Giáo án sinh học lớp 9 học kì 1 chuẩn KTKN 2014

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I ð NGHIÊN C U M T S Y UT TU N LONG ð C TÍNH SINH V T HĨA H C, ð C L C VÀ TÍNH M N C M KHÁNG SINH C A VI KHU N ESCHERICHIA COLI GÂY B NH SƯNG PHÙ ð U (EDEMA DISEASE) TRÊN L N CON T I M T S MI N B C VI T NAM LU N VĂN TH C SĨ HÀ N I - 2013 T NH B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I ð NGHIÊN C U M T S Y UT TU N LONG ð C TÍNH SINH V T HĨA H C, ð C L C VÀ TÍNH M N C M KHÁNG SINH C A VI KHU N ESCHERICHIA COLI GÂY B NH SƯNG PHÙ ð U (EDEMA DISEASE) TRÊN L N CON T I M T S MI N B C VI T NAM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà NGÀNH : 60.64.01.01 NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C : PGS.TS TÔ LONG THÀNH PGS.TS PH M NG C TH CH HÀ N I - 2013 T NH L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan r ng, cơng trình nghiên c u c a riêng tôi, s li u k t qu nghiên c u lu n văn trung th c chưa t ng ñư c s d ng ñ b o v m t h c v Tôi xin cam ñoan, m i s giúp ñ cho vi c th c hi n lu n văn ñã ñư c c m ơn thơng tin trích d n lu n văn ñã ñư c ch rõ ngu n g c Hà N i, tháng 11 năm 2013 Tác gi lu n văn ð Tu n Long Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii L I CÀM ƠN ð hoàn thành Lu n văn này, s c g ng c a b n thân, nh n ñư c s quan tâm giúp ñ c a th y cô giáo b n bè ñ ng nghi p Nhân d p này, trư c tiên xin chân thành c m ơn s giúp ñ c a th y cô giáo khoa Thú y, Ban ñào t o sau ñ i h c trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i gi ng d y tơi su t th i gian h c t p t i Trư ng Tơi xin bày t lịng bi t ơn sâu s c t i th y cô hư ng d n: PGS.TS Ph m Ng c Th ch, PGS.TS Tô Long Thành, TS Nguy n Th Kim Oanh Các th y t n tình giúp đ , hư ng d n tơi q trình th c hi n hoàn thành lu n văn Xin chân thành c m ơn s giúp đ q báu c a Ban lãnh đ o, cán b cơng nhân viên Trung tâm Ch n đốn Thú y Trung ương ñã dành nhi u th i gian công s c giúp đ tơi q trình thưc hi n ñ tài Tôi xin g i l i c m ơn t i ngư i thân gia đình b n bè đ ng nghi p ln giúp đ , đ ng viên giúp tơi hồn thành lu n văn Hà N i tháng 11 năm 2013 Tác gi lu n văn ð Tu n Long Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iii M CL C L i cam ñoan ii L i càm ơn iii M cl c iv Danh m c nh ng ch vi t t t vii Danh m c b ng viii Danh m c hình ix M ð U CHƯƠNG T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Tình hình nghiên c u v vi khu n E.coli b nh chúng gây 1.1.1 Tình hình nghiên c u b nh vi khu n E.coli th gi i 1.1.2 Tình hình nghiên c u b nh vi khu n E.coli 1.2 ð c tính sinh h c c a vi khu n E.coli 1.2.1 ð c m hình thái 1.2.2 ð c tính ni c y 1.2.3 ð c tính sinh hóa 1.2.4 S c đ kháng 1.2.5 C u trúc kháng nguyên 1.2.6 Các y u t gây b nh c a vi khu n E.coli 10 1.2.7 Kh gây b nh 14 1.2.8 Tính kháng kháng sinh c a vi khu n E.coli 15 1.3 B nh phù ñ u 16 1.3.1 M m b nh 16 1.3.2 D ch t h c 17 1.3.3 Phương th c truy n lây c a b nh 17 1.3.4 Cơ ch gây b nh 18 Vi t Nam l n vi khu n E.coli gây Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv 1.3.5 Tri u ch ng 19 1.3.6 B nh tích 20 1.3.7 Ch n đốn 22 1.3.8 Các lo i vacxin phịng b nh phù đ u 22 CHƯƠNG ð I TƯ NG, N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 23 2.1 ð i tư ng nghiên c u 23 2.2 ð a ñi m nghiên c u 23 2.3 