Tùy theo hình dáng và địa hình mảnh đất cần lấy ít nhất 5 điểm phân bốđều trên toàn diện tích theo quy tắc lấy theo đường chéo, đường vuông góc hay đường dích dắc...(hình 2.1). Cần tránh lấy mẫu ở các điểm đặc thù như nơi đổ phân, vôi hay những vị trí gần bờ và các vị trí quá trũng hay quá cao.
Mẫu đất lấy ở độ sâu 5cm so với bề mặt đất có ghi kí hiệu từng mẫu và từng ngày và địa điểm lấy mẫu. Lưu ý mẫu đất chỉ được lấy và tiến hành thí nghiệm ngay trong ngày, hoặc để trong tủ lạnh không quá 48h, để tránh sự suy giảm vi sinh vật
Hình 2.1. Phương pháp lấy mẫu đất [7] 2.5.2. Phương pháp pha loãng
Đối với mẫu rắn: Lấy 10g mẫu cho vào 90ml nước vô trùng được nồng độ
pha loãng 10-1. Lắc đều dịch trong ống nghiệm, lấy 1ml ở nồng độ 10-1 cho vào 9ml dịch nước pha loãng thu được nồng độ 10-2. Làm tương tự như vậy với các nồng độ
pha loãng tiếp theo.
Đối với mẫu lỏng: Lấy 1ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm đựng 9ml nước pha loãng vô trùng thu được nồng độ 10-1. Lắc đều dịch trong ống nghiệm, lấy 1ml
ở nồng độ 10-1 cho vào 9ml dịch nước pha loãng thu được nồng độ 10-2. Làm tương tự như vậy với các nồng độ pha loãng tiếp theo.
2.5.3. Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật
Mẫu được pha loãng như mục 2.5.2. Lấy 0,1ml dịch huyền phù đã được pha loãng cấy lên đĩa thạch chứa môi trường MPA , rồi trang đều sau đó nuôi cấy trong tủấm ở 300C. Sau 24 giờ xác định số lượng VK xuất hiện trên đĩa thạch đểđánh giá sinh trưởng của VK trong môi trường dịch thể đang nghiên cứu. Số lượng tế bào
được ước lượng thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch dao động từ 30 - 300 khuẩn lạc.
Công thức xác định số lượng tế bào: X = a.b.10 (CFU/ml)
a: Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri. b: Nghịch đảo của nồng độ pha loãng.
2.6. Phương pháp phân tích hóa học
2.6.1. Phương pháp phân tích P tổng số trong đất [15]
* Nguyên tắc:
Sử dụng axit pecloric cùng axit nitric hòa tan các hợp chất P trong đất. Xác
định hàm lượng P trong dung dịch bằng phương pháp trắc quang “màu xanh molypden”.
Trong môi trường axit các dạng phosphate sẽ được chuyển về dạng octophosphate và sẽ phản ứng tạo phức amoni molybdate có màu xanh và đo ở
bước sóng 882nm.
Phương trình phản ứng
PO43- + 12(NH4)2M0O4 + 24H+ → (NH4)3PO4.12M0O3 + 21 NH4++ 12 H2O (NH4)3PO4.12M0O3 + ne+ = Molybdenium (xanh dương)
* Dựng đồ thị đường chuẩn PO43- [15]
- Dung dịch tiêu chuẩn 50 ppm P (2.4.2).
- Xây dựng đường chuẩn:
+ Chuẩn bị 7 bình định mức 50ml. Lần lượt cho vào các bình định mức theo thứ tự số ml dung dịch tiêu chuẩn 50ppm P theo bảng sau và sau đó thêm dung dịch H2SO4 0,1N cho đến vạch định mức:
Bảng 2.1. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P
để xây dựng đường chuẩn P tổng số
Số thứ tự bình (50ml) 0 1 2 3 4 5 6 Số ml tiêu chuẩn 50ppm P 0 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 Nồng độ ppm P 0 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 mg P trong 50ml 0 0,125 0,25 0,5 0,75 1,00 1,250 - Tạo màu và đo màu:
+ Dùng pipet lấy 2ml các dung dịch tiêu chuẩn cho vào bình định mức 50ml. + Thêm khoảng 30ml nước cất và vài giọt chỉ thị màu α dinitrophenol.
+ Điều chỉnh môi trường dung dịch: trung hòa axit dư bằng từng giọt NH4OH 10% cho đến khi dung dịch chuyển màu vàng, sau đó axit hóa bằng vài giọt H2SO4 10% cho hết màu vàng.
+ Thêm 8ml dung dịch tạo màu Amoni - Molybdate. Cho nước cất đến vạch 50ml. Lắc trộn đều.
