Phương pháp cố định α amylase trên chất mang chitosan rắn

Phương pháp cố định α amylase trên chất mang chitosan rắn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về enzyme α-amylase.

1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme α-amylase [1, 2].

- Là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α – 1,4 – glucoside một cách ngẫu nhiên ở vị tríbất kì nhưng chủ yếu tập trung giữa mạch amylose và amylopectin nên nó thuộc loại endo– enzyme Các α-amylase được phân loại theo hoạt động và tính chất của chúng , α-amylase thủy phân tinh bột tạo thành sản phẩm là các dextrin phân tử nhỏ, maltose vàglucose Tuy nhiên, tùy nguồn gốc mà α-amylase từ các vi sinh vật có thể có sản phẩmthủy phân theo tỷ lệ các thành phần không giống nhau (Forgaty 1990) [1]

- Một số α-amylase tạo maltose: khi sử dụng α-amylase từ nấm mốc Asp.oryzae các sản

phẩm chính của quá trình thủy phân thường là maltose và maltotriose ; α-amylase từ

Streptomyces hygroscopicus là một endo – enzyme có thể thủy phân tinh bột tới 75 -85 %

sản phẩm chứa maltose Enzyme này còn có hoạt tính transglycosylase, maltotriose đượcchuyển thành maltotetraose sau đó thủy phân thành maltose mà không tạo ra glucose; α-

amylase ngoại bào của chủng Thermonospora có khả năng thủy phân tinh bột cho sản

phẩm chính là glucose và maltose (Forgaty 1990, Neidleman 1991) [2]

1.1.2 Cấu tạo của α-amylase [1, 2, 3, 4]

Cấu tạo của α-amylase gồm ba tiểu đơn vị, A là tiểu đơn vị lõi được nối với tiểu đơn

C có cấu trúc 8 đoạn β – sheet, tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β – sheet được lồng vào tiểu đơn

vị A Tiểu đơn vị B quyết định hoạt tính enzyme và liên kết enzyme – cơ chất Nó cũngảnh hưởng đến isoform và các tính chất đặc biệt của isoform này Có một ion Ca2+ nốigiữa tiểu đơn vị A và B Tuy nhiên, ở α-amylase của nấm mốc, liên kết này yếu và có thể

bị hạn chế (Brzozowski 1997, 2000, Ferrari 1993, Marco 1996)

Tâm hoạt động:

- Có chứa một số gốc acid amin đặc hiệu Thông thường các nhóm đặc hiệu của nó

là nhân imidazol và nhóm hydroxyl

- α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylase có tính chất của acid yếu và tính chất của globulin

- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 – 5,7 Phân tử lượng của các α-amylase

từ các nguồn khác nhau rất gần nhau (của nấm mốc 45000 – 50000, của malt 59000)

- Trong amylase rất ít methinonine và chỉ có khoảng 7- 10 gốc cystenie trừ

α-amylase của Bac.subtilis không có các liên kết sulfuahydryl và disulfuahydryl.

- Trong thành phần acid amin của α-amylase của Asp.oryzae có chứa ít arginine và

histidine nên cũng chứa ít nhóm amin và hàm lượng nito, do đó chúng mang tính acidhơn

Phần lớn α-amylase có phân tử lượng tương đối gần nhau (khoảng 40000 Da) song

có những trường hợp như α-amylase của B.stearolthermophilus có phân tử lượng là

15600 Da (Campbell, Manning1964) Người ta nhận thấy rằng phân tử lượng của amylase giảm đi (chỉ còn khoảng 14000 đến 15000) còn hàm lượng Ca lại tăng theo nhiệt

α-độ nuôi vi sinh

Không giống các α-amylase khác, α-amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi

protein là polysaccharide Polyose này bao gồm 8 mol manose, 1 mol glucose, 2 molhexoseamin trên 1 mol enzyme (Akabori và cộng sự, 1955) Vai trò của các polyose nàyvẫn chưa rõ, song người ta đã biết rằng nó không tham gia vào thành phần trung tâm hoạtđộng và nằm ở phía trong phân tử enzyme

Calcium và vai trò của nó trong phân tử α-amylase [5]:

- α-amylase là một metalloenzyme (enzyme cơ kim) Các α-amylase đều chứa từ 1 –

30 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi phân tử enzyme thì α-amylasemất hết khả năng thủy phân cơ chất Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúcbậc 3 của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme (Molodova, 1965)

- Calcium còn bảo đảm độ bền của α-amylase đối với tác động gây biến tính và sựphân hủy bởi các enzyme phân hủy protein

- α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Đặc tính này có thể liên quanđến hàm lượng calcium trong phân tử của nó

- α-amylase của vi khuẩn ưa nhiệt có chứa calcium nhiều hơn của α-amylase từ nấmmốc nên nó bền nhiệt hơn

- Ion Ca2+ làm ổn định amylase của malt, của vi sinh vật (trong đó có cả 3 loại

α-amylase từ Asp.flavus, Asp.awamori, Asp.oryzae) α-α-amylase từ Asp.awamori và từ Asp.oryzae được ổn định bởi Al3+, ion sắt ức chế hoạt động của α-amylase từ

Asp.awamori và từ Asp.oryzae.

Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng ( Cu2+, Hg2+, Ag+…).Các kim loại như Li+, Na+, Mg2+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Cd2+, Sn2+ không ảnh hưởng mấyđến α-amylase

1.1.3 Cơ chất của enzyme α-amylase [6, 7]

Cơ chất của quá trình thủy phân: gồm các polysaccharide chứa các liên kết α – glucoside và chủ yếu là các glucan: tinh bột và glycogen (tinh bột động vật)

1,4-1.1.3.1 Tinh bột.

