* Nguyên tắc:
- Phương pháp này dựa trên nguyên lý hòa tan các dạng hợp chất P trong đất bằng dung môi là dung dịch NaHCO3 0,5M (pH = 8,5) với tỉ lệ đất : dung môi = 1:20, lắc trong 30 phút.
- Dung môi natri carbonat (pH = 8,5) chủ yếu hòa tan dạng FePO4; AlPO4 và một ít Ca3(PO4)2 . Xác định hàm lượng P trong dung dịch bằng phương pháp trắc quang “màu xanh molypden” bằng quang phổ kế.
- Phương pháp này được đánh giá phù hợp với nhiều loại đất đặc biệt với
đất trồng lúa nước.
* Dựng đồ thị đường chuẩn PO43- [15]
- Dung dịch tiêu chuẩn 50 ppm P ( 2.4.2).
- Dung dịch tiêu chuẩn 10 ppm P: hút 10ml dung dịch P tiêu chuẩn 50 ppm cho vào bình định mức 100ml, sau đó thêm 40ml dung môi NaHCO3 0,5M được dung dịch P tiêu chuẩn 10 ppm.
- Xây dựng đường chuẩn:
+ Chuẩn bị 7 bình định mức 25ml. Lần lượt cho vào các bình định mức theo thứ tự số ml dung dịch tiêu chuẩn 10ppm P theo bảng sau và sau đó thêm dung dịch NaHCO3 0,5M cho đến vạch định mức:
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P
để xây dựng đường chuẩn P dễ tiêu
Số thứ tự bình (25ml) 0 1 2 3 4 5 6 Số ml tiêu chuẩn 10ppm P 0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Nồng độ ppm P 0 0,005 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 mg P trong 25ml 0 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
- Tạo màu và so màu:
+ Dùng pipet lấy 10ml các dung dịch tiêu chuẩn cho vào bình định mức 25ml.
+ Thêm 2-3 giọt chỉ thị màu 2,4 dinitrophenol và điều chỉnh môi trường đến pH = 4, bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch H2SO4 5N đến khi hết màu (có thể còn màu vàng nhạt). Lắc mẫu và để một lúc cho thoát khí CO2 (tốt nhất để mẫu qua đêm).
+ Thêm nước cất cho đến khoảng 20ml.
+ Thêm 4ml dung dịch tạo màu Amoni - Molipdate. Lắc trộn đều.
- Đo độ hấp phụ ánh sáng của hỗn dịch sau 10 phút đểở nhiệt độ phòng. So sánh
độ hấp phụ ánh sáng của các dung dịch chuẩn tương ứng với dung dịch đối chứng (không chứa PO43-) ở bước sóng 882nm. Kết quảđược mô tảở hình 2.3.
Hình 2.3. Đồ thịđường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P dễ tiêu (mg/ml) với OD882
Từđồ thịđường chuẩn hình 2.3, ta có phương trình đường chuẩn y = 0.1467x + 0.0084 với y là hàm lượng P (µg) có trong 1ml dịch, x là giá trị OD882 tương ứng. Hệ
số tương quan R2 = 0,9991 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ nên phương trình trên được sử dụng để xác định hàm lượng P dễ tiêu có trong đất trồng.
* Xác định hàm lượng P dễ tiêu:
Bước 1: Chuẩn bị hóa chất cần thiết [ở mục 2.4.2].
Bước 2: Chiết mẫu:
- Cân 5g (sai số ± 0,01g) mẫu đất khô không khí đã qua rây 2mm, cho vào bình tam giác 250ml.
- Cho vào bình 100ml dung dịch NaHCO3 0,5M.
- Lắc trong 30 phút rồi lọc. Dung dịch lọc có thể có màu do chất hữu cơ hòa tan. Nếu dung dịch có màu đậm cần khử chất hữu cơ bằng than hoạt tính không P.
Bước 3: Tạo màu:
+ Thêm 2 - 3 giọt chỉ thị màu 2,4 dinitrophenol và điều chỉnh môi trường đến pH = 4, bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch H2SO4 5N đến khi hết màu (có thể còn màu vàng nhạt). Lắc mẫu và để một lúc cho thoát khí CO2 (tốt nhất để mẫu qua đêm).
+ Thêm nước cất cho đến khoảng 20ml.
+ Thêm 4ml dung dịch tạo màu Amoni - Molybdate. Lắc trộn đều.
Bước 4: So màu:
So màu trên máy đo UV- VIS cùng với dung dịch đối chứng ở bước sóng
λ=882nm.
Bước 5: Tính kết quả:
Dựa vào đồ thị chuẩn và sốđo của dung dịch mẫu suy ra nồng độ ppm P của dung dịch mẫu.