N i dung nghiên c u 23 2.3.1 Xác ñ nh t l phân l p vi khu n E.coli gây b nh phù đ u 2.3.2 Xác đ nh đ c tính sinh h c c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 23 2.3.3 Xác ñ nh y u t ñ c l c c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 23 2.3.4 Xác ñ nh serotype c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 23 2.3.5 Xác ñ nh kh m n c m v i kháng sinh c a vi khu n E.coli l n 23 phân l p ñư c 23 2.4 Nguyên li u 23 2.4.1 M u b nh ph m l n 23 2.4.2 Môi trư ng, nguyên li u phân l p vi khu n, xác ñ nh serotype c a vi khu n 24 2.4.3 Hóa ch t, dung d ch, c p m i dùng ph n ng PCR 24 2.4.4 Môi trư ng, nguyên li u làm kháng sinh ñ 24 2.4.5 D ng c , máy móc 25 2.5 Phương pháp nghiên c u 25 2.5.1 Phương pháp l y m u 25 2.5.2 Phương pháp phân l p, xác ñ nh vi khu n E.coli t m u b nh ph m 25 2.5.3 Phương pháp giám ñ nh ñ c tính sinh h c c a vi khu n E.coli 25 2.5.4 Xác ñ nh ñ c t VT2e kháng nguyên F18 b ng phương pháp PCR 30 2.5.5 Phương pháp x lý s li u 31 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v CHƯƠNG K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 32 3.1 K t qu thu th p m u phân l p vi khu n E.coli 32 3.2 K t qu xác ñ nh ñ c tính sinh h c c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 36 3.3 K t qu xác ñ nh y u t ñ c l c c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 38 3.3.1 Kh dung huy t 38 3.3.2 ð c t Verotoxin Vt2e y u t bám dính F18 39 3.4 K t qu xác đ nh serotype c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 43 3.5 Xác ñ nh kh m n c m v i kháng sinh c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 46 K T LU N VÀ ð NGH 53 K T LU N 53 ð NGH 53 TÀI LI U THAM KH O 54 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C NH NG CH VI T T T E coli : Escherichia coli ED : Edema disease F18 : Fimbriae 18 KN : Kháng nguyên KT : Kháng th PCR : Polymerase Chain Reaction Stx2e : Shiga toxin 2e Stx+E coli : Ch ng vi khu n E coli có kh s n sinh đ c t Shiga toxin VT2e : Verotoxin 2e VT2e+E coli : Ch ng vi khu n E coli có kh s n sinh ñ c t Verotoxin 2e Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vii DANH M C B NG STT 2.1 Tên b ng Trang Trình t nucleotide c a c p m i xác ñ nh y u t ñ c l c c a vi 24 khu n E coli 2.2 ðánh giá k t qu đư ng kính vịng vơ khu n theo tiêu chu n c a H i ñ ng Qu c gia Hoa Kỳ 29 2.3 Chu trình c a ph n ng PCR 31 3.1 K t qu thu th p m u t l phân l p vi khu n E Coli ñ a phương 32 3.2 T l phân l p vi khu n E coli theo tu i l n 34 3.3 K t qu giám ñ nh sinh hóa c a vi khu n E coli phân l p ñư c 36 3.4 K t qu xác ñ nh y u t ñ c l c c a vi khu n E coli 40 3.5 K t qu xác ñ nh serotype c a vi khu n E coli phân l p ñư c 43 3.6 T l serotype c a vi khu n E coli phân l p ñư c 44 3.7 K t qu kháng sinh ñ c a ch ng E coli phân l p ñư c 47 3.8 K t qu xác ñ nh tính kháng kháng sinh c a vi khu n E.coli phân l p ñư c theo ñ a phương 3.9 49 K t qu xác đ nh tính kháng kháng sinh c a vi khu n E coli phân l p ñư c l n theo l a tu i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 51 viii DANH M C HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cơ ch gây b nh sưng phù ñ u c a vi khu n E.coli 18 1.2 L n m t thăng b ng 19 1.3 Phù ru t h ch màng treo ru t 20 1.4 Phù tích nư c dư i da vùng ñ u 20 1.5 L