- Đo độ hấp phụ ánh sáng của hỗn dịch sau 10 phút để ở nhiệt độ phòng. So sánh độ hấp phụ ánh sáng của các dung dịch chuẩn tương ứng với dung dịch đối chứng (không chứa PO43-) ở bước sóng 882nm. Kết quảđược mô tảở hình 2.3.
Hình 2.2. Đồ thịđường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P tổng số (mg/ml) với OD882
Từ đồ thị đường chuẩn hình 2.2, ta có phương trình đường chuẩn y = 0.1462x + 0.005 với y là hàm lượng P (µg) có trong 1ml dịch, x là giá trị OD882
tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9994 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ nên phương trình trên được sử dụng để xác định hàm lượng P tổng số có trong
đất trồng.
*Xác định hàm lượng P tổng số
Bước 1: Chuẩn bị hóa chất cần thiết [ở mục 2.4.2].
Bước 2: Chiết mẫu:
- Cân 1g (sai số ± 0,01g) mẫu đất khô không khí đã qua rây 0,2mm, cho vào bình công phá (chú ý: mẫu nào khi công phá bị trào ra thì cân 0,2g).
- Cho vào bình 5ml H2SO4đậm đặc + 7 giọt axit pecloric 60% (HClO4) (xúc tác). - Công phá mẫu trong 180 phút. Để nguội.
- Nếu mẫu đất nhiều chất hữu cơ cần cho thêm 10ml HNO3 65% và đun cho oxi hóa hết chất hữu cơ.
- Thêm một ít HClO4 và tiếp tục đun cho trắng mẫu.
Bước 3: Tạo màu:
+ Dùng pipet lấy 2ml các dung dịch mẫu cho vào bình định mức 50ml. + Thêm khoảng 30ml nước cất và vài giọt chỉ thị màu α- dinitrophenol. + Điều chỉnh môi trường dung dịch: trung hòa axit dư bằng từng giọt NH4OH 10% cho đến khi dung dịch chuyển màu vàng, sau đó axit hóa bằng vài giọt H2SO4 10% cho hết màu vàng.
+ Thêm 8ml dung dịch tạo màu Amoni - Molybdate. Cho nước cất đến vạch 50ml. Lắc trộn đều.
Bước 4: So màu:
So màu trên máy đo UV- VIS cùng với dung dịch đối chứng ở bước sóng
λ=882nm.
Bước 5: Tính kết quả:
Dựa vào đồ thị chuẩn và số đo của dung dịch mẫu suy ra nồng độ ppm P của dung dịch mẫu.
Tính % P trong mẫu đất khô tuyệt đối % P = xđ đm V V m D . 10 . . 100 . 4 ; % P2O5 = 2,31 x % P
2.6.2. Phương pháp phân tích phosphate dễ tiêu trong đất (Phương pháp Olsen) [15]
* Nguyên tắc:
- Phương pháp này dựa trên nguyên lý hòa tan các dạng hợp chất P trong đất bằng dung môi là dung dịch NaHCO3 0,5M (pH = 8,5) với tỉ lệ đất : dung môi = 1:20, lắc trong 30 phút.
- Dung môi natri carbonat (pH = 8,5) chủ yếu hòa tan dạng FePO4; AlPO4 và một ít Ca3(PO4)2 . Xác định hàm lượng P trong dung dịch bằng phương pháp trắc quang “màu xanh molypden” bằng quang phổ kế.
- Phương pháp này được đánh giá phù hợp với nhiều loại đất đặc biệt với
đất trồng lúa nước.
* Dựng đồ thị đường chuẩn PO43- [15]
- Dung dịch tiêu chuẩn 50 ppm P ( 2.4.2).
- Dung dịch tiêu chuẩn 10 ppm P: hút 10ml dung dịch P tiêu chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức 100ml, sau đó thêm 40ml dung môi NaHCO3 0,5M được dung dịch P tiêu chuẩn 10 ppm.
- Xây dựng đường chuẩn:
+ Chuẩn bị 7 bình định mức 25ml. Lần lượt cho vào các bình định mức theo thứ tự số ml dung dịch tiêu chuẩn 10ppm P theo bảng sau và sau đó thêm dung dịch NaHCO3 0,5M cho đến vạch định mức:
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P
để xây dựng đường chuẩn P dễ tiêu
Số thứ tự bình (25ml) 0 1 2 3 4 5 6 Số ml tiêu chuẩn 10ppm P 0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Nồng độ ppm P 0 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 mg P trong 25ml 0 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
- Tạo màu và so màu:
+ Dùng pipet lấy 10ml các dung dịch tiêu chuẩn cho vào bình định mức 25ml.
+ Thêm 2-3 giọt chỉ thị màu 2,4 dinitrophenol và điều chỉnh môi trường đến pH = 4, bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch H2SO4 5N đến khi hết màu (có thể còn màu vàng nhạt). Lắc mẫu và để một lúc cho thoát khí CO2 (tốt nhất để mẫu qua đêm).