Căn cứ vào tỉ lệđất: dung dịch suy ra pm P trong đất: ppm P = ppm P x 20 x K (đất) (dung dịch lọc) ppm P2O5 = ppm P x 2,31 K: hệ số khô kiệt của mẫu. 2.6.3. Phương pháp xác định độẩm và hệ số khô kiệt [15] * Nguyên tắc:
Dựa trên sự chênh lệch về khối lượng giữa mẫu đất khô không khí và mẫu
đất khô kiệt sau sấy ở nhiệt độ từ 100 0C -105 0C đến khối lượng không đổi để tính
độẩm và hệ số khô kiệt của mẫu đất.
* Cách tiến hành:
- Cân chính xác 5,0 g đất mịn khô không khí trên cân phân tích, cho vào hộp
đựng mẫu, xác định khối lượng lượng đất và hộp (P1).
- Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 105 0C trong khoảng 4 giờ.
- Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân khối lượng lần thứ nhất.
- Tiếp tục sấy ở 100 - 105 0C thêm khoảng 2 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân khối lượng lần thứ hai và tiếp tục làm như vậy cho
đến khi khối lượng lần cân sau không thay đổi hoặc thay đổi không quá 0,001g so với lần trước.
* Tính kết quả:
- Độẩm (A) của mẫu đất tính bằng phần trăm nước theo đất khô kiệt (%), được tính theo công thức (1):
A % = (1) Trong đó:
A%: Độẩm tính theo % trọng lượng đất khô kiệt (%) P1: Khối lượng đất ẩm (g)
P2: Khối lượng đất khô kiệt (g) 100 : Hệ số qui đổi ra %
- Hệ số khô kiệt (K) được tính theo công thức (2): K = (2)
2.7. Bố trí thí nghiệm
2.7.1. Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm
Trên nền đất thịt ở Trại thực nghiệm sinh học Bắc Từ liêm Hà Nội, mỗi thùng xốp chứa 0.125 m3 đất. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm Thí nghiệm hMùn ữu cơ
(kg)/m2
Urê
(g)/m2 (g)/m2 Lân (g)/m2 Kali VSV hữu ích (CFU/g)
ĐC(-) 0 20,7 56,85 11 0
ĐC(+) 0,5kg 20,7 56,85 11 0 TN1 0 20,7 56,85 11 VSV PG.P:105 TN2 0,5kg 20,7 56,85 11 VSV PG.P:105
Ghi chú: Mùn rác là mùn hữu cơ thu được từ quá trình xử lý rác thải sinh hoạt của nhà máy sản xuất phân bón từ chất thải Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh của Công ty Quản lý Công trình đô thị Hà Tĩnh.
Bổ sung dịch vi sinh vật phân giải phosphate vào các thí nghiệm (TN1, TN2) với liều lượng 12,5 ml dịch nuôi cấy để mật độ vi khuẩn phân giải P khó tan trong mẫu đất thí nghiệm khoảng 105 CFU/ml.
Trồng cây và chăm bón cây hàng ngày, đến ngày thứ 30 và 60 thì bón bổ sung N, P, K cho tất cả các phương án thí nghiệm (với lượng bằng 50% so với ban đầu).
Tiến hành lấy mẫu tại thời điểm: ngày đầu, 30, 60 và 90 ngày để xác định mật độ VSV, hàm lượng photpho tổng và dễ tiêu. Và tại thời điểm ngày thứ 90 tiến hành đánh giá sự sinh trưởng và năng suất của cây đỗ xanh.
Theo dõi đo chiều cao của cây tại thời điểm 30, 60, và 90 ngày,sau đó xử lí số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học
2.7.2. Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng
Trên nền đất thịt ở Trại thực nghiệm sinh học Bắc Từ Liêm Hà Nội, mỗi thí nghiệm 15 m2 đất. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2.4: Bố trí thi nghiệm quy mô đồng ruộng Thí nghiệm hMùn ữu cơ (kg)/m2 Urê (g)/m2 Lân (g)/m2 Kali (g)/m2 VSV hữu ích (CFU/g) ĐC(-) 0 20,7 56,85 11 0 ĐC(+) 0,5kg 20,7 56,85 11 0 TN1 0 20,7 56.85 11 VSV PG.P:105 TN2 0,5kg 20,7 56,85 11 VSV PG.P:105 Diện tích 100m2 = 106 cm2, sâu 10 cm => Thể tích mặt đất là 106.10 = 107 cm3
Mật độ vi khuẩn trong dịch vi sinh vật là 109 CFU/ml = 109 CFU/cm3 => Vậy đểđạt được mật độ vi khuẩn là 105 CFU/ml cần:
105 = 10
9 . x
Trong đó: x là thể tích dịch nuôi cấy 107
=> x = 103 ml = 1 lít => Vậy trên 100 m2 cần bón 1 lít dịch nuôi cấy
Trên 15 m2 đất thí nghiệm cần bón 150ml dịch nuôi cấy để mật độ vi khuẩn phân giải phosphate khó tan trong các mẫu thí nghiệm đạt khoảng 105 - 106 CFU/g.
