Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens

Kỹ thuật chuyển gen có thể đưa ra một con đường hiệu quả hơn các phương pháp truyền thống cho phép đưa các tính trạng đặc biệt vào cây đậu nành như khả năng kháng sâu bệnh, kháng thuốc d

-oOo -

TRẦN LÊ LƯU LY

CHUYỂN GEN RETROTRANSPOSON Tnt1 VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max) BẰNG PHƯƠNG PHÁP Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2011

Lời cảm ơn

Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy, cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS N guyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi

hoàn thành luận văn này

P GS TS Bùi Văn Lệ đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và

nghiên cứu

Cô Cung Hoàng P hi P hượng, chị N guyễn Hồng N hã Trân, bạn N guyễn Thanh N hật Q uang đã ủng hộ, giúp đỡ

về mọi mặt trong thời gian tôi làm luận văn xa nhà

Thầy Kiều P hương N am, Chị Q uách N gô Diễm P hương, bạn N guyễn Hữu Hoàng, bạn Bùi Xuân S ơn, em Trần Minh Tuấn, em Hoàng Thị Thanh Minh, cùng các em sinh viên đã và đang làm việc tại bộ môn CN S H Thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong công việc, học tập cũng như

nghiên cứu

Chị Bùi Lan A nh, chị N guyễn P han Cẩm Tú đã tận tình

góp ý và sửa chữa trong quá trình hoàn thiện luận văn

A nh và gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ và nâng đỡ tôi

I would like to be grateful to:

Dr Zhanyuan Zhang, the Director of P lant Transformation Core Facility (P TCF), University of Missouri for thoughtful

recommendations and helpful scientific discussions

Dr Barapuram S hyam, Dr Heyoung Lee, J ennie and all staff members of P TCF for kindly showing me the soybean transformation protocol and friendly helping during my

work

Dr Henry T N guyen for providing the scholarship and

financial support to me during this study

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 1 năm 2011

Trần Lê Lưu Ly

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 TỒNG QUAN 3

1.1 Cây đậu nành 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học 3

1.1.3 Điều kiện nuôi trồng 4

1.1.4 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng đậu nành trên thế giới 4

1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của hạt đậu nành 5

1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu nành 5

1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành 7

1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 8

1.2.1 Phân loại vi khuẩn A tumefaciens 8

1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A tumefaciens 8

1.2.3 Ti plasmid 8

1.2.4 Quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens 10

1.2.5 Ứng dụng Ti plasmid trong công nghệ gen thực vật 11

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen bằng A tumefaciens… 12

1.3 Một số phương pháp chuyển gen khác 17

1.3.1 Phương pháp bắn gen 18

1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted

Agrobacterium-mediated transformation) 18

1.3.3 Phương pháp lọc chân không 19

1.3.4 Phương pháp Floral-dip 19

1.3.5 Phương pháp Agrolistic 19

1.3.6 Vi tiêm DNA 19

1.3.7 Vi sợi "whiskers" 20

1.3.8 Phương pháp PEG (Polyethylene glycol) 20

1.3.9 Phương pháp xung điện 20

1.4 Retrotransposon 20

1.4.1 Giới thiệu… 21

1.4.2 Cơ chế chuyển vị của retrotransposon 21

1.4.3 Phân loại retrotransposon thực vật 22

1.4.4 Phân lập và ứng dụng LTR retrotransposon thực vật 23

1.4.5 Retrotransposon Tnt1 24

1.5 Nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành trên thế giới 25

1.5.1 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp truyền thống 25

1.5.2 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp chuyển gen 26

1.6 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong phân tích cây chuyển gen 32

1.6.1 Phương pháp thử in vitro và ex vitro khả năng biểu hiện gen chọn lọc bar của cây chuyển gen 32

1.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền dùng polymerase) 32

1.6.3 Điện di trên gel agarose 34

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Đậu nành… 35

2.1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và plasmid 36

2.1.3 Vật liệu cho các thí nghiệm sinh học phân tử 36

2.2 Phương pháp 38

2.2.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của

Tnt1 bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 38

2.2.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 39

2.2.3 Các bước thực hiện quy trình chuyển gen bằng A tumefaciens trên mẫu lá mầm cây đậu nành 40

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen……… 43

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen 44

2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 44 2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 45

2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A tumefaciens AGL1 sau khi đồng nuôi cấy……… 45

2.2.9 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 47

2.2.10Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn ươm bằng phương pháp leaf – painting 48

2.2.11Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 49

2.3 Phương pháp xử lí số liệu 50

2.4 Điều kiện thí nghiệm 50

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52

3.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của Tnt1 bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 52

3.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 53

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen 54

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen 56

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 60

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 62 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A tumefaciens AGL1 sau khi đồng nuôi cấy…… 64