n phù đ u, phù mí m t, có tri u ch ng th n kinh 21 1.6 Phù tích nư c 21 1.7 Niêm m c ru t xu t huy t (bên trái) bình thư ng(bên ph i) 21 1.8 Niêm m c d dày xu t huy t (bên trái) bình thư ng (bên ph i) 21 2.1 Sơ đ ch n đốn thư ng quy b nh phù vi khu n E.coli 26 3.1 T l phân l p E.coli 35 3.2 B sinh hóa cho vi khu n E.coli 3.3 Khu n l c c a vi khu n E.coli th ch MacConkey (trái), th ch vùng m t, mí m t l n theo l a tu i 37 máu (ph i) 38 3.4 S n ph m ph n ng PCR xác ñ nh gene VT2e F18 41 3.5 So sánh t l serotype c a vi khu n E.coli phân l p ñư c 45 3.6 So sánh t l m n c m kháng kháng sinh c a ch ng vi khu n E.coli phân l p ñư c Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 48 ix ch ng vi khu n E coli gây b nh phù ñ u SLT II gây b nh l n v i ch ng sinh SLT I ngư i k t lu n r ng y u t ñ c l c m t bi n ch ng c a SLT II nên sau đư c ký hi u SLT-IIe S phát hi n c a nhóm nghiên c u khác v lo i ñ c t t bào ñã ñưa nhi u thu t ng tương ñ ng Thu t ng ñ c t Vero (VTs) hay ñ c t gi ng Shiga (SLTs) ñư c s d ng nhi u năm b i nhà nghiên c u Canada Anh, nhóm nghiên c u M l i hay dùng thu t ng vi khu n E coli gây ñ c t Vero (VTEC) hay vi khu n E coli s n sinh ñ c t gi ng Shiga, m c dù chúng nh ng t ñ ch m t khái ni m G n ñây, Caldewood c ng s (1996) ñã ñ ngh s d ng tên ñ c t Shiga (Shiga toxin - Stx) cho t t c nh ng ñ c t t bào Stx s n sinh b i E coli bao g m nhóm: Stx1 nhóm ñ c t gi ng Stx c a vi khu n gây b nh l , Stx2 nhóm đ c t có liên h v i Stx Lo i Stx1 ñư c s n sinh t ch ng E coli H19, H30, lo i ñ c t khác nhóm Stx1 ch khác m t axit amin khơng gây khác bi t tính ñ c t hay tính kháng nguyên ð c t Stx2e (Shiga toxin 2e) hay VT2e l n m t lo i nhóm đ c t Stx2 v i m t s khác bi t ñ c tính sinh h c Stx1 Stx2 gây đ c cho t bào Hela Stx2e ñ c so v i lo i ñ c t Stx2 khác Stx2e ñ c cho t bào Vero t 10-100 l n so v i t bào Hela Các quan sát có liên quan t i lư ng receptor chuyên bi t có m t lo i t bào (Blanco, 1983) Stx2e đóng vai trị quan tr ng nguyên nhân gây b nh s xu t hi n tri u ch ng c a b nh phù ñ u Sau t ñám phát tri n ru t, vi khu n E coli sinh ñ c t Shiga (STEC) s n sinh Stx2e, ñ c t ñi qua t bào bi u mơ ru t vào máu T Stx2e g n k t v i receptor có m t bào màng c a ñ ng m ch, ti u ñ ng m ch t mô quan khác gây t n thương vi th ðó s c a nh ng t n thương ñ i th tri u ch ng lâm sàng Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 13 Tri u ch ng có th th y tiêm tĩnh m ch ñ c t Stx2e tinh l c (Macleod c ng s , 1991) 1.2.7 Kh gây b nh Căn c vào y u t gây b nh, vi khu n E coli đư c chia làm nhóm (Trích theo Võ Thành Thìn, 2012) - Enteropathogenic E coli (EPEC): mang y u t bám dính có kh xâm nhi m vào ru t non, phá h y l p t bào bi u mô ru t; gây tri u ch ng s t, tiêu ch y Vi khu n nhóm gây b nh ngư i, th , chó, mèo, l n ng a - Enterotoxigenic E coli (ETEC): Vi khu n nhóm thư ng có kh mang m t s kháng nguyên bám dính (kháng ngun pili sinh đ c t ñư ng tiêu hóa LT (heat labile enterotoxin) ST (heat stable enterotoxin) Vi khu n nhóm thư ng gây b nh tiêu ch y ngư i, l n, c u, gà, bị, chó ng a - Enteroinvasive E coli (EIEC): Vi khu n xâm nhi m vào bi u mô t bào ru t k t, làm dung gi i th th c bào (phagosome) Vi khu n nhóm ch y u phân l p ñư c ngư i - Enterohaemorhagic E coli (EHEC): Vi khu n