+ Thêm nước cất cho đến khoảng 20ml.
+ Thêm 4ml dung dịch tạo màu Amoni - Molipdate. Lắc trộn đều.
- Đo độ hấp phụ ánh sáng của hỗn dịch sau 10 phút đểở nhiệt độ phòng. So sánh
độ hấp phụ ánh sáng của các dung dịch chuẩn tương ứng với dung dịch đối chứng (không chứa PO43-) ở bước sóng 882nm. Kết quảđược mô tảở hình 2.3.
Hình 2.3. Đồ thịđường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P dễ tiêu (mg/ml) với OD882
Từđồ thịđường chuẩn hình 2.3, ta có phương trình đường chuẩn y = 0.1467x + 0.0084 với y là hàm lượng P (µg) có trong 1ml dịch, x là giá trị OD882 tương ứng. Hệ
số tương quan R2 = 0,9991 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ nên phương trình trên được sử dụng để xác định hàm lượng P dễ tiêu có trong đất trồng.
* Xác định hàm lượng P dễ tiêu:
Bước 1: Chuẩn bị hóa chất cần thiết [ở mục 2.4.2].
Bước 2: Chiết mẫu:
- Cân 5g (sai số ± 0,01g) mẫu đất khô không khí đã qua rây 2mm, cho vào bình tam giác 250ml.
- Cho vào bình 100ml dung dịch NaHCO3 0,5M.
- Lắc trong 30 phút rồi lọc. Dung dịch lọc có thể có màu do chất hữu cơ hòa tan. Nếu dung dịch có màu đậm cần khử chất hữu cơ bằng than hoạt tính không P.
Bước 3: Tạo màu:
+ Thêm 2 - 3 giọt chỉ thị màu 2,4 dinitrophenol và điều chỉnh môi trường đến pH = 4, bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch H2SO4 5N đến khi hết màu (có thể còn màu vàng nhạt). Lắc mẫu và để một lúc cho thoát khí CO2 (tốt nhất để mẫu qua đêm).
+ Thêm nước cất cho đến khoảng 20ml.
+ Thêm 4ml dung dịch tạo màu Amoni - Molybdate. Lắc trộn đều.
Bước 4: So màu:
So màu trên máy đo UV- VIS cùng với dung dịch đối chứng ở bước sóng
λ=882nm.
Bước 5: Tính kết quả:
Dựa vào đồ thị chuẩn và sốđo của dung dịch mẫu suy ra nồng độ ppm P của dung dịch mẫu.
Căn cứ vào tỉ lệđất: dung dịch suy ra pm P trong đất: ppm P = ppm P x 20 x K (đất) (dung dịch lọc) ppm P2O5 = ppm P x 2,31 K: hệ số khô kiệt của mẫu. 2.6.3. Phương pháp xác định độẩm và hệ số khô kiệt [15] * Nguyên tắc:
Dựa trên sự chênh lệch về khối lượng giữa mẫu đất khô không khí và mẫu
đất khô kiệt sau sấy ở nhiệt độ từ 100 0C -105 0C đến khối lượng không đổi để tính
độẩm và hệ số khô kiệt của mẫu đất.
* Cách tiến hành:
- Cân chính xác 5,0 g đất mịn khô không khí trên cân phân tích, cho vào hộp
đựng mẫu, xác định khối lượng lượng đất và hộp (P1).
- Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 105 0C trong khoảng 4 giờ.
- Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân khối lượng lần thứ nhất.
- Tiếp tục sấy ở 100 - 105 0C thêm khoảng 2 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân khối lượng lần thứ hai và tiếp tục làm như vậy cho
đến khi khối lượng lần cân sau không thay đổi hoặc thay đổi không quá 0,001g so với lần trước.
* Tính kết quả:
- Độẩm (A) của mẫu đất tính bằng phần trăm nước theo đất khô kiệt (%), được tính theo công thức (1):
A % = (1) Trong đó:
A%: Độẩm tính theo % trọng lượng đất khô kiệt (%) P1: Khối lượng đất ẩm (g)
P2: Khối lượng đất khô kiệt (g) 100 : Hệ số qui đổi ra %
- Hệ số khô kiệt (K) được tính theo công thức (2): K = (2)
2.7. Bố trí thí nghiệm
2.7.1. Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm
Trên nền đất thịt ở Trại thực nghiệm sinh học Bắc Từ liêm Hà Nội, mỗi thùng xốp chứa 0.125 m3 đất. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm Thí nghiệm hMùn ữu cơ
(kg)/m2
Urê
(g)/m2 (g)/m2 Lân (g)/m2 Kali VSV hữu ích (CFU/g)
ĐC(-) 0 20,7 56,85 11 0
ĐC(+) 0,5kg 20,7 56,85 11 0 TN1 0 20,7 56,85 11 VSV PG.P:105 TN2 0,5kg 20,7 56,85 11 VSV PG.P:105
Ghi chú: Mùn rác là mùn hữu cơ thu được từ quá trình xử lý rác thải sinh hoạt của nhà máy sản xuất phân bón từ chất thải Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh của Công ty Quản lý Công trình đô thị Hà Tĩnh.