- Tinh bột bao gồm hai cấu tử là amylose và amylopectin, các chất này khác hẳnnhau về tính chất lý học và hóa học Amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin lạitạo màu tím đỏ Chúng cũng khác nhau về tính hòa tan Amylose dễ hòa tan trong nước

ấm và tạo dung dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ tan trong nước nóng vàtạo dung dịch có độ nhớt cao Về phân tử lượng cũng có sự khác biệt rõ rệt Amylose cóphân tử lượng từ 3.105 – 106, còn amylopectin có phân tử lượng từ 5.104 – 106 Trong tinhbột tỷ lệ amylose và amylopectin thường là 1:4.

- Về cấu tạo: hai thành phần trên đều có chứa các đơn vị cấu tạo là glucose Trongamylose các gốc glucose được gắn với nhau nhờ liên kết α – 1,4 – glucoside tạo nên mộtchuỗi dài gồm 200 – 1000 gốc glucose Phân tử amylose bao gồm một số chuỗi xếp songsong nhau, trong đó các gốc glucose cuộn lại theo hình xoắn ốc Mỗi chuỗi amylose cómột đầu không khử và một đầu khử

- Trong phân tử amylopectin, các gốc glucose không những gắn với nhau nhờ liênkết α – 1,4 – glucoside mà còn nhờ liên kết α – 1,6 – glucoside Vì thế mà nó có cấu trúcnhánh Phân tử amylopectin chỉ có một đầu khử duy nhất Người ta còn tìm thấy trongthành phần của phân tử amylopectin còn có một ít phospho Phospho được gắn vàonguyên tử cacbon thứ sáu của gốc glucose

1.1.4 Cơ chế xúc tác [1, 2, 8].

Cơ chế phản ứng thủy phân tinh bột:

- Không phụ thuộc nguồn gốc của chất xúc tác, mỗi khi mối liên kết α – 1,4 –glucoside bị phân cắt thì tại ngay điểm đó lập tức được liên kết với các nhóm ion củanước

- Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột ở trong môi trường giàu nước bởi enzyme amylase , người ta thấy rằng, các chất xúc tác bẻ gẫy mối liên kết glucoside giữa cacbon

α-số 1 (C1) với nguyên tử oxy Ở mạch amylose, khi mối liên kết α – 1,4 – glucoside bịphân cắt thì nhóm hydroxyl (OH-) của nước sẽ liên kết với cacbon số 1 (C1) của gốcglucoside bên trái, còn cation hidro (H+) sẽ liên kết với O- ở nguyên tử C4 ở gốc glucosidebên phải Đối với mạch amylopectin, khi mối liên kết α – 1,6 – glucoside bị cắt đứt, thìnhóm OH- của nước sẽ liên kết với nguyên tử C1 ở mạch chính, còn H+ sẽ liên kết với O- ởnguyên tử C6 ở mạch nhánh

- Một cách tổng quát, nếu tất cả các mối liên kết glucoside của tinh bột bị phân cắt(bao gồm n gốc) thì cần có (n – 1) phân tử nước để liên kết với chúng và sẽ tạo ra n phân

tử đường glucose Nhưng vì n là đại lượng lớn cho nên hiệu số n và (n-1) có thể xem làkhông đáng kể Lúc đó phương trình thủy phân tinh bột có thể biểu diễn:

n162 n/2 18 n/2 342

- Một đặc điểm quan trọng của liên kết glucoside trong các polysaccharide là chỉ cócác electron δ mà không có các electron π tham gia Trong trường hợp như vậy, đóng vaitrò phân cực là electron δ Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm còn gây ramột sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử oxy, nên nó tích điện âm

- α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau α-amylasekhông chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột chưa hồ hóa nhưngvới tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá tình nhiều giai đoạn [1,8]:

- Ở giai đoạn đầu – giai đoạn dextrin hóa – chỉ một số liên kết trong phân tử có thể

bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột bịgiảm nhanh (cả amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

- Ở giai đoạn thứ hai – giai đoạn đường hóa- các dextrin phân tử thấp vừa mới tạothành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose không tạo màu với iod Cácchất này bị thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới disaccharide và monosaccharide

- Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thànholigosaccharide gồm 6 -7 gốc glucose ( 6 -7 gốc glucopyranose một) Sau đó cácpolyglucose này lại bị phân cắt tiếp tục nên các polyglucose này cứ ngắn dần lại và bịphân giải chậm đến maltotetraose, maltotriose và maltose

- Qua một thời gian dài dưới tác động của amylase, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose

α Tác dụng của αα amylase lên amylopectin cũng tương tự, nhưng vì αα amylasekhông phân cắt được liên kết α – 1,6 – glucoside ở chổ mạch nhánh trong phân tửamylopectin nên dù có tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nóitrên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin thấp phân tử và isomaltose (8%)

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose,maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bộtchủ yếu tạo ra dextrin thấp phân tử không cho màu với iod và một ít maltose Vì vậy,

người ta thường gọi nó là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Sơ đồ biểu diễn cho

sự thủy phân này như sau:

Pakumuro và cộng sự cho rằng trong số các amylase của vi khuẩn có loại amylase dextrin hóa, có loại α-amylase đường hóa Khi thủy phân tinh bột bằng α-amylase đường hóa thì có tới 60% (và hơn nữa) tinh bột bị phân giải, còn bằng α-amylasedextrin hóa thì mức độ depolymer hóa không vượt quá 30 – 40% (Robyt, Prench, 1977)

α-So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóavượt trội hơn là hoạt lực đường hóa Theo số liệu của Lifsitx và Braznitsenco, khả năng

dextrin hóa của chế phẩm enzyme từ asp.oryzae cao hơn khả năng đường hóa 1,75 lần, còn ở Bac.subtilis thì cao hơn 2 lần (2000).