nhóm thư ng s n sinh y u t xâm nhi m, ñ c t Shiga (Stx) Quá trình xâm nhi m gây b nh thư ng gây nên nh ng b nh lý t bào r t n ng Vi khu n thư ng phân l p ñư c t ngư i ñ ng v t nhai l i D a kh sinh ñ c t Shiga c a vi khu n thu c nhóm EHEC, m t s tác gi x p vi khu n vào nhóm khác Shiga-toxin producing E coli (STEC) hay cịn có tên khác Verotoxigenic E coli (VTEC) - Enteroaggregative E coli (EAEC): Vi khu n bám lên thành ru t non ru t già, s n sinh ñ c t t bào đ c t đư ng tiêu hóa (EAST1) Vi khu n nhóm ch có th tìm th y ngư i có th l n, bị - Diffusely adherent E coli (DAEC): có th tìm th y ru t non, ñ c bi t tr em t 12 tháng tu i tr lên Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nơng nghi p ……………………… 14 1.2.8 Tính kháng kháng sinh c a vi khu n E coli Hi n nay, vi c s d ng kháng sinh thú y chưa ñư c qu n lý ch t ch , ngư i chăn nuôi s d ng kháng sinh sai nguyên t c, h u h t s d ng kháng sinh t ng h p ñ ñi u tr b nh mà khơng xác đ nh xác ngun nhân gây b nh, dùng kháng sinh đ phịng b nh, tr n kháng sinh vào th c ăn đ phịng b nh kích thích tăng trư ng… Do đó, hi n tư ng kháng thu c c a vi khu n ngày gia tăng n cho vi c ñi u tr b nh vi khu n gây g p r t nhi u khó khăn Nhi u lo i kháng sinh b kháng hồn tồn d n đ n ngu n kháng sinh s d ng ñư c b thu h p Trong đó, vi khu n E coli cho đ n có kh kháng nhi u lo i kháng sinh vi c nghiên c u tính m n c m kháng sinh c a E coli ñang ñư c nhà khoa h c quan tâm nh m ñưa ñư c phác ñ ñi u tr hi u qu nh t Y u t quy ñ nh kh kháng kháng sinh c a vi khu n E coli n m plasmid Các plasmid có t bào vi khu n E coli nói riêng vi khu n thu c h vi khu n đư ng ru t nói chung có kh t n t i, nhân lên chuy n giao gi a ch ng vi khu n Vì v y, có vai trị h t s c quan tr ng vi c gieo r c tính kháng thu c S d ng m t lo i thu c hóa h c tr li u u tr vi khu n E coli m t th i gian dài vi khu n s có kh kháng khơng ch thu c mà c thu c khác n a Các gen quy ñ nh tính kháng thu c thư ng là: gen blaCMY2 kháng v i kháng sinh nhóm Cephalosporin, gen dfA17 kháng v i Trimethoprim, gen aadA5 kháng v i Spectinomycin Ngoài ra, vi khu n E coli cịn có kh truy n kháng theo chi u ngang cho nhi u lo i vi khu n khác như: Salmonella sp, Klebsiella pneumonia, Proteus Carl M Schroeder et al (2002) ñã nghiên c u tính kháng thu c c a 752 ch ng E coli ñư c phân l p ngư i ñ ng v t cho bi t: V i ch ng phân lâp t gia súc gia c m có 71% ch ng kháng v i Streptomycin, 63% ch ng kháng v i Tetracyclin, 20% kháng v i Gentamycin, 16% kháng v i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 15 SXT Ampicillin Các ch ng phân l p t l n mèo cho th y t l kháng thu c cao có 82% ch ng kháng v i Sulfamethoxazole/Trimethoprme, 76% ch ng kháng v i Streptomycin, 67% kháng v i Tetracyclin Năm 2002, nghiên c u tính kháng kháng sinh c a 106 ch ng E coli phân l p t l n theo m mi n B c Vi t Nam, ð Ng c Thúy cs ñã thu ñư c k t qu : Các ch ng E coli có xu hư ng kháng m nh v i lo i kháng sinh thơng thư ng v n dùng đ ñi u tr b nh như: Amoxicillin (76,42%), Chloramphenicol (79,25%), Streptomycin (88,68%), Tetracyclin (97,17%), Trimethoprim/Sulfamethoxazol (80,19%) Hi n tư ng kháng lo i thu c c a vi khu n ph bi n (chi m 90,57%) Như v y, ch ng E coli m i th i gian ñ a ñi m khác có tính kháng kháng sinh khác 1.3 B