Bổ sung dịch vi sinh vật phân giải phosphate vào các thí nghiệm (TN1, TN2) với liều lượng 12,5 ml dịch nuôi cấy để mật độ vi khuẩn phân giải P khó tan trong mẫu đất thí nghiệm khoảng 105 CFU/ml.
Trồng cây và chăm bón cây hàng ngày, đến ngày thứ 30 và 60 thì bón bổ sung N, P, K cho tất cả các phương án thí nghiệm (với lượng bằng 50% so với ban đầu).
Tiến hành lấy mẫu tại thời điểm: ngày đầu, 30, 60 và 90 ngày để xác định mật độ VSV, hàm lượng photpho tổng và dễ tiêu. Và tại thời điểm ngày thứ 90 tiến hành đánh giá sự sinh trưởng và năng suất của cây đỗ xanh.
Theo dõi đo chiều cao của cây tại thời điểm 30, 60, và 90 ngày,sau đó xử lí số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học
2.7.2. Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng
Trên nền đất thịt ở Trại thực nghiệm sinh học Bắc Từ Liêm Hà Nội, mỗi thí nghiệm 15 m2 đất. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2.4: Bố trí thi nghiệm quy mô đồng ruộng Thí nghiệm hMùn ữu cơ (kg)/m2 Urê (g)/m2 Lân (g)/m2 Kali (g)/m2 VSV hữu ích (CFU/g) ĐC(-) 0 20,7 56,85 11 0 ĐC(+) 0,5kg 20,7 56,85 11 0 TN1 0 20,7 56.85 11 VSV PG.P:105 TN2 0,5kg 20,7 56,85 11 VSV PG.P:105 Diện tích 100m2 = 106 cm2, sâu 10 cm => Thể tích mặt đất là 106.10 = 107 cm3
Mật độ vi khuẩn trong dịch vi sinh vật là 109 CFU/ml = 109 CFU/cm3 => Vậy đểđạt được mật độ vi khuẩn là 105 CFU/ml cần:
105 = 10
9 . x
Trong đó: x là thể tích dịch nuôi cấy 107
=> x = 103 ml = 1 lít => Vậy trên 100 m2 cần bón 1 lít dịch nuôi cấy
Trên 15 m2 đất thí nghiệm cần bón 150ml dịch nuôi cấy để mật độ vi khuẩn phân giải phosphate khó tan trong các mẫu thí nghiệm đạt khoảng 105 - 106 CFU/g.
Sau đó tiến hành trồng cây và chăm bón cây hàng ngày, đến ngày thứ 30 thì bón bổ sung N, P, K cho tất cả các phương án thí nghiệm (với lượng bằng 50% so với ban đầu).
Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm 0, 30 và 60 ngày để xác định mật độ vi sinh vật, hàm lượng photpho tổng, photpho dễ tiêu và tại thời điểm ngày thứ 60 tiến hành đánh giá sinh trưởng cây bắp cải, cây ngô vào ngày thứ 90.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quảảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng đỗ xanh trong phòng thí nghiệm trồng đỗ xanh trong phòng thí nghiệm
Quá trình thí nghiệm chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở quy mô trong các thùng xốp phòng thí nghiệm. Kết quả thu được như sau.
3.1.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với hàm lượng photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất
Photpho là một trong những thành phần dinh dưỡng của đất cần thiết cho sự
sinh trưởng và phát triển của cây trồng, vì vậy chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên hàm lượng photpho trong đất trồng cây đỗ xanh, thí nghiệm được bố trí như sau :
- ĐC(-): mẫu đất thường.
- ĐC(+): mẫu đất có bổ sung mùn rác thải sinh hoạt.
- TN1: mẫu đất không bổ sung mùn rác thải sinh hoạt, có bổ sung thêm dịch nuôi cấy VSV phân giải P.
- TN2: mẫu đất có bổ sung mùn rác thải sinh hoạt và có bổ sung thêm dịch VSV phân giải P.
- Kết quả thu được:
Trước tiên là ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate lên hàm lượng photpho tổng số trong đất, kết quả (hình 3.1) cho thấy như sau:
HÀM LƯỢNG P TỔNG SỐ MẪU ĐẤT ĐỖ XANH PTN 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 30 60 90Ngày % P Tổng số ĐC (-) ĐC(+) TN1 TN2
Kết quảở hình 3.1 cho thấy, hàm lượng photpho tổng trong đất ở tất cả các