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột không còn nguyên,còn α-amylase của vi khuẩn lại có khả năng phân hủy các hạt tinh bột chưa được hồ hóalần hồ tinh bột (Brovaretx,Popadicts và đồng sự, 1967) Chế phẩm α-amylase của

B.subtilis phân giải hạt tinh bột chưa được hồ hóa 2 -2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase

của nấm mốc ( Lixink, Popadicts, 2001)

Ở các giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụngcủa α-amylase từ vi khuẩn Dextrin do α-amylase của vi khuẩn tạo ra khi phân giải tinhbột có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc

+ H2O 

α-amylase của vi khuẩn Bac.subtilis tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có mạch

dài khoảng 6 – 8 gốc glucose ( G6, G7, G8) Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo

Fenikxova và Ermosina cho biết rằng các maltopentaose và maltohexaose thủy phântheo sơ đồ sau:

α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn không tấn công liên kết α – 1,6 – glucoside củaamylopectin nên khi thủy phân, nó sẽ tạo thành các dextrin giới hạn phân nhánh Sảnphẩm đầu tiên của sự phân giải amylopectin bởi α-amylase vi khuẩn là dextrin có 6 gốcglucose, còn sản phẩm cuối cùng là glucose, maltose và các maltodextrin (saccharide cóphân nhánh) từ các maltodiose đến maltohexaose Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinhbột dưới tác dụng của α-amylase của nấm mốc chủ yếu là maltose, tiếp đến là maltotriose(Sproster, Uhlig, 1987)

Nếu dùng nồng độ α-amylase vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 -85%tinh bột thành đường lên men Với α-amylase vi khuẩn, tinh bột bị thủy phân thànhglucose và maltose đến 70 -75% Còn với α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóađến glucose và maltose có thể đến 84 – 87%

Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α-amylase vi khuẩn Bac.subtilis ở giai đoạn đầu cao hơn α-amylase Asp.oryzae tới 20% và giảm mạnh khi đạt được 30 – 32% sự thủy phân.

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme α-amylase [1, 4, 8, 9].

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giốngnhau

pH:

- α-amylase từ nấm mốc có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 – 4,8 ; pH tối thíchcủa đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,7 – 5,4)

và của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 ( hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 – 7,0)

- Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của

chế phẩm α-amylase từ Asp.oryzae giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2 (2000).

Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 –7,0 (2001)

- Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α-amylase của nấm mốc

Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis.

Ở pH 3,6 và nhiệt độ 00C, amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 30 phút; amylase của vi khuẩn bị vô hoạt 50%; trong khi đó hoạt lực của α-amylase từ nấm mốchầu như không giảm bao nhiêu (Fenikxcova, Ermoshina, 2005)

- Trong dung dịch α-amylase của nấm mốc được bảo quản tốt ở pH 5,0 – 5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm mốc đen có thể chịu được pH 2,5 – 2,8 Ở 00C và ở pH 2,5

α-nó chỉ bị vô hoạt sau một giờ (Bernfeld, Okazaki, Kitahara, Kurushima, Ermoshina,2005)

- Ngoài α-amylase không bền acid ra, các loại nấm mốc Asp Awamori, Asp Butatea, Asp.usamii còn tạo ra tới 5 – 10% α-amylase bền acid Trong khi đó nấm mốc Asp.niger 475 lại chỉ tạo ra các α-amylase bền acid Nó không bị mất hoạt tính ở pH 2,5;

nhiệt độ 300C trong vòng 1 giờ

Bảng 1.1: Độ bền acid của α-amylase mốc đen [8].

Hoạt độ dextrinhóa tổng số(đv/ml)

Hoạt độ dextrinhóa bền acid(đv/ml)

Hoạt độ dextrinhóa bền acid, %hoạt độ tổng số

Nhiệt độ:

- Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhaucũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy với tác động của nhiệt, nhiệt độtối thích của nó là 500C, α-amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt độngtối thích ở 58 – 60oC Trong sản xuất rượu người ta thường đường hóa bằng canh trườngnấm mốc ở 50 – 52oC, và bằng malt ở 60 – 65oC, α-amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệtcao hơn cả Nhiệt độ tối thích của nó là 70 – 75oC (Liphsis, Bragnitsenko, 1997), α-

amylase của Bac.stearothermophilus… vẫn giữ được hoạt lực trong một thời gian dài ở

85oC và cao hơn nữa (Manning Campbell, Karpukina, 2001)

- α-amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92oC trong khi đó α-amylase củanấm mốc bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 2002) Trong dung dịch hồ tinh bột, α-amylase của

vi khuẩn chỉ bắt đầu vô hoạt nhanh khi nhiệt độ cao hơn 770C Ở 700C, α-amylase củanấm mốc đã bị mất 50% hoạt lực, còn α-amylase của malt hầu như chưa bị mất hoạt lực

Bảng 1.2: Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau (Miller, Johnson, 2005)

- Trong dung dịch đệm pH 4,7; α-amylase của asp.oryzae rất nhạy với tác động của

nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%,hoạt lực đường hóa còn 27 – 85% Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nó bị vô hoạt hóahoàn toàn

- Miller và cộng sự còn nhận thấy rằng α-amylase của vi khuẩn có thể giữ được mộtphần hoạt lực thậm chí ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn Tính bền nhiệtcủa α-amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn Trong sản xuất, α-amylase của vi khuẩn được

sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng ở nhiệt độ cao Ở Tây Đức đã

tuyển chọn được một chủng Bac.subtilis mà α-amylase của nó không khác gì của vi khuẩn

thông thường về đặc tính tác dụng lên tinh bột, song lại có độ bền nhiệt khá cao (Sprister,Uhlig, 2000) Tính chất α-amylase của chủng bền nhiệt này cũng đặc trưng cho

Bac.suptilis; pH tối thích 6,0; bị vô hoạt hoàn toàn ở pH 4,0 và bị vô hoạt một nửa ở pH

8,0

- Những khác biệt về tính chất như nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân vàđặc tính thủy phân của α-amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng tolớn cho việc ứng dụng chúng một cách hợp lý và hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau củaquá trình sản xuất

Nồng độ cơ chất:

- Nồng độ cơ chất ảnh hường khá mạnh đến khối lượng và chất lượng của sản phẩmthủy phân do sự phân cắt của α-amylase Nhìn chung nếu nồng độ cơ chất khá loãng,lượng đường tạo ra theo cơ chất càng nhiều, đặc biệt là nhóm đường thấp phân tử có khảnăng lên men được Tuy nhiên, tương quan đó không phải là tỷ lệ thuận.