nh phù ñ u l n vi khu n E coli gây 1.3.1 M m b nh B nh phù ñ u l n (Edema Disease in pig) b nh vi khu n E coli có y u t bám dính Fimbriae 18 (F18) có kh s n sinh ñ c t Verotoxin 2e (VT2e) gây Theo Marques c ng s (1987), b nh sưng phù đ u hay cịn g i “b nh phù thũng” ho c “b nh phù ru t” s tích đ ng nhi u nư c d ch t i t ch c th , d ch tích đ ng thành d dày, thành ru t, ho c dư i mí m t nhi u b ph n khác c a th , song não quan tr ng nh t, gây tri u ch ng th n kinh Các gi ng vi khu n ñã phân l p ñư c t b nh phù ñ u thư ng g p nh t serotype huy t thanh: O138:K81, O139: K82, O141: K85 Serotype O139 ñư c tìm th y kh p th gi i có y u t bám dính F18ab Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 16 1.3.2 D ch t h c B nh phù thũng thư ng x y ñ tu i t - 12 tu n tu i, ñ c bi t giai ño n – tu n sau cai s a L n chưa cai s a có th b m c phù ñ u m c ñ tr m tr ng ph thu c vào kháng th s a c a m l n trư ng thành, phù ñ u thư ng nguyên nhân c a tri u ch ng th n kinh nguyên nhân gây ch t ñáng k L n b b nh thư ng nh ng phát tri n nhanh nh t ñàn B nh x y nhanh k t thúc nhanh, trình di n bi n c a b nh t - 14 ngày, trung bình kho ng tu n T l ch t kho ng 65 - 90 % B nh xu t hi n l t , lây lan t ñàn sang ñàn khác B nh x y r i rác quanh năm thư ng g p nh t vào giai ño n chuy n mùa t xn sang hè, thu sang đơng, nhân dân hay g i ‘‘mùa phù ñ u” 1.3.3 Phương th c truy n lây c a b nh Các ch ng E coli gây b nh ñư c l n m th i theo phân, truy n lây sang l n kh e qua khơng khí, th c ăn, nư c u ng, d ng c chăn nuôi nhân t trung gian khác, xâm nh p vào l n kh e gây b nh Mơi trư ng chu ng cai s a có th ngu n lây nhi m ch ng E coli gây b nh phù ñ u L n chưa cai s a có th nhi m chu ng đ mang đ n chu ng cai s a Vi c xâm nh p c a ch ng E coli gây b nh vào ñàn ñư c nuôi ñi u ki n ñ c bi t khơng có m m b nh (Specific pathogen free - SPF) v n có th g p v i th i gian ng t quãng ñ n năm Nh ng serotype gây b nh phù ñ u sau cai s a thư ng gi ng nh ng vùng r ng (Aareshup cs, 1997) m t vùng b nhi m E coli gây b nh ch ng có kh lưu t n m t th i gian dài, ch ng E coli gây phù m t vùng gi ng Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 17 1.3.4 Cơ ch gây b nh Vi khu n E coli có đư ng tiêu hóa c a l n con, có s thay đ i l n v dinh dư ng, ñi u ki n chăm sóc, ni dư ng, v sinh thú y kém, u ki n ngo i c nh b t l i, d n ñ n s c ñ kháng c a v t suy gi m, vi khu n E coli s tăng v s lư ng, ñ c l c có kh gây b nh ð u tiên vi khu n E coli (mang y u t bám dính F18) t p trung thành đám l p màng nh y c a ri m bàn ch i đ có th bám dính đư c vào thành ru t M c ñ t p trung quy t đ nh li u có gây b nh hay khơng Chúng bám dính vào quan c m nh n (receptor) n m ri m bàn ch i, sau vào l p t bào bi u mơ r i nhân lên, s n sinh ñ c t VT2e T l p t bào bi u mơ, đ c t vào máu đ n quan đích quan thu c h tiêu hóa, hơ h p, não, t i quan ñ c t VT2e gây ho i t thành m ch máu, làm thay đ i tính th m thành m ch gây phù, m t ch ñi u ch nh lu ng máu não, làm t n thương mô não làm xu t hi n tri u ch ng th n kinh có th gây ch t Hình 1.1 Cơ ch gây b nh sưng phù ñ u c a vi khu n E coli Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 18 1.3.5 Tri u ch ng Trong đàn có th xu t hi n nh ng l n ch t ñ t ng t mà không bi u hi n tri u ch ng Nh ng trư ng h p