau [34]

Các VSV có khả năng phân giải

nguồn P khó tiêu Nguồn phosphate khó tiêu

Vi khuẩn

Achromobacter spp

Bacillus sp, B.pulvifacien, B.criculans,

B.subtilis, B.mycoides, B.mesenteries,

Fluorapatit Quặng phosphate Chất hữu cơ Canxi phytate Canxi

Glyxero phosphate Lectithin

Hexose Mono phosphate Este

Các phosphate hữu cơ khác…

Qua bảng 1.1 cho thấy các VSV phân giải phosphate thuộc nhiều nhóm khác nhau bao gồm: VK, nấm và xạ khuẩn Chúng được phân lập từ các nguồn khác nhau Số lượng các loài trong đất phụ thuộc vào nguồn C, N, dạng P khó tan, pH, nhiệt độ

VSV phân giải P khó tan chia thành hai nhóm chính: VSV phân giải P hữu

cơ và VSV phân giải P vô cơ [37]

VSV phân giải P hữu cơ chủ yếu gồm các chi Bacillus và Pseudomonas Ngoài ra còn có một số xạ khuẩn và nấm khác Đáng chú ý là B megaterium var phosphatsum có khả năng phân giải P hữu cơ cao [10] Đồng thời B megaterium còn có khả năng hình

thành bào tử có sức sống rất mạnh [10]

Nhiều VK như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,

Pseudomonas fluorescens, VK nitrat hóa, xạ khuẩn có khả năng phân giải

sinh axit của VSV Quá trình lên men tạo ra axit carbonic, là axit chủ yếu thúc đẩy quá trình hòa tan P vô cơ [10]

Trong đất, VK nitrat hóa và VK chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng

phương trình sau:

Đối với nấm thì Aspergillus niger có khả năng phân giải P mạnh nhất Ngoài

ra còn có một số chi khác như Penicillin, Rhizopus…

1.5.2 Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate lên phân bón

Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau Các hợp chất P hữu cơ trong đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng… Những hợp chất P hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành những hợp chất

P vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành ở dạng dễ tan Hợp chất P hữu cơ quan trọng nhất được phân giải ra từ tế bào vi sinh vật là nucleotide

Nucleotide có trong thành phần nhân tế bào Nhờ tác động của các nhóm vi sinh vật hoại sinh trong đất, chất này tách ra từ thành phần tế bào và được phân giải thành 2 phần protein và nuclein Protein sẽ đi vào vùng chuyển hóa các hợp chất nitrogen, nuclein sẽ đi vào vòng chuyển hóa các hợp chất P.Sự chuyển hóa các hợp

P hữu cơ Những vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzyme phosphate dễ xúc tác

cho quá trình phân giải.Các vi sinh vật phân giải P hữu cơ theo sơ đồ tổng quát sau:

Vi sinh vật phân hủy P hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillus và Pseudomonas Các loài có khả năng phân giải mạnh là: B.megaterium, Serratia, B.subtilis,

Serratia, Proteus, Arthrobster,

Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium,

Aerobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Flavobacterium…

Hình 1.5 Một số vi khuẩn Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter,

Agrobacterium [36]

Xạ khuẩn: Streptomyces

Hình 1.6 Vi khuẩn Streptomyces [36]

1.6 Hiệu quả của phân vi sinh vật phân giải phosphate

Hàm lượng P dễ tiêu trong hầu hết các loại đất đều rất thấp Vì vậy việc bón lân cho đất nhằm nâng cao năng suất cây trồng là việc làm cần thiết Người ta cũng biết rằng khoảng 2/3 lượng lân bón vào đất được chuyển hóa thành dạng cây trồng không sử dụng được hoặc bị rửa trôi Phân vi sinh vật phân giải phosphat khó tan không chỉ có tác dụng nâng cao hiệu quả cuả phân bón lân khoáng nhờ hoạt tính phân giải và chuyển hóa của các chủng vi sinh vật mà có tác dụng tận dụng nguồn phosphat có sẵn trong đất Nhiều công trình nghiên cứu ở châu Âu, châu Mĩ cũng như ở các nước châu Á đều cho thấy hiệu quả to lớn của phân vi sinh vật phân giải phosphate Tại Ấn Độ VSV phân giải lân được đánh giá có tác dụng tương đương với 50 kg P2O5/ha Sử dụng VSV phân giải lân cùng quặng phosphat có thể thay thế được 50% lượng lân khoáng cần bón mà không ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

