CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1:Sơ đồ nghiên cứu cố định enzyme α-amylase.
2.2.2 Phương pháp cố định enzyme α-amylase.
Chúng tôi sẽ tiến hành cố định enzyme α-amylase theo 2 phương pháp: - Cố định α-amylase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị.
- Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết giữa các enzyme. 2.2.2.1 Cố định α-amylase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị.
- Hoạt hóa chitosan:
• Lấy 1g chitosan, cho vào 10ml glutaraldehyde 2%.
• Lắc trong thời gian 2 giờ, tốc độ lắc 100 vòng / phút. - Tiến hành rửa chitosan 3 lần với nước cất.
- Cho dung dịch enzyme vào chitosan sau khi rửa, lắc trong 2 giờ, tốc độ lắc 100 vòng / phút.
- Tiến hành rửa chitosan để loại các enzyme không liên kết, định mức dung dịch sau khi rửa thành 50ml.
- Xác định hàm lượng protein không liên kết. Từ đó tính ra hiệu suất cố định. - Tiến hành xác định hoạt tính còn lại của enzyme cố định.
2.2.2.2 Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết giữa các enzyme.
- Lấy 0,5ml enzyme α-amylase định mức thành 25ml.
- Cho dung dịch enzyme vào chitosan, lắc trong 2 giờ, tốc độ lắc 100 vòng / phút. - Tiến hành rửa chitosan để loại các enzyme không liên kết, định mức dung dịch sau khi rửa thành 50ml.
- Xác định hàm lượng protein không liên kết.
- Cho vào 10ml glutaraldehyde 2%, lắc trong thời gian 2 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút.
- Tiến hành rửa chitosan để loại các enzyme không liên kết, định mức dung dịch sau khi rửa thành 50ml.
- Xác định hàm lượng protein không liên kết và hiệu suất cố định. - Xác định hoạt tính của enzyme cố định.
2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme α- amylase.
Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định gồm có: thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc, kích thước chitosan và nồng độ glutaraldehyde.
Để khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố, ban đầu chúng tôi cho 5 yếu tố các giá trị sau:
- Thể tích enzyme: 0,5ml. - Thời gian cố định: 2 giờ.
- Vận tốc lắc đảo: 100 vòng/phút. - Kích thước chitosan: 2,8mm.
- Nồng độ glutaraldehyde 2%
Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một yếu tố, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, còn những yếu tố còn lại sẽ được cố định. Sau đó, khi khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tiếp theo, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, đồng thời lấy giá trị tối ưu của yếu tố vừa khảo sát và giữ cố định những yếu tố còn lại.
2.2.3.1 Khảo sát thể tích enzyme sử dụng.
- Thể tích enzyme thay đổi như sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml. - Giá trị các yếu tố khác được giữ cố định.
2.2.3.2 Khảo sát thời gian cố định enzyme.
- Lần lượt thay đổi thời gian cố định: 1, 2, 3, 4, 5 giờ.
- Thể tích enzyme lấy từ thí nghiệm trước. Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định.
2.2.3.3 Khảo sát vận tốc lắc đảo.
- Lần lượt thay đổi vận tốc lắc: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút.
- Thể tích enzyme và thời gian lấy từ thí nghiệm trước. Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định.
2.2.3.4 Khảo sát kích thước của chitosan
- Lần lượt thay đổi kích thước chitosan như sau: 0,35; 0,7; 1,4; 2,8 mm. Giá trị các yếu tố khác giữ cố định.
- Giữ cố định yếu tố về glutaraldehyde. Các yếu tố còn lại là những giá trị tối ưu của các thí nghiệm trước.
2.2.3.5 Khảo sát nồng độ glutaraldehyde
- Thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc đảo và kích thước chitosan là những giá trị tối ưu của những thí nghiệm trước.
2.2.4 Xác định hiệu xuất cố định enzyme α-amylase.
- Hiệu suất của quá trình cố định được tính theo công thức sau:
Với: m: là hàm lượng protein enzyme có trong thể tích enzyme ban đầu (mg)
m1: là hàm lượng protein enzyme không liên kết (mg).
2.2.5 Xác định hoạt tính riêng α-amylase
- Công thức tính:
Với: Ur: là hoạt tính riêng của α-amylase (đơn vị hoạt độ /mg protein trong chế phẩm tự do hay cố định)
G: lượng đường khử tạo thành do phản ứng thủy phân (mg). m2: lượng protein α-amylase đã dùng để thủy phân (mg).
Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme cố định:
Với: Urcđ là hoạt tính riêng của α-amylase cố định (đơn vị hoạt độ/mg protein α- amylase cố định ).
Urht là hoạt tính riêng của α-amylase tự do (đơn vị hoạt độ/mg chế phẩm α- amylase).
2.2.6 Khảo sát tính chất của enzyme α-amylase cố định.
- pH có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme cố định. Vì vậy, trong thí nghiệm này, mục đích chúng tôi là khảo sát ảnh hưởng của pH và tìm ra pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định.
- Chúng tôi tiến hành thí nghiệm như sau: cố định các yếu tố như nồng độ enzyme cố định, nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ cơ chất. Thay đổi pH của dung dịch tinh bột trong khoảng pH từ 5.5 – 8 rồi xác định hoạt tính của enzyme cố định và enzyme tự do ứng với mỗi pH khác nhau và suy ra pH tối thích.
2.2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme α-amylase.
- Từ giá trị pH tối ưu ở thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cố định. Chúng tôi cũng song song khảo sát enzyme cố định và enzyme tự do để có sự so sánh.
- Chúng tôi cố định các yếu tố như nồng độ enzyme, thời gian phản ứng….cho nhiệt độ dung dịch thay đổi từ 60 – 90oC và xác định hoạt tính của enzyme α-amylase cố định và tự do với mỗi nhiệt độ đó.
2.2.6.3 Khảo sát tính chất động học của enzyme α-amylase cố định trên màng chitosan.
- Trong nghiên cứu này, chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme α-amylase cố định. Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, chúng tôi cố định các yếu tố như: nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng… và thay đổi nồng độ cơ chất từ 50 – 250 g/l rồi so sánh hoạt tính của α-amylase ở những nồng độ đó.
- Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi tiến hành tính toán xác định giá trị các thông số động học của phản ứng enzyme là Km và Vmax. Tiến hành tương tự với enzyme α- amylase tự do để kiểm chứng.
- Xác định hoạt tính của enzyme tự do và cố định ứng với từng nồng độ khác nhau. Vẽ đồ thị Michaelis Menten ( tốc độ thủy phân v theo nồng độ cơ chất [S]), đồ thị
Lineweaver – Burk ( 1/v theo 1/[S]) để xác định Vmax, Km và nồng độ cơ chất [S] mà tại đó hoạt tính enzyme α-amylase là cao nhất.
2.2.6.4 Khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme α-amylase cố định.
Thí nghiệm khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme α-amylase cố định được tiến hành như sau: enzyme cố định được sử dụng lặp đi lặp lại 10 lần để thủy phân tính bột với thành phần không thay đổi như sau:
- 25ml dung dịch tinh bột 1%. - 1g chế phẩm α-amylase cố định. - Nhiệt độ thủy phân 75oC.
- pH = 7.
- Thời gian thủy phân 10 phút.
2.2.7 Các phương pháp phân tích.