3.7.1 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A tumefaciens AGL1 64

3.7.2 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy……… 66

3.8 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 69

3.9 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn ươm bằng phương pháp leaf – painting 71

3.10 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 73

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

4.1 Kết luận 76

4.2 Đề nghị 77

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH TỔNG QUAN

Hình 1 1: Cây đậu nành 3

Hình 1 2: Các quốc gia chính sản xuất đậu nành trên thế giới, thống kê năm 2009 4

Hình 1 3: Tái sinh in vitro cây đậu nành thông qua việc tạo phôi soma 6

Hình 1 4: Một số sản phẩm từ đậu nành 7

Hình 1 5: Trồng và thu hoạch đậu nành tại Mỹ 7

Hình 1 6: Agrobacterium tumefaciens 8

Hình 1 7: Cấu tạo của Ti plasmid 9

Hình 1 8: Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens 10

Hình 1 9: Sơ đồ cấu trúc các loại retrotransposon 22

Hình 1 10: Cơ chế chuyển vị của DNA transposon và retrotransposon 22

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hình 2 1: Cấu trúc plasmid pZY 101 và pSH – Tnt1 36

Hình 2 2: Bình hút ẩm dùng để khử trùng (A) và hạt đã khử trùng trên môi trường GM (B) 40

Hình 2 3: Quy trình tạo vết thương trên vùng nốt lá mầm 41

Hình 2 4: Mẫu lá mầm đậu nành sau khi ủ chung với vi khuẩn trên môi trường đồng nuôi cấy 42

Hình 2 5: Khuẩn lạc A tumefaciens AGL1 mang plasmid pZY 101 – Tnt1 trên môi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin 42

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Hình 3 1: Kết quả điện di plasmid pZY 101 – Tnt1 và plasmid pZY 101 – Tnt1 cắt với enzyme EcoRI 52

Hình 3 2: Hạt đậu nành giống Maverick đã khử trùng (A) và nảy mầm 5 ngày trên môi trường GM (B) 53

Hình 3 3: Biểu đồ ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển gen 55

Hình 3 4: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển

gen sau 2 tuần nuôi cấy 55

Hình 3 5: Biểu đồ ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành 57

Hình 3 6: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy: A – giai đoạn tái sinh, B – giai đoạn chọn lọc, C – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền thứ 1, D – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền thứ 2 58

Hình 3 7: Chồi trên môi trường SI không glufosinate (A) và có 10 mg/l glufosinate (B) quan sát dưới kính lúp 59

Hình 3 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả biến nạp gen 61

Hình 3 9: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 62

Hình 3 10: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy 63

Hình 3 11: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự phát triển của A tumefaciens AGL1 65

Hình 3 12: Biểu đồ ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy 67

Hình 3 13: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên sự loại bỏ A tumefaciens ra khỏi mẫu qua các giai đoạn nuôi cấy 68

Hình 3 14: Chọn lọc chồi và ra rễ in vitro 70

Hình 3 15: Cây đậu nành chuyển gen trong phòng tăng trưởng 71

Hình 3 16: Cây đậu nành chuyển gen sau 15 ngày chuyển ra nhà kính 72

Hình 3 17: Thử nghiệm leaf – painting ngoài vườm ươm 73

Hình 3 18: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar 74

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Hình 4 1: Quy trình chuyển gen trên đậu nành bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens 77

DANH MỤC BẢNG TỔNG QUAN

Bảng 1 1: Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen đậu nành công bố trong

và ngoài nước 29

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 2 1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy in vitro cây đậu nành 35 Bảng 2 2: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen bar 50 Bảng 2 3: Chương trình PCR khuếch đại gen bar 50

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Bảng 3 1: Kết quả đo NanoDrop plasmid pZY 101 – Tnt1 52

Bảng 3 2: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển

gen 54Bảng 3 3: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành 57Bảng 3 4: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 60Bảng 3 5: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 62Bảng 3 6: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên

sự phát triển của A tumefaciens AGL1 65

Bảng 3 7: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn qua các giai đoạn nuôi cấy của quá trình chuyển gen 66

MỞ ĐẦU

Thuốc lá chuyển gen ra đời đầu tiên năm 1983 đã mở đầu cho sự phát triển và tiến bộ của cây chuyển gen Các loại cây trồng chuyển gen như đậu nành, bông vải, bắp, lúa và các loại cây cảnh đã được nghiên cứu rộng rãi và thương mại hóa trên thế giới Theo thống kê của ISAAA (2010), có 14 triệu nông dân, ở 25 quốc gia, trồng 134 triệu hecta cây biến đổi gen vào năm 2009, tăng 7% so với năm 2008