Các kết quả nghiên cứu ở Liên Xô, Canada cũng cho các kết quả tương tự Sản phẩm phosphobacterin và PB500 đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp ở 2 quốc gia này Hiện nay Trung Quốc và Ấn Độ là 2 quốc gia đang đẩy mạnh quy mô phát triển và ứng dụng công nghệ sản xuất phân lân vi sinh vật ở quy mô lớn với diện tích sử dụng hàng chục triệu ha Tại Việt Nam các công trình nghiên cứu gần đây cho biết 1 gói chế phẩm VSV phân giải lân sử dụng cho cafe trên vùng đất đỏ

làm tăng số lượng VSVPGL trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải lân khó tan trong đất 23-35% Cây trồng phát triển tốt hơn, thân lá cây mập hơn, to hơn, bản lá dày hơn, tăng sức đề kháng sâu bệnh, tăng năng suất đậu tương 5-11%, lúa 4,7-15%

so với đối chứng

1.7 Quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate

1.7.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate trên thế giới

Việc tiến hành phân lập các chủng VSV có khả năng phân giải P vô cơ khó tan đã được tiến hành từ những năm 40 của thế kỉ XX qua các công trình của Gerretsen (1948), Sperber (1958), Low (1959)…sau đó đến các công trình của Greaves (1965)…và ngày nay vẫn còn tiếp tục bởi các tác giả Kucey (1997),

Kappoor (1989), Salish (1989), Sattar (1989), Richardson (1997) trên các vùng đất và các loại đất khác nhau

Đồng thời với việc phân lập, việc nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ chế của sự phân giải cũng được tiến hành khá sớm với các đóng góp của Sperber (1958), Rose (1986)

pulvifaciens (R1) 57mg; B megatherium (PB) 36,5 mg; B pumilus 31mg; B megatherium (28) 26mg; B polymyxa (H-5) 22mg [19]

Từ đất kiềm, muối, đất đen, đất nâu vàng, đất đỏ, đất phèn lấy từ Nam, Bắc và Đông Bắc Trung Quốc, Yin (1988) đã tách được các VSV phân giải phosphate bao gồm

VK, xạ khuẩn, nấm Mật độ VSV phân giải phosphate cao nhất trong đất đen

16,6% bao gồm B megatherium, Arthrobacter sp., Flavobacter sp., Erwinia sp.,

Pseudomonas sp có hoạt tính hòa tan P 25,30mg/g; 67 chủng chiếm 25,3% bao gồm B alcaligenes, B polumyxa, B sutilis có hoạt tính hòa tan P 20,25g/mg; 51 chủng (19,2%)

bao gồm B cereus, B sphaericus có hoạt tính hòa tan P 15,20mg/g; 33 chủng (12,5%) bao gồm Chromobacterium violaceum và Serratia sp có hoạt tính hòa tan P 5,1mg/g và

18 chủng (6,8%) gồm B firmus có hoạt tính hòa tan P 2,5mg/g [44]

Halder và cs (1991) cũng nghiên cứu khả năng hòa tan phosphate của chủng

Bradihizobium trong môi trường nuôi cấy có chứa cả hydroxyapatit và canxi phosphate

Quá trình hòa tan phosphate của các chủng dẫn đến làm giảm pH môi trường Nitơ ở dạng amoni là nguồn nitơ thích hợp cho quá trình hòa tan phosphate Tuy nhiên, nitrat

carbon tốt nhất cho quá trình phân giải [30]

awamori đạt tối đa vào ngày thứ 10 và 11 Lượng P2O5 tối đa hòa tan do

Penicillium đối với Ca2HPO4, Ca3(PO4)2, FePO4 và AlPO4 tương ứng với các tỉ

lệ 30,8; 58,4; 12 và 24% [28]

Cunnigham và Kuiack (1992) đã phân lập Penicillium bilaii để nghiên cứu

khả năng hòa tan phosphate khoáng và tăng hiệu quả sử dụng P Nuôi cấy trên môi trường thạch có chứa canxi phosphate và chất chỉ thị màu.Trong số các VK tìm thấy

được có Enterobacteraerogens có hiệu quả nhất với môi trường có chứa canxi

phosphate [24]

Thakker và cs (1993) dựa vào đặc điểm hình thái tế bào, đặc điểm sinh hóa kết hợp với hệ thống phân loại của Bergey’s và tiến hành nhuộm Gram để xác định

carbon, nitơ và pH môi trường cũng được nghiên cứu [43]