Sau đó tiến hành trồng cây và chăm bón cây hàng ngày, đến ngày thứ 30 thì bón bổ sung N, P, K cho tất cả các phương án thí nghiệm (với lượng bằng 50% so với ban đầu).
Tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm 0, 30 và 60 ngày để xác định mật độ vi sinh vật, hàm lượng photpho tổng, photpho dễ tiêu và tại thời điểm ngày thứ 60 tiến hành đánh giá sinh trưởng cây bắp cải, cây ngô vào ngày thứ 90.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quảảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng đỗ xanh trong phòng thí nghiệm trồng đỗ xanh trong phòng thí nghiệm
Quá trình thí nghiệm chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở quy mô trong các thùng xốp phòng thí nghiệm. Kết quả thu được như sau.
3.1.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với hàm lượng photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất
Photpho là một trong những thành phần dinh dưỡng của đất cần thiết cho sự
sinh trưởng và phát triển của cây trồng, vì vậy chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên hàm lượng photpho trong đất trồng cây đỗ xanh, thí nghiệm được bố trí như sau :
- ĐC(-): mẫu đất thường.
- ĐC(+): mẫu đất có bổ sung mùn rác thải sinh hoạt.
- TN1: mẫu đất không bổ sung mùn rác thải sinh hoạt, có bổ sung thêm dịch nuôi cấy VSV phân giải P.
- TN2: mẫu đất có bổ sung mùn rác thải sinh hoạt và có bổ sung thêm dịch VSV phân giải P.
- Kết quả thu được:
Trước tiên là ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate lên hàm lượng photpho tổng số trong đất, kết quả (hình 3.1) cho thấy như sau:
HÀM LƯỢNG P TỔNG SỐ MẪU ĐẤT ĐỖ XANH PTN 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 30 60 90Ngày % P Tổng số ĐC (-) ĐC(+) TN1 TN2
Kết quảở hình 3.1 cho thấy, hàm lượng photpho tổng trong đất ở tất cả các thí nghiệm đều giảm theo thời gian sinh trưởng của cây, mặc dù trong quá trình chăm sóc có tiến hành bổ sung thêm phân NPK vào ngày thứ 30 và ngày thứ 60.
Trong giai đoạn từ 0-30 ngày đầu tổng photphot trong đất có giảm nhưng không nhiều, đây là giai đoạn cây non, nên nhu cầu sử dụng photpho chưa cao, giai
đoạn từ 30- 90 ngày hàm lượng P tổng số giảm mạnh. Điều này giải thích như sau: do thời điểm này cây cần nhiều photpho cho quá trình cứng cây, ra hoa tạo quả nên cây hấp thụ nhiều hơn dẫn đến hàm lượng P tổng số giảm mạnh ở các mẫu thí nghiệm. Như vậy, điều này cho thấy việc bổ sung vi khuẩn phân giải P có tác động mạnh đến sự thay đổi hàm lượng P tổng số trong đất đối với cây trồng.
Kết quả so sánh quá trình thay đổi hàm lượng P tổng số giảm ở các TN tại thời điểm 30 ngày và 90 ngày cho thấy: TN1 giảm so với ĐC(-) từ 4,7% - 40,7% và giảm so với ĐC(+) từ 3,1% - 36,7%. TN2 giảm so với ĐC(-) từ 8,5 - 49,2% và giảm so với ĐC(+) từ 6,9% - 45,7%. TN2 giảm so với TN1 từ 3,9 - 14,3%.
Như vậy quá trình giảm mạnh hàm lượng P tổng số trong đất như vậy cho thấy mật độ VSV phân giải phosphate bổ sung vào trong đất có tác động tích cực
đến quá trình chuyển hóa P trong đất.
Đối với P dễ tiêu trong đất trong quá trình phân tích được trình bày ở
hình 3.2.