- Ngoài ra, gần đây, các nhà nghiên cứu đã tìm hiểu và thấy rằng thành phầnamylose , amylopectin và cấu trúc tinh bột cũng là những yếu tố ảnh hưởng khá mạnhđến tác dụng thủy phân của enzyme α-amylase Nguồn tinh bột khác nhau cùng ảnhhưởng đến quá trình thủy phân khác nhau

1.1.6 α-amylase từ vi khuẩn Bac.licheniformis [3, 10].

- Bacillus được xem là giống vi sinh vật quan trọng nhất để sản xuất α-amylase

trong công nghiệp Đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất α-amylase bền nhiệt từ các chủng

Bac.amyloliquefaciens và Bac.licheniformis.

- α-amylase bền nhiệt từ Bac.licheniformis được nghiên cứu tách trong hệ hai pha

PEG/dextran, sau đó cho chạy qua hệ sắc kí lọc gel và sắc kí trao đổi ion (Ivanova, 1993)

Sử dụng gradient pH là một phương pháp thường được sử dụng trong công nghiệp để tinhsạch enzyme Dobransky đã dùng phương pháp này để tinh sạch α-amylase từ các chủng

Bac.subtilis khác nhau Các pick thu được có độ tách tốt, lượng dung dịch enzyme ban

đầu có thể đạt tới 1000L, với nồng độ protein 3g/100mL tinh sạch α-amylase sản xuất bởichủng chuyển gen bằng phương pháp sắc kí miễn dịch cũng đang được quan tâm (Pandey,2000)

- Các tính chất của α-amylase ngoại bào dường như phản ánh điều kiện pH và nhiệt

độ của môi trường sống Bac.flavothermus phát triển trong môi trường pH 6,0 và nhiệt độ

65oC tổng hợp α-amylase có pHopt và to

opt tương ứng là 5,5 – 6,0 và 60oC Một số tính chất

của α-amylase ngoại bền nhiệt từ Bac.subtilis đã được nghiên cứu, khả năng bền nhiệt của

enzyme phụ thuộc vào hàm lượng Ca2+, enzyme bị vô hoạt mạnh bởi EDTA và N –bromosucinimide Một số tác giả đã nghiên cứu tính chất của α-amylase có nguồn gốc từ

chủng Bac.subtilis (57700 Da); chúng bị vô hoạt bởi các kim loại như Hg2+, Fe3+, Al3+ và

được kích hoạt bởi Mn2+, Co2+ đã thu nhận được amylse nội bào của Bac.subtilis SUH4 –

2 với tỷ lệ monomer/dimer tương ứng là 3/2 trong đệm phosphate pH 7,0 Enzyme nàyđược cho là có vai trò quan trọng trong quá trình đồng hóa cacbon ở cytoplasm Các dạng

α-amylase biến tính và sau khi khôi phục hoạt tính của Bac.subtilis cũng được nghiên cứu

nhờ sử dụng phát xạ huỳnh quang (Cho, 2000)

1.1.7 Ứng dụng của enzyme α-amylase [11].

- Ngày nay các amylase từ vi sinh vật đã thay thế acid trong công nghiệp thủy phântinh bột, đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia Các enzyme có độ tinh sạch cao vànhững tính chất phù hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược và công nghệ hóachất tinh khiết

- Nhờ thành tựu của công nghệ sinh học, ứng dụng của amylase đang mở rộng ranhiều lĩnh vực khác Một số amylase và lipase đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứusinh học Có nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụngamylase

- Hệ phân tích Ciba Corning Express dựa trên dung dịch thuốc thử chứa α-amylasecho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao, α-amylaseđược sử dụng trong phân tích cyclodextrin

1.2 Sơ lược về enzyme cố định

1.2.1 Giới thiệu.

1.2.1.1 Định nghĩa [12].

Enzyme cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:

- Nghĩa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ,

pha này có thể tách riêng với môi trường dung dịch phản ứng Pha enzyme không hòa tantrong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

- Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng

thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cảenzyme được cố định vào một chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống, chúng được cốđịnh trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sửdụng nhiều lần

- Enzyme không hòa tan hay enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan đượcgắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này mà enzyme

từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan

1.2.1.2 Đặc điểm của enzyme cố định [12].

Enzyme cố định có đặc điểm như sau:

- Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do cùngloại Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzyme cố định là do những nguyên nhânsau:

• Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sựkhác biệt với điện tích của enzyme thì khi gắn enzyme vào chất mang, cấu trúc khônggian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà

sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm

• Do enzyme bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho

sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất bị kém đi

- Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một

số sai khác nhất định:

• Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang

• Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng

•

- Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do nhờ có tác dụng chechở của chất mang

- Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzyme tự do cùng loại

- Enzyme cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzyme tự do

- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất mộtcách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do.

1.2.1.3 Ưu nhược điểm của enzyme cố định [12].

Ưu điểm:

- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài

- Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme, do đó

nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta khôngtốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm

- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzyme rakhỏi dung dịch cơ chất

- Enzyme cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzyme tựdo

- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục

Nhược điểm:

- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme

- Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cốđịnh

Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzyme cốđịnh mang lại Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng như ứngdụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp

1.2.2 Các phương pháp cố định enzyme [12].

Các phương pháp cố định enzyme được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý

Bảng 1.3: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [12].