De Freitas và cs (1997), Reyes và cs (1999): cơ chế hòa tan phosphate là quá trình axit hóa kết hợp với giải phóng proton hoặc bằng cách sản sinh axit hữu cơ [25], [40]

Crespo và cs (2011) đã nghiên cứu khả năng hòa tan các hợp chất phosphate vô

cơ được hòa tan bởi Gluconacetobacter diazotrophicus trên các nguồn carbon khác

sử dụng nguồn carbon là aldoses Khi nguồn phosphate là hydroxyapatit thì glucose là nguồn carbon dùng để hòa tan [23]

Chaiharn và Lumyong (2011) phân lập được 216 chủng VK từ đất trồng lúa của miền bắc Thái Lan Các chủng VK đều hòa tan được phosphate vô cơ và sản xuất axit axetic [22]

1.7.2 Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan để sản xuất phân vi sinh trên thế giới

Sau hơn nửa thế kỉ sử dụng rộng rãi đến mức lạm dụng phân bón hóa học, các nước tiên tiến trên thế giới nhận ra mặt trái của vấn đề là các chất hóa học dùng trong nông nghiệp đã gây ô nhiễm môi trường trầm trọng Quá trình sản xuất phân bón hóa học vừa tốn kém vừa làm ô nhiễm môi trường không khí, đất, nước Đồng thời khi bón nhiều và lâu dài xuống ruộng, các chất hóa học đã phá hủy sinh thái đất, tồn dư trong đất làm vô cơ hóa đất, gây ô nhiễm môi trường đất và gây nhiễm độc thức ăn cho người và động vật qua rau xanh, ngũ cốc…Vì vậy, hiện nay xu hướng nghiên cứu sử dụng VSV trong quá trình sản xuất phân bón nói riêng và

trong sản xuất các chất dinh dưỡng và bảo vệ cây trồng nói chung đang ngày càng phát triển mạnh mẽ trên thế giới [14], [32]

Vào những năm 1950, các nhà nghiên cứu Nga phát triển sản phẩm chứa

Bacillus megatheriumvar phosphaticum với tên gọi Phosphobacterin Năm 1958

xấp xỉ 10 triệu hecta được xử lý với sản phẩm này Các báo cáo xác định rằng khoảng 50 - 70% đồng ruộng được nhiễm với Phosphobacterin làm tăng năng suất cây trồng 5 - 10% so với đối chứng Sau đó, chế phẩm này cũng được sử dụng ở Mỹ với 70% diện tích đất trồng nông nghiệp Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ đã

sử dụng Phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng đã cho kết quả tăng đáng kể

so với đối chứng Người ta ước tính nếu sử dụng VSV phân giải phosphate có tác

Năm 1955, Sở nghiên cứu khoa học Đông Bắc Trung Quốc đã sản xuất phân VSV phân giải phosphate bón cho lúa nước, lúa mì, khoai tây, đậu tương, cà chua, mía, lạc đều thu được năng xuất cao hơn Ở Trung Quốc, chế phẩm phân lân vi sinh đang được ứng dụng rộng rãi Trong đó, chế phẩm “Thiên Lý Bảo” là loại phân

chi Bacillus) đã được thử nghiệm trên 23 loại cây trồng khác nhau và được chứng

minh là vừa có khả năng chuyển hóa P trong các hợp chất khó tan vừa có khả năng

cố định nitơ để cung cấp P, nitơ cho cây trồng [3]

Sử dụng chủng Pseudomonas striata khi bón quặng phosphate và super

phosphate cũng làm tăng đáng kể năng suất khoai tây (Gaur và Negi, 1980) Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada cho thấy khi bón VSV phân giải phosphate có thể

không hề thay đổi (Gaur, 1992) [29]

Cho tới năm 1990, khi Philom Bios mua Provide để bán ở Tây Canada thì đã

xuất hiện chế phẩm chứa P.bilaji Tiếp sau đó cũng có rất nhiều nghiên cứu: Jones

và cs (1995) tìm được những chủng khoáng hóa phosphate nhôm và sắt ở đất Scotlen Các nhà khoa học Úc cũng tìm được những VSV có hiệu quả trong đất axit… nhưng không thu được kết quả trong việc đưa các chủng VSV phân giải phosphate ra thị trường [39]