HÀM LƯỢNG P DỄ TIÊU MẪU ĐẤT ĐỖ XANH PTN
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 30 60 90Ngày P2O 5(mg/kg) ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, trong suốt thời gian sinh trưởng của cây đỗ
xanh (từ 0 - 90 ngày), hàm lượng P dễ tiêu trong mẫu đất TN1, TN2 có bổ sung vi khuẩn phân giải P khó tan luôn cao hơn so với mẫu đối chứng không bổ sung VSV, như vậy các chủng vi khuẩn phân giải P bổ sung vào đất đã chuyển hóa P khó tiêu thành P dễ tiêu trong đất tốt hơn so với các vi sinh vật phân giải P khó tiêu có sẵn trong đất. Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng P dễ tiêu của cây đỗ xanh ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau có khác nhau, ở giai đoạn (từ 0-60 ngày) là giai
đoạn cây sinh trưởng và phát triển sinh khối nên nhu cầu sử dụng P của cây thấp hơn so với giai đoạn (từ 60-90 ngày). Mặc dù ở ngày thứ 60 có bổ sung NPK nhưng hàm lượng P trong đất ở ngày thứ 90 vẫn bị giảm mạnh hơn so với ngày thứ 30 và 60. Điều này giải thích như sau: vì thời gian từ 60 đến 90 ngày là thời gian cây cần nhiều P cho quá trình cứng cây, ra hoa tạo quả hơn, hình thành hạt so với giai đoạn trước nên làm hàm lượng photpho giảm nhanh.
Kết quả so sánh quá trình thay đổi hàm lượng P dễ tiêu tăng ở các TN tại thời
điểm 30 ngày và 90 ngày cho thấy: TN1 tăng so với ĐC(-) từ 36,7% - 84%, tăng so với ĐC(+) từ 30,6% - 47,7%. TN2 tăng so với ĐC(-) từ 43% - 99,8%, tăng so với
ĐC(+) từ 36,5% - 60,4%. TN2 tăng so với TN1 từ 4,6% - 8,6%.
Như vậy có thể khẳng định được, các chủng vi khuẩn phân giải phosphate khó tan khi bổ sung vào đất trồng cây đỗ xanh có tác dụng phân giải P khó tiêu sang photpho dễ tiêu có hiệu quả cao.
3.1.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên các vi sinh vật trong đất trong đất
VSV là một trong những chỉ tiêu để đánh giá xem nhóm VSV hữu ích đưa vào đất có khả năng tồn tại phát triển cũng các VSV khác hay không? Nó có gây ức chế các nhóm vi sinh vật trong đất hay không ? Kết quả phân tích mật độ của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan và vi khuẩn tổng số trong đất trồng cây đỗ xanh
Bảng 3.1. Mật độ VSV phân giải phosphate và VSV tổng số hiếu khí ở các mẫu đất trồng cây đỗ xanh
Môi trường Tên TN 0 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày
VSV phân giải phosphate ĐC(-) 2,50x103 2,70 x103 5,70 x103 2,95 x103 ĐC(+) 2,50 x103 2,20 x103 6,10 x103 3,20 x103 TN1 6,46 x105 2,55 x106 2,95 x106 3,69 x106 TN2 6,46 x105 2,65 x106 4,30 x106 6,63 x106 VSV tổng số hiếu khí ĐC(-) 1,94 x107 1,15 x107 1,97 x107 2,10 x107 ĐC(+) 2,0 x107 3,30 x107 4,56 x107 5,35 x107 TN1 1,94 x107 2,05 x107 3,05 x107 4,15 x107 TN2 2,00 x107 3,35 x107 4,63 x107 5,70 x107 Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, mật độ VK phân giải phosphate khó tan trong đất ở các mẫu khác nhau có sự biến động theo thời gian sinh trưởng của cây
đỗ xanh. Mật độ vi khuẩn ở các mẫu thí nghiệm (TN1, TN2) có bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn phân giải phosphate khó tan tăng theo thời gian và đạt mật độ106 CFU/g 90 ngày thí nghiệm, trong khi đó ở các mẫu đối chứng mật độ vi khuẩn phân giải phosphate khó tan có thay đổi nhưng không đáng kể so với ngày đầu (đạt 103 CFU/g). Kết quảở bảng 3.3 cũng cho thấy mật độ của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan ở trong các mẫu đất có bổ sung mùn hữu cơ cao hơn so với trong mẫu đất không bổ sung mùn, tuy nhiên sự khác biệt chưa cao.
Kết quả đánh giá mật độ của tổng vi khuẩn hiếu khí (bảng 3.1) cũng cho thấy, mật độ vi khuẩn hiếu khí trong các mẫu đất không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu thí nghiệm có bổ sung vi khuẩn phân giải phosphate khó tan với mẫu đất không bổ sung, điều này cho thấy vi khuẩn phân giải phosphate khó tan không gây ức chế các vi khuẩn có trong môi trường đất. Tuy nhiên ở
các mẫu bổ sung thêm mùn hữu cơ mật độ vi khuẩn hiếu khí trong đất có cao hơn. Điều này có thể giải thích như sau: khi bổ sung thêm mùn vào trong đất