Hoạt tính enzyme có thể bịgiảm do những biến đổi vềcấu trúc của enzyme trongquá trình cố định

Thao tác thực hiện đơn giản

Điều kiện tiến hành cố địnhenzyme ôn hòa nên không làmmất hoạt tính của enzyme trongquá trình cố định

Có khả năng tái sử dụng chấtmang

Do lực tương tác giữaenzyme và chất mang yếunên dễ xảy ra hiện tượngnhả hấp phụ trong quá trình

sử dụng enzyme cố định dokhuấy trộn hay do thay đổinhiệt độ, pH của môitrường

Phương pháp nhốt

enzyme

Thao tác đơn giản

Không đòi hỏi phải có cácnhóm tạo liên kết nên phù hợpvới nhiêu loại enzyme

Hiệu quả cố định enzyme cao

Có thể cố định đồng thời nhiềuenzyme

Chỉ thích hợp cho phản ứngvới cơ chất có khối lượngphân tử nhỏ

Phương pháp hóa học:

- Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

- Gắn các phân tử enzyme lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

cả các loại vật liệu cố định [13]

Vật liệu cố định enzyme và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệuhữu cơ [13], [14]

Vật liệu vô cơ:

- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn

mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzyme thường khó khăn hơn

- Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, các oxid kim loại như oxidnhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel…

Vật liệu hữu cơ:

- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2,-COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzyme nhưng độ bền với tác động của môitrường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấncông

- Một số chất hữu cơ thông dụng như: Polypeptide, dẫn xuất của sterol, polymer củaacid malic và của acid metacrylic, polysaccharide, nilon, dẫn xuất cellulose, dextran, tinhbột, agarose

- Cellulose và dẫn xuất của cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose,nitrocellulose… là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhưng lại không đồng nhất,thường chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline).

- Cellulose là vật liệu được nghiên cứu cố định enzyme đầu tiên, các quy trình cốđịnh trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn chỉnh Cellulose thường được dùng đểhấp thụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị với enzyme hoặc nhốt trong gel

- Chitin là hợp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin

từ năm 1823 Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứngdụng làm vật liệu cố định enzyme và tế bào Chitin là một polymer sinh học rất phổ biếntrong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose

- Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc deoxy-β-D-glucoza, liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside Chitin có trong thànhphần cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,…Chitin là một vậtliệu có chứa nhóm chức –OH và cho liên kết với enzyme, có cấu trúc siêu lỗ, có khả nănghấp thụ tốt, dễ tạo màng Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liênkết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể

2-acetoamide-2 Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ vàbền về mặt hóa học Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếubằng phương pháp hấp thụ và liên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde

- Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi Nó là chất hữu cơ chiếmlượng lớn để hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng,giáp xác…) [13]

- Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa họcduy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay thế chonhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose

- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh Chitosan

dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2 Chitosan có thể cố định enzymebằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzyme trong gelchitosan

- Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, aciddipic, acid acetic Chitosan là một polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao, có cácnhóm amin hoạt động, các nhóm hydroxyl có thể tham gia phản ứng hóa học.

1.3 Enzyme α-amylase cố định.

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài

- Lịch sử nghiên cứu cố định enzyme bắt đầu từ năm 1916, khi Nelson và Griffinquan sát khả năng thủy phân đường saccharose của invertase nấm men hấp phụ trên thanhoạt tính

- Sau đó đến năm 1949 Micheal và Iuers đã sử dụng phương pháp acid hóacarboxymethyl cellulose để cố định những chuỗi protein có hoạt tính

- Năm 1953 Grubhofer và Schleith cố định một vài enzyme như carboxypeptidase,pepsin, ribonuclease bằng liên kết cộng hóa trị trên nhựa polyaminostyren được diazohóa

- Chang (1954) đã tạo ra các vi tiểu cầu có gắn enzyme để chống dị ứng khi đưa vào

cơ thể

- Mizt (1956) đã cố định enzyme catalase lên DEAE-celllulose bằng liên kết ion.Beerfeld và Wan mô tả phương pháp nhốt các enzyme trypsin, papain, amylase vàribonuclease trong gel polyacrylamide vào năm 1963 Năm 1964 Quiocho và Richards đãchứng minh khả năng khâu mạch các enzyme carboxypeptidase A bằng glutaraldehyde.Cũng năm 1964, Chang đã tiến hành nhốt enzyme hydratase trong các vi hạt

- Enzyme cố định đầu tiên được ứng dụng ở quy mô công nghiệp vào năm 1969 doChibata và các cộng sự Enzyme aminoacylase được cố định trên DEAE-sephadex nhờliên kết ion để chuyển hóa hỗn hợp D, L-acid amin thành L-acid amin Mosbach (1970)

đã cố định tổ hợp cả 3 enzyme là β-galactosidase, hexokinase và gluco-6-phosphatdehydrogenase bằng liên kết cộng hóa trị với hạt sephadex Tế bào vi sinh vật đầu tiênđược ứng dụng ở qui mô công nghiệp được thực hiện bởi Chibata (1973), Chibata và các

cộng sự đã cố định E.coli trong gel polyacrylamide để sản xuất acid L-aspartic từ ammonium fumarat nhờ hoạt tính aspartase rất cao của E.coli [13].

- Hiện nay trong công nghiệp, enzyme cố định được sử dụng chủ yếu trong sản xuấtsyrup giàu fructose (HFS) và penicillin bán tổng hợp.