Các kết quả nghiên cứu từ Mỹ, Canada, Nga, Nhật, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan… cho thấy sử dụng chế phẩm VSV có thể thay thế 1/3 đến 1/2 lượng phân lân hóa học Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng sản phẩm Phosphobacterin trên lúa mì, ngô, lúa nước Kết quả cho thấy trong những điều kiện khí hậu khác nhau 10 trong tổng 37 cuộc thử nghiệm trên đồng ruộng cho sản lượng tăng đáng kể Không những thế, sản xuất phân vi sinh còn tận dụng được cả các phế thải nông nghiệp (rơm, rạ, rác hữu cơ…) vừa tiết kiệm năng lượng vừa ít gây ô nhiễm môi trường [39], [42]

1.7.3 Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan sản xuất phân vi sinh

ở Việt Nam

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững, Việt Nam đã có khá nhiều nghiên cứu về VSV phân giải phosphate Tại Việt Nam những nghiên cứu về VSV cố định nitơ cũng như phân giải phosphate khó tan đã được tiến hành nghiên cứu từ những năm 1960

Năm 1958, Lê Văn Căn và Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu một số nấm mốc có khả năng phân giải được phosphate khó tan Một trong số các chủng nấm mốc có

chủng Aspergillus niger có hoạt tính phân giải phosphate khó tan Sau 4 tuần nuôi cấy

đã chuyển hóa được 17,2% P tổng số trong apatit và 14,2% P tổng số trong phosphorit [2]

Năm 1980 bắt đầu thử nghiệm loại phân vi sinh cho cây đậu tương và chế phẩm Vinaga, Vidafo cho cây lạc (của trường Đại học Nông nghiệp Cần Thơ) Tháng 10 -

1990, chế phẩm phân hữu cơ vi sinh được công ty Thiên Nông sản xuất lần đầu tiên

ở nước ta

Kết quả nghiên cứu về phân lân vi sinh trong khuôn khổ đề tài cấp ngành mà Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992-1995 cho thấy sử dụng VSV phân giải phosphate có thể thay thế 30-35% lượng lân vô cơ cần bón bằng quặng phodphorit mà năng suất cây trồng không thay đổi

Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên khả năng phân giải phosphate khó tan của 2 chủng nấm sợi

Aspergillus awamori MN1 và Penicillium cyaneofulvum ĐT1 Tác giả nghiên cứu 7

nguồn cung cấp nitơ khác nhau lên khả năng phân giải phosphate khó tan của 2

Vũ Thúy Nga, Nguyễn Ngọc Quyên, Trần Thủy Tú, Phạm Văn Toản (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphate vô cơ khó tan của

VK Bradyrhizobium Kết quả cho thấy chúng có khả năng tổng hợp được từ 20 -

100 µg/ml IAA trong môi trường nuôi cấy [12]

Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Mai (2004)

đã nghiên cứu khả năng tiết enzyme phosphatase của 10 chủng VSV hòa tan P và nhận thấy rằng ngoài khả năng hòa tan P khó tan các chủng VSV này có khả năng sản sinh enzyme phosphatase (chủ yếu là nấm sợi và VK), enzyme này đóng vai trò xúc tác không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa P [6]

Nghiên cứu gần đây nhất đối với VSV phân giải phosphate trên đất bazan nâu đỏ là sử dụng chế phẩm vi sinh phân giải phosphate (50g) cho 1hecta cà phê

việc bón thêm phân VSV phân giải phosphate làm tăng số lượng VSV phân giải phosphate trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải phosphate khó tan trong đất thêm 23 - 35% [2]

Cho tới nay ở nước ta có nhiều nhà sản xuất phân lân hữu cơ vi sinh như: Phân lân hữu cơ Thiên Nông, phân lân sinh hóa hữu cơ Komix của công ty hóa sinh nông nghiệp và thương mại Thiên Sinh, phân sinh hóa hữu cơ Biomix của công ty phân bón hóa chất Kiên Giang, Biofer của Hội phân bón Việt Nam… đều sản xuất phân lân vi sinh nhưng với số lượng không nhiều, hiệu quả chưa thật ổn định, giá thành đắt, khó khăn về mặt bảo quản và vận chuyển; hơn nữa không phải bón cho vùng đất nào cũng phù hợp và cho hiệu quả