khác th y l n có tri u ch ng th n kinh như: m t thăng b ng, ñi l o ñ o, ñ u nghiêng, ch y lung tung, chân y u ho c li t, lúc g n ch t có hi n tư ng bơi chèo Th khó, kêu khàn khàn qu n b phù L n b b nh thư ng s t ho c s t không cao, m t vài cá th trư c ch t thân nhi t có th h xu ng dư i m c bình thư ng Có hi n tư ng a ch y ngày th - 4, phân l ng có màu vàng xám, ho c tr ng, có ch t nh y, có tồn nư c l n máu, mùi khó ch u (Nguy n Bá Hiên c ng s , 2009) Hi n tư ng phù có th quan sát ñư c vào ngày th - 3, sưng phù mí m t thư ng xu t hi n trư c có d u hi u th n kinh Sau sưng phù mũi, m t, mơi, đ u, m t tai Bi u hi n th n kinh ngày n ng, giai ño n cu i v t co gi t, ho, khó th th c p v t có th ch t nhanh vòng - 20 gi Hình 1.2 L n m t thăng b ng Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nơng nghi p ……………………… 19 1.3.6 B nh tích - B nh tích đ i th Phù bi u hi n ñ c trưng c a b nh, bao g m: Phù mí m t, m t, đ u l n, sưng phù dư i da, ñ c bi t phù dư i l p niêm m c d dày, phù màng treo ru t ño n k t tràng b nh tích r t n hình B ngồi xác l n th y da ñ lên ph n b ng, máu ñ c th m, h ch ru t h ch b n nơng sưng L p dư i niêm m c đư ng cong l n c a d dày, l p màng nh y c a ño n cu i ru t non, ñ u ru t già xu t huy t Xoang b ng xoang ng c tích nư c Viêm ph i màng ph i, lách, th n sưng, t máu ho c xu t huy t Hình 1.3: Phù ru t h ch màng Hình 1.4: Phù tích nư c dư i da treo ru t vùng đ u - B nh tích vi th B nh tích có th xu t hi n r t nhi u mô quan, quan tr ng nh t t n thương không h i ph c ñư c ñ ng m ch tĩnh m ch nh M ng lư i tĩnh m ch vùng gi a k t tràng g n v i h ch b ch huy t c a ru t thư ng b Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… nh 20 hư ng Phù t bào quan n i t ng, t n thương não v i t n thương m ch máu nh M t s hình nh v tri u ch ng b nh tích c a b nh: Hình 1.5 L n phù đ u, phù mí m t, Hình 1.6 Phù tích nư c vùng m t, có tri u ch ng th n kinh mí m t Hình 1.7 Niêm m c ru t xu t huy t Hình 1.8 Niêm m c d dày xu t (bên trái) bình thư ng(bên ph i) huy t (bên trái) bình thư ng (bên ph i) (Ngu n: Tư li u phịng Vi trùng – Trung tâm Ch n đốn Thú y Trung Ương) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 21 1.3.7 Ch n đốn - Ch n đốn b nh d a vào: L a tu i m c b nh, d ch t , tri u ch ng lâm sàng, b nh tích đ i th vi th c a l n b nh - Ch n đốn vi khu n h c phịng thí nghi m theo bư c: + Nuôi c y vi khu n môi trư ng: Th ch máu , th ch MacConkey, nhu m tiêu b n quan sát hình thái vi khu n dư i kính hi n vi + Phân l p, thu n t vi khu n: Ch n khu n l c ñ c trưng ria c y l i môi trư ng th ch nư c pepton, ñ 37oC/24 gi + Giám đ nh tính ch t sinh hóa: Ti n hành làm ph n ng sinh hóa đ c trưng c a vi khu n E coli + Có th ki m tra kh s n sinh ñ c t VT2e b ng cách tiêm cho đ ng v t thí nghi m ho c dùng ph n ng PCR phát hi n gene VT2e - C n ch n đốn phân bi t v i b nh gi d i ho c viêm não 1.3.8 Các lo i vacxin phòng b nh phù ñ u Hi n nay, nhà khoa h c có xu hư ng nghiên c u s n xu t vacxin chu ng Ngư i ta phân l p m t s ch ng E coli gây b nh phù ñ u m t ñ a phương, r i dùng đ ch t o vacxin phịng b nh cho l n m t vùng, vùng ðây m t vacxin vơ ho t có hi u l c phịng b nh cao Có th cho u ng ho c tiêm vacxin sau l n ñư c - tu n tu i (Nguy n Bá Hiên c ng s , 2009) Bên c nh đó, vi c