Ở Việt Nam, những nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu trong vài năm gần đây,kết quả thu được còn rất hạn chế Năm 1994 - 1995 Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP Hồ ChíMinh nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase trên các hạt silochrom B2 hoạt hóa bằngglutaraldehyde Hiện nay Viện cũng đang nghiên cứu sử dụng chế phẩm glucoisomerase

cố định của Novo để sản xuất syrup fructose, tuy nhiên chỉ mới ở qui mô phòng thínghiệm [14]

- Những năm gần đây, Phòng công nghệ bức xạ, viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã

có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme, tế bào và các chất có hoạt tính sinh học

khác bằng bức xạ như cố định glucoamylase, protease, vi khuẩn tả (Vibro cholerae), tế bào nấm men (Saccaromyces servisase), vi khuẩn xử lý nước thải trên polymer tổng hợp

được chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ

- Có một số công trình nghiên cứu về amylase cố định, tuy nhiên các nghiên cứukhông được ứng dụng trong công nghiệp Do amylase thường được cố định trong các chấtmang dạng xốp, tinh bột lại có kích thước lớn nên cơ chất và enzyme khó tiếp xúc vớinhau, quá trình truyền khối thấp và hiệu suất sử dụng enzyme cố định không cao Thiết bị

sử dụng trong công nghiệp thường là cột nhồi không phù hợp với dòng cơ chất liên tục làtinh bột dạng hạt, khối có kích thước lớn Trong các cột nhồi kiểu này dễ xảy ra hiệntượng tắc nghẽn dòng ở lối vào, cơ chất tụ tập thành từng đám làm tăng áp suất cột, phá

vỡ hình dạng hay gây nén các hạt xốp dẫn đến hiệu suất quá trình và chất lượng sản phẩmthấp [15]

- Các nghiên cứu về cố định amylase tập trung chủ yếu cố định glucoamylase và mộtvài nghiên cứu về cố định α-amylase Glucoamylase của hãng Novo cố định trên hạt silicxốp được sử dụng trong thiết bị cột nhồi và thiết bị tầng sôi để thủy phân tinh bột sắn saukhi đã dịch hóa Và thực hiện các nghiên cứu về mô hình hóa quá trình phản ứng, nhiệtđộng học phản ứng, nghiên cứu quá trình truyền khối trong và ngoài hạt cũng như cácnghiên cứu về độ bền nhiệt, năng lượng vô hoạt và thời gian bán hủy của enzyme cố định

và hòa tan Thiết bị tầng sôi có nhiều ưu điểm hơn thiết bị dạng cột nhồi, không có hiện

tượng hạn chế khuếch tán và hiệu suất thủy phân tinh bột dạng hạt 98,5% với thời gianlưu chỉ 10 phút Glucoamylase cũng được gắn trên bề mặt các hạt siêu mịn polystyrene,các chỉ số động học như Vmax, Km, khả năng chịu nhiệt, pH… của enzyme tốt hơn so vớienzyme tự do [8].

- Đã có một số công trình nghiên cứu cố định α-amylase trên polyacrylamide, canxialginate và sepharose

- Polyacrylamide có tính ưu việt, enzyme ít bị biến đổi trong gel nhưngdimethyaminopropionate chất khởi đầu cho quá trình trùng hợp rất độc, không thể sửdụng trong thực phẩm Canxi alginate có nhiều trong tự nhiên chủ yêu được chiết từ rongnâu gần như không mùi không vị, nhược điểm là quá trình truyền khối gặp trở ngại do cấutrúc tinh bột lớn khó đi vào cấu trúc gel

- α-amylase cũng được nghiên cứu cố định trên sepharose nhưng phương pháp này

có nhược điểm chất hoạt hóa CNBr độc tính cao và chế phẩm không thể sử dụng trongcác thiết bị có cánh khuấy [16]

- Chin Jen Tien, Been Huang Chiang (1999) đã cố định α-Amylase trên hạt keo làsản phẩm H2SO4 và ZrOCl2 sau khi được xử lí bởi 3-aminopropyltriethoxysilane (3-APTES) và glutaraldehyde 0,5% Chế phẩm thu được có hoạt tính 59,8 đv/g [8]

- Serpil Aksoy, Nesrin Hasirci (2000) cố định α-amylase trên 2-hydroxythelmetharylate (HEMA), và trên styrene-2-hydroxyethyl methacrylate (St-HEMA) các chếphẩm trên được hoạt hóa bởi epichlorohydrin (ECH) Enzyme cố định có hoạt tính 61,7 –67% so với enzyme tự do, sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 4oC hoạt tính còn 38,9% [15]

- Với những cố gắng tìm ra chất mới, Yang (1998) đã sử dụng chất mangperfluorpolymer phủ poly – vinyl - alcohol để cố định α-amylase Enzyme cố định khábền với nhiệt độ và các dung dịch gây biến tính mạnh, đặc biệt nó có độ bền cơ học cao,

có thể tái sử dụng trong thiết bị có cánh khuấy Enzyme cố định chỉ mất 20% hoạt tínhsau 3 tuần ở 72oC [17, 18]

- Chen (1998) tìm ra một loại màng gồm các hạt hydrogel được gắn trên nềnpolyester, rất nhạy với nhiệt độ, có khả năng đóng mở các lỗ xốp, tạo ra hiệu ứng có /không có hoạt tính enzyme tương ứng với nhiệt độ Enzyme cố định trên màng có độ bềnnhiệt cao, được sử dụng trong thiết bị liên tục có khả năng tăng hiệu suất thủy phân vàkhả năng tách sản phẩm khỏi cơ chất [15]

1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme α-amylase [8, 13, 22].