Vì vậy, mục tiêu chung của các nhà khoa học Việt Nam là phấn đấu có nhiều loại phân hữu cơ VSV tốt từ các phế thải nông nghiệp để có thể giảm dần việc sử dụng phân hóa học trên đồng ruộng mà vẫn đảm bảo nâng cao năng suất cây trồng đồng thời giảm chi phí đầu tư sản xuất, tiết kiệm tiền bạc và bảo vệ môi trường, xây dựng một nền nông nghiệp sinh thái bền vững [8]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Dịch nuôi cấy 3 chủng vi khuẩn Bacillus ký hiệu PL1, PL2, PL3 là chủng có

hoạt lực phân giải lân cao trong bộ giống của Phòng Vi Sinh Vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam cung cấp

Hạt giống cây đỗ xanh, cây ngô nếp F1 và cây rau bắp cải mua tại các cửa hàng giống cây trồng tại Hà Nội

2.4.2 Dung dịch phân tích

* Dung dịch tạo màu Amoni - Molybdate:

(dung dịch 1)

cất, để nguội

+ Rót từ từ dung dịch B vào dung dịch A rồi thêm nước cất cho đủ 1 lít Lắc trộn đều được dung dịch 1 đựng trong lọ màu nâu

- Dung dịch 2: dung dịch kali antimoantartrat 0,06% trong nước

- Dung dịch 3: dung dịch axit ascorbic 2% trong nước, pha dùng trong ngày

- Hỗn hợp dung dịch tạo màu với tỉ lệ: [1 kali atimotartrat 0,06% : 2

* Dung dịch chuẩn 50 ppm PO 4 3- :

- Trộn đều được dung dịch tiêu chuẩn P có nồng độ 50ppm (ml/lit)

2.5 Phương pháp phân tích vi sinh vật [7]

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu đất

Tùy theo hình dáng và địa hình mảnh đất cần lấy ít nhất 5 điểm phân bố đều trên toàn diện tích theo quy tắc lấy theo đường chéo, đường vuông góc hay đường dích dắc (hình 2.1) Cần tránh lấy mẫu ở các điểm đặc thù như nơi đổ phân, vôi hay những vị trí gần bờ và các vị trí quá trũng hay quá cao

Mẫu đất lấy ở độ sâu 5cm so với bề mặt đất có ghi kí hiệu từng mẫu

và từng ngày và địa điểm lấy mẫu Lưu ý mẫu đất chỉ được lấy và tiến hành thí nghiệm ngay trong ngày, hoặc để trong tủ lạnh không quá 48h, để tránh sự suy giảm

vi sinh vật

Hình 2.1 Phương pháp lấy mẫu đất [7]

2.5.2 Phương pháp pha loãng

Đối với mẫu rắn: Lấy 10g mẫu cho vào 90ml nước vô trùng được nồng độ

pha loãng tiếp theo

Đối với mẫu lỏng: Lấy 1ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm đựng 9ml nước

ở nồng độ 10-1 cho vào 9ml dịch nước pha loãng thu được nồng độ 10-2 Làm tương

tự như vậy với các nồng độ pha loãng tiếp theo

2.5.3 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật

Mẫu được pha loãng như mục 2.5.2 Lấy 0,1ml dịch huyền phù đã được pha loãng cấy lên đĩa thạch chứa môi trường MPA , rồi trang đều sau đó nuôi cấy trong

sinh trưởng của VK trong môi trường dịch thể đang nghiên cứu Số lượng tế bào được ước lượng thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch dao động từ 30 - 300 khuẩn lạc

Công thức xác định số lượng tế bào:

X = a.b.10 (CFU/ml)

a: Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri

b: Nghịch đảo của nồng độ pha loãng

2.6 Phương pháp phân tích hóa học

2.6.1 Phương pháp phân tích P tổng số trong đất [15]

* Nguyên tắc:

Sử dụng axit pecloric cùng axit nitric hòa tan các hợp chất P trong đất Xác định hàm lượng P trong dung dịch bằng phương pháp trắc quang “màu xanh molypden”

Trong môi trường axit các dạng phosphate sẽ được chuyển về dạng octophosphate và sẽ phản ứng tạo phức amoni molybdate có màu xanh và đo ở bước sóng 882nm

Phương trình phản ứng

PO43- + 12(NH4)2M0O4 + 24H+ → (NH4)3PO4.12M0O3 + 21 NH4++ 12 H2O

* Dựng đồ thị đường chuẩn PO 4 3- [15]

- Dung dịch tiêu chuẩn 50 ppm P (2.4.2)

- Xây dựng đường chuẩn:

+ Chuẩn bị 7 bình định mức 50ml Lần lượt cho vào các bình định mức theo thứ tự số ml dung dịch tiêu chuẩn 50ppm P theo bảng sau và sau đó thêm dung dịch