nghiên c u ch t o kháng th qua lịng đ tr ng gà đ phịng ch ng tiêu ch y sưng phù ñ u E coli l n ñang ñư c quan tâm Ngoài ra, th trư ng nư c ta có lưu hành m t s lo i kháng th E coli phịng b nh phù đ u như: Hanvet K.T.EHI c a công ty Hanvet (Nguy n H u Vũ c ng s , 2010), Hanvet TOBACOLI Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 22 CHƯƠNG ð I TƯ NG, N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 ð i tư ng nghiên c u Vi khu n E coli gây b nh phù ñ u phân l p ñư c t l n nghi m c b nh m t s t nh Mi n B c Vi t Nam 2.2 ð a ñi m nghiên c u ð tri n khai n i dung nghiên c u c a ñ tài, chúng tơi th c hi n nghiên c u t i Phòng Vi trùng thu c Trung tâm Ch n đốn Thú y Trung Ương 2.3 N i dung nghiên c u 2.3.1 Xác ñ nh t l phân l p vi khu n E coli gây b nh phù ñ u l n 2.3.2 Xác ñ nh ñ c tính sinh h c c a vi khu n E coli phân l p ñư c 2.3.3 Xác ñ nh y u t ñ c l c c a vi khu n E coli phân l p ñư c - Kh dung huy t - ð c t Verotoxin Vt2e y u t bám dính F18 2.3.4 Xác ñ nh serotype c a vi khu n E coli phân l p ñư c 2.3.5 Xác ñ nh kh m n c m v i kháng sinh c a vi khu n E coli phân l p ñư c 2.4 Nguyên li u 2.4.1 M u b nh ph m l n M u b nh ph m: H ch ru t, ru t, gan, lách, ph i c a l n nghi m c b nh phù ñ u ñã ch t ho c g n ch t M u Trung tâm ñi th c t thu th p ho c ñư c g i t tr i, t nh t i Trung tâm Ch n đốn Thú y Trung ương ñ xét nghi m Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 23 2.4.2 Môi trư ng, nguyên li u phân l p vi khu n, xác ñ nh serotype c a vi khu n - Môi trư ng: Nư c th t (BHI), TSB (Trypton Soya Broth), th ch máu, th ch MacConkey, th ch nghiêng Kligler Iron agar, ñư ng Mannitol, th ch Cimon citrate, th ch Ure, môi trư ng VP - MR c a hãng Merck KgaA - ð c - Kháng huy t chu n c a nh ng type huy t E coli thư ng gây b nh l n - Hóa ch t: B thu c nhu m Gram, dung d ch Kowac’s 2.4.3 Hóa ch t, dung d ch, c p m i dùng ph n ng PCR - Hóa ch t dung d ch c n cho ph n ng PCR: Coral bufer 10X, dNTPs - Kit Taq DNA polymerase c a hãng QIAGEN - Các c p m i: B ng 2.1 Trình t nucleotide c a c p m i xác ñ nh y u t ñ c l c c a vi khu n E coli Gene Kí hi u ðích F18 Trình t nucleotide c a c p m i (5′-3′) Fed A1 Fed A2 CTTGTAAGTAACCGCGTAAGC STII-Bv1(Fw) ATGAAGAAGATGTTTATAGCG STII-Bv2(Rv) VT2e GTGAAAAGACTAGTGTTTATTTC GTTAAACTTCACCTGGGCAAAG Kích c s n ph m (bp) 510 260 - Các dung d ch hóa ch t c n cho bư c ch y ñi n di: 50 x TAE, th ch Agarose 3%; Loading buffer 2.4.4 Môi trư ng, nguyên li u làm kháng sinh đ - Mơi trư ng TSB, th ch kháng sinh Muller Hinton c a hãng Merck KgaA - ð c - Các lo i gi y kháng sinh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 24 2.4.5 D ng c , máy móc - Pipet lo i: 20 µl, 100 µl, 1000 µl - ð u tip tương ng v i pipet - Máy ch y PCR - Máy móc d ng c khác phịng thí nghi m 2.5 Phương pháp nghiên c u 2.5.1 Phương pháp l y m u B nh ph m d ch ru t, h ch ru t, ru t c a l n b m c b nh phù đ u đư c l y vơ trùng N u b nh ph m nh n ñư c t t nh m u đư c l y vô trùng trư c v t ch t mu n nh t gi đư c đưa v phịng thí nghi m vịng 24 gi ñi u ki n b o qu n l nh (4oC - 6oC) 2.5.2 Phương pháp phân l p, xác ñ nh vi khu n E coli t m u b nh ph m Phân l p, xác ñ nh vi khu n E coli theo phương pháp thư ng quy t i Phòng Vi trùng- Trung tâm Ch n đốn Thú y Trung Ương 2.5.3 Phương