Theo Scouten Gerhartz có 4 phương pháp cố định enzyme:

- Phương pháp liên kết với vật liệu cố định

- Phương pháp khâu mạch

- Phương pháp nhốt trong khuôn gel

- Tổ hợp các phương pháp trên

1.3.2.1 Phương pháp liên kết với các vật liệu cố định:

Phương pháp liên kết cộng hóa trị:

Đây là phương pháp cố định enzyme phổ biến, đảm bảo liên kết vững chắc củaenzyme và cơ chất

- Vật liệu cố định không tái sử dụng được

Tóm lại, phương pháp này chỉ phù hợp cho những enzyme mắc tiền và ổn định hoạttính khi cố định, thường ứng dụng với mục đích phân tích

Hoạt hóa bằng cyanogen bromit

Dùng cho các vật liệu có nhóm – OH như polysaccharide, chất hoạt hóa CNBr vàcác sản phẩm trung gian tạo thành rất độc, nên cần có thiết bị bảo vệ trong khi tiến hànhthí nghiệm

Phương pháp hoạt hóa acid:

- Với các vật liệu cố định có nhóm chức – COOH như carboxymetyl, cellulose…Giáthể được chuyển hóa thành dẫn xuất metyl ester, sau đó thành hydrade khi phản ứng vớihidrazin và cuối cùng là acid

- Acid sẽ phản ứng với enzyme ở nhiệt độ thấp 0 – 5oC; pH 7,8

Hoạt hóa bằng diazo:

- Đối với những vật liệu cố định có nhóm amin vòng thơm như polyaminostyren,aminobenzyl cellulose có thể hoạt hóa theo phương pháp này Phản ứng liên kết vớienzyme xảy ra ở nhiệt độ thường, môi trường trung tính

- Phản ứng alkyl hóa: Nhóm halogen trên vật liệu dễ phản ứng với nhóm amino,nhóm sunfuahydride của enzyme Những chất mang halogen acetyl cellulose, cellulose cóthể hoạt hóa theo phương pháp này

Hoạt hóa bằng glutaraldehyde:

Các nhóm vật liệu có nhóm amin như polyacrylamide, aminoetyl, cellulose, chitin,chitosan có thể sử dụng phương pháp này

R-NH2 + HOC-(CH2)-COH  R-N=CH(CH2)CHO

R-N=CH(CH2)CHO + H2N-E  R-N=CH(CH2)CH=N-E

Hoạt hóa bằng carbodiimide:

Những vật liệu cố định có nhóm carboxyl có thể hoạt hóa bằng các dẫn xuấtcarbodiimide đặc biệt là N,N dicyclohexylcarbodiimide Khi có mặt chất này enzyme dễdàng liên kết cộng hóa trị với vật liệu cố định, phản ứng ở môi trường acid yếu

1.3.2.2 Phương pháp liên kết ion:

Phương pháp này có nhiều ưu điểm ở qui mô công nghiệp vì có các ưu điểm sau:

Ưu điểm:

- Cố định enzyme bằng liên kết ion là phương pháp đơn giản, vật liệu có thể tái sửdụng lại.

- Enzyme không bị biến đổi hóa học nên hoạt tính enzyme cố định cao

- Vật liệu cố định mang điện tích làm tăng nồng độ của cơ chất, do đó làm tăng khảnăng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme và làm tăng hoạt tính enzyme cố định

- Enzyme không chịu bất kì một sự thay đổi nào về mặt hóa học nên hoạt tính củaenzyme cố định thường từ 50 – 100% so với enzyme tự do

- Khả năng hấp phụ của enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường, như nhiệt

độ, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của vật liệu cố định

1.3.2.4 Phương pháp khâu mạch [21,23]:

OHC(CH2)3CHO + (NH2)n – E  -CH=N-E-N=CH(CH2)3

1.3.2.5 Phương pháp nhốt [20,24,25]:

Ưu điểm:

- Phương pháp này khá đơn giản, không chỉ cố định một loại enzyme mà có thể cốđịnh nhiều enzyme.

Nhược điểm:

- Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nên hoạt tính giữa enzyme cốđịnh thường thấp, nhất là trong trường hợp cơ chất có khối lượng phân tử lớn

- Vật liệu cố định không sử dụng lại

- Nhốt trong cấu trúc mạng gel

- Enzyme nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer như polysacharide, protein,polymer tổng hợp như polyacrylamide…Enzyme hoặc tế bào sẽ được tạo hỗn hợp vớidung dịch monomer và các chất khâu mạch khác, sau đó sẽ được polymer hóa bởi các tácnhân hóa học, hoặc bức xạ

- Trong trường hợp polymer hóa bằng bức xạ gamma, enzyme và monomer đượchoạt hóa bằng cách làm lạnh ở nhiệt độ -78oC, sau đó hỗn hợp được chiếu xạ Kỹ thuậtnày dễ tạo ra cấu trúc siêu lỗ trên giá thể polymer và hạn chế enzyme mất hoạt tính bởibức xạ

- Các polymer thường được dùng trong phương pháp này là gel alginate,carrageenan và chitosan Alginate và carrageenan là các polyanion dễ tạo hạt trong dungdịch muối Ca, K Nhược điểm các gel này không bền trong môi trường phosphate Đểkhắc phục một phần nhược điểm này có thể cho gel khâu mạch trong glutaraldehyde

Dạng vi nang:

- Enzyme được nhốt trong màng bán thấm, nhưng lại thấm đối với cơ chất Vìenzyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enyzme và cơ

chất lớn hơn, do đó hoạt tính enzyme cao hơn trong trường hợp nhốt trong cấu trúc củagel polymer Catalase đã được nhốt bằng phương pháp này [22][50].

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme.

Ảnh hưởng của chất mang [13, 26, 27]:

- Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích,tính háo nước và kỵ nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến thể tích enzyme được liênkết, đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzyme không tan

- Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuấtenzyme và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phảnứng

- Sự định vị enzyme giúp cho dẫn xuất enzyme không tan có tính bền nhiệt cao hơnenzyme tan

- Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi, làmđứt nối liên kết hydro và liên kết kỵ nước

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

CỐ ĐỊNH2.1 Nguyên liệu.

- Chất tạo liên kết: Glutaraldehyde

- Mục đích của việc sử dụng chất tạo liên kết trong cố dịnh enzyme α-amylase là đểhình thành nên các cầu nối giữa phân tử enzyme và chất mang nhờ các liên kết cộng hóatrị

- Glutaraldehyde có 2 nhóm chức aldehyde ở 2 đầu Hai nhóm này sẽ tạo liên kếtvới nhóm amin của chất mang và của enzyme, từ đó giữ enzyme cố định trên chất mang.Một số tính chất hóa lý của glutaraldehyde được trình bày cụ thể trong bảng sau:

Bảng 2.1: Một số tính chất hóa lý của glutaraldehyde.

- Tinh bột: Tinh bột dùng trong nghiên cứu là tinh bột dược phẩm, màu trắng ngà

- Các hóa chất khác: Albumin, đường glucose chuẩn, CuSO4, NaOH, NaH2PO4,

Na2HPO4, muối tatrat…

2.1.5 Thiết bị sử dụng.

- Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic

- Máy khuấy từ Magnetic Stirrer HANNA, BIBBY

- Máy đo pH Mettler Toledo

- Bể điều nhiệt Gallenkamp No.WF250

- Cân 4 số lẻ OHAUS PA214

- Cân 2 số lẻ OHAUS Gold Series

- Tủ sấy, tủ lạnh…

Ảnh hưởng của pH.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tính chất động họcHiệu quả tái sử dụng

Thể tích enzymeThời gian cố địnhVận tốc máy lắcKích thước chitosanNồng độ glutaradehyde

CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH α-AMYLASE

CHỌN ĐIỀU KIỆN CỐ ĐỊNH α-AMYLASE

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CỐ ĐỊNH α-AMYLASE

GHIÊN CỨU ENZYME CỐ ĐỊNH

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT α-AMYLASE CỐ ĐỊNH

Phương pháp liên kết cộng hóa trị hay phương pháp hấp phụ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1:Sơ đồ nghiên cứu cố định enzyme α-amylase.

2.2.2 Phương pháp cố định enzyme α-amylase.

Chúng tôi sẽ tiến hành cố định enzyme α-amylase theo 2 phương pháp:

- Cố định α-amylase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị

- Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết giữa các enzyme

2.2.2.1 Cố định α-amylase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị.

- Hoạt hóa chitosan:

• Lấy 1g chitosan, cho vào 10ml glutaraldehyde 2%

• Lắc trong thời gian 2 giờ, tốc độ lắc 100 vòng / phút

- Tiến hành rửa chitosan 3 lần với nước cất

- Lấy 0,5ml enzyme α-amylase định mức thành 25ml

- Cho dung dịch enzyme vào chitosan sau khi rửa, lắc trong 2 giờ, tốc độ lắc 100vòng / phút.

- Tiến hành rửa chitosan để loại các enzyme không liên kết, định mức dung dịch saukhi rửa thành 50ml

- Xác định hàm lượng protein không liên kết Từ đó tính ra hiệu suất cố định

- Tiến hành xác định hoạt tính còn lại của enzyme cố định

2.2.2.2 Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết giữa các enzyme.

- Lấy 0,5ml enzyme α-amylase định mức thành 25ml

- Cho dung dịch enzyme vào chitosan, lắc trong 2 giờ, tốc độ lắc 100 vòng / phút

- Tiến hành rửa chitosan để loại các enzyme không liên kết, định mức dung dịch saukhi rửa thành 50ml

- Xác định hàm lượng protein không liên kết

- Cho vào 10ml glutaraldehyde 2%, lắc trong thời gian 2 giờ, tốc độ lắc 100vòng/phút

- Tiến hành rửa chitosan để loại các enzyme không liên kết, định mức dung dịch saukhi rửa thành 50ml

- Xác định hàm lượng protein không liên kết và hiệu suất cố định

- Xác định hoạt tính của enzyme cố định

2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme amylase

α-Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định gồmcó: thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc, kích thước chitosan và nồng độglutaraldehyde

Để khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố, ban đầu chúng tôi cho 5 yếu tố các giá trịsau:

- Thể tích enzyme: 0,5ml

- Thời gian cố định: 2 giờ

- Vận tốc lắc đảo: 100 vòng/phút

- Kích thước chitosan: 2,8mm

- Nồng độ glutaraldehyde 2%

Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một yếu tố, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó,còn những yếu tố còn lại sẽ được cố định Sau đó, khi khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tiếptheo, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, đồng thời lấy giá trị tối ưu của yếu tố vừa khảo sát

và giữ cố định những yếu tố còn lại

2.2.3.1 Khảo sát thể tích enzyme sử dụng.

- Thể tích enzyme thay đổi như sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml

- Giá trị các yếu tố khác được giữ cố định

2.2.3.2 Khảo sát thời gian cố định enzyme.

- Lần lượt thay đổi thời gian cố định: 1, 2, 3, 4, 5 giờ

- Thể tích enzyme lấy từ thí nghiệm trước Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ

cố định

2.2.3.3 Khảo sát vận tốc lắc đảo.

- Lần lượt thay đổi vận tốc lắc: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút

- Thể tích enzyme và thời gian lấy từ thí nghiệm trước Giá trị của các yếu tố khácvẫn được giữ cố định

2.2.3.4 Khảo sát kích thước của chitosan

- Lần lượt thay đổi kích thước chitosan như sau: 0,35; 0,7; 1,4; 2,8 mm Giá trị cácyếu tố khác giữ cố định

- Giữ cố định yếu tố về glutaraldehyde Các yếu tố còn lại là những giá trị tối ưu củacác thí nghiệm trước

2.2.3.5 Khảo sát nồng độ glutaraldehyde

- Nồng độ glutaraldehyde thay đổi như sau: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%