pháp giám đ nh đ c tính sinh h c c a vi khu n E coli 2.5.3.1 Phương pháp phân l p giám ñ nh vi khu n E coli Quy trình phân l p giám đ nh vi khu n E coli đư c trình bày hình 2.1: 2.5.3.2 Giám đ nh đ c tính sinh hóa c a ch ng vi khu n E coli phân l p ñư c Sau gi ng vi khu n E coli phân l p ñã thu n t, ti n hành giám ñ nh m t s đ c tính sinh v t, hóa h c b n như: ð c tính hình thái, tính ch t ni c y ph n ng lên men ñư ng theo phương pháp thư ng quy - Ki m tra tính ch t m c: Nuôi c y môi trư ng b n: Nư c th t, th ch máu, th ch MacConkey quan sát tính ch t m c, hình thái, màu s c khu n l c - Ki m tra hình thái h c: Làm tiêu b n nhu m Gram, quan sát hình thái dư i kính hi n vi Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 25 - Ki m tra đ c tính sinh hóa: + Môi trư ng th ch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar): Cho phép ki m tra kh lên men ñư ng Lactoza, ñư ng Glucoza, kh sinh hơi, sinh H2S + Môi trư ng TSB: Cho phép ki m tra kh sinh Idol c a vi khu n nh thu c th Kowacs ð c ñi m d ch t Ki m tra lâm sàng M khám Ki m tra b nh tích B nh ph m Phân l p, giám đ nh sinh hố Xác đ nh y u t ñ c l c F18 VT2 ð nh týp huy t K t lu n Hình 2.1 Sơ đ ch n đốn thư ng quy b nh phù vi khu n E coli (Ngu n: Quy trình ch n đốn thư ng quy - Phịng Vi trùng – Trung tâm Ch n đốn Thú y Trung Ương) + Môi trư ng Mannitol: Cho phép ki m tra kh lên men ñư ng Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 26 Mannitol, kh di ñ ng + Môi trư ng Cimon citrate: Cho phép ki m tra kh s d ng citrate + Môi trư ng Ure: Cho phép ki m tra kh phân h y ure + Môi trư ng Voges Proskauer – Methyl Red (VP- MR) 2.5.3.3 Xác ñ nh kh dung huy t c a vi khu n E coli Kh dung huy t c a vi khu n E coli ñư c xác ñ nh b ng ph n ng gây dung huy t th ch máu bê – 7% Vi khu n E coli ñã phân l p ñư c ria c y môi trư ng th ch máu, b i dư ng 37oC/24 gi ñ c k t qu : - Dung huy t hoàn toàn (β - haemolysin): Xung quanh khu n l c có vịng tan máu to, rõ, có th nhìn đư c qua mơi trư ng - Dung huy t khơng hồn tồn (α - haemolysin): Xung quanh khu n l c có vịng tan máu nh - Không dung huy t (γ - haemolysin): Xung quanh khu n l c khơng có vịng tan máu 2.5.3.4 Xác ñ nh serotype O c a vi khu n E coli Vi khu n E.coli có nhi u serotype, ch ti n hành ñ nh type huy t v i m t s serotype ch y u có b nh sưng phù ñ u tiêu ch y sau cai s a l n là: O138:K81, O139:K82, O141:K85ab, O141:K85ac, O147, O149, O157, O78:K80, O64:K88; O101:K28, O8:K87, O9:K35 Serotype c a vi khu n E coli ñư c xác ñ nh b ng ph n ng ngưng k t nhanh phi n kính - V t li u: + Vi khu n E coli ñư c gi th ch máu ho c TSB Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 27 ... i 14 B c Ninh B c Giang 11 Phú Th 11 H i Dương Thái Bình Hà Nam Nam ð nh T ng 63 VT2e F18 S ch ng (+) S ch ng (+) (T l %) (T l %) 14 14 (10 0%) (10 0%) 7 (10 0%) (10 0%) 11 11 (10 0%) (10 0%) 11 11 ... Enrofloxacin ≤ 16 ≥ 17 Gentamycin 10 ≤ 12 ≥ 13 Kanamycin 30 ? ?13 ≥ 14 Norfloxacin 10 ? ?12 ≥ 13 Streptomycin 10 ? ?11 ≥ 12 Tetracyclin 30 ≤ 14 ≥ 15 25 ≤ 15 ≥ 16 10 Trimethoprim/ Sulfamethroxazol Trư... 14 1. 2.8 Tính kháng kháng sinh c a vi khu n E.coli 15 1. 3 B nh phù ñ u 16 1. 3 .1 M m b nh 16 1. 3.2 D ch t h c 17 1. 3.3 Phương th c truy n lây c a b nh 17 1. 3.4 Cơ ch gây b nh 18 Vi t Nam l n vi