Đậu nành là một trong những cây thực phẩm có hàm lượng dầu thực vật

và dinh dưỡng cao, dễ trồng và có hiệu quả kinh tế Sản phẩm từ cây đậu nành được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành…đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc Ngoài ra, dầu và protein của đậu nành còn được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực công nghiệp và dầu sinh học (biodiesel) Năm 2009, sản lượng đậu nành chiếm 53% hạt có dầu trên toàn thế giới Mỹ là nước sản xuất đậu nành lớn nhất thế giới với 31,4 triệu hecta đạt doanh thu 31,9 tỉ đô la, trong đó 34,9 triệu tấn đậu nành đã được xuất khẩu thu về 21 tỉ đô la Trung Quốc là khách hàng tiêu thụ đậu nành lớn nhất của Mỹ với 9,2 tỉ đô la, Mexico xếp thứ 2 với 1,3 tỉ

đô la [63]

Tại Việt Nam, đậu nành là cây thực phẩm quan trọng với nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng cao, tuy nhiên năng suất cây trồng này còn thấp, bình quân chỉ khoảng 1,9 tấn/ha Vì vậy việc áp dụng các phương pháp biến đổi, tạo giống mới, tạo nhiều biến dị tốt là cần thiết để giúp nâng cao năng suất đậu nành Kỹ thuật chuyển gen có thể đưa ra một con đường hiệu quả hơn các phương pháp truyền thống cho phép đưa các tính trạng đặc biệt vào cây đậu nành như khả năng kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tổng hợp acid amin, tăng hàm lượng acid béo, sản xuất dầu sinh học…

Kể từ khi nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành đầu tiên được công

bố vào năm 1988 (Hinchee và cộng sự, 1988; McCabe và cộng sự, 1988), đậu nành biến đổi gen đã được nghiên cứu phát triển và nhân giống rộng rãi bởi các

nhà sản xuất của Mỹ, Argentina, Canada, Brazil…77% đậu nành thương mại hóa trên thị trường là đậu nành đã biến đổi gen Genome của đậu nành cũng đã được giải trình tự trong thời gian gần đây bởi các nhà nghiên cứu của viện Energy – Joint Genome (DOE - JGI) mở ra nhiều cơ hội mới cho công tác nhân giống và chuyển gen đậu nành Có khoảng 60.000 gen được phân tích trong đó 5.671 là các nhân tố phiên mã sẽ quyết định kiểu hình bao gồm kháng hạn, kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao…[55] Tuy nhiên, khoảng 45 – 50.000 gen của đậu nành đến nay vẫn còn chưa rõ chức năng Do đó, nhiệm vụ các nhà nghiên cứu di truyền cây đậu nành là tập trung vào việc tìm hiểu các gen quy định các tính trạng có lợi cho con người Việc ứng dụng các nhân tố chuyển vị trong chuyển gen trên thực vật nhằm tạo ra các quần thể đột biến không chỉ với mục tiêu làm đa dạng giống loài mà còn là một trong những công

cụ đắc lực cho việc tìm hiểu chức năng của gen thông qua di truyền ngược Các

nhân tố chuyển vị được ứng dụng cho thực vật bao gồm: retrotransposon Tnt1 (phân lập từ cây thuốc lá), Ac/Ds (phân lập từ cây bắp) và mPing (phân lập trên

lúa)…

Trong thời gian gần đây ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về chuyển

gen vào thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens, tuy

nhiên chưa có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên cây đậu nành Do đó, mục đích nghiên cứu của luận văn “Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens” là tối ưu hóa

một số thông số của qui trình chuyển gen dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây đậu nành, đồng thời thử nghiệm biến nạp gen mã hóa retrotransposon Tnt1 nhằm tạo ra các quần thể mang đột biến chèn cho nghiên

cứu kiểu hình và làm vật liệu cho các nghiên cứu di truyền ngược tìm hiểu chức năng của gen

Glycine max là loài có tính tự thụ phấn với tỉ lệ lai chéo thấp hơn 1%

(Chiang và Kiang, 1987) Do đó, cây đậu nành có kiểu gen gần như đồng hợp thuần chủng Đậu nành được di truyền từ 1 tổ tiên lưỡng bội có n=11, trải qua quá trình lệch bội hóa (aneuploid) làm n=10 và theo sau đó là quá trình đa bội hóa (polyploidization) để hình thành nên genome hiện nay với 2n=2x=40 (Lackey, 1980) Bằng chứng về sự nhân đôi bộ gen cho thấy genome đậu nành tồn tại ổn định ở dạng thể bốn (tetraploid) với genome được nhị bội hóa Có khoảng 40-60% genome đậu nành chứa các trình tự lặp lại, được chứng minh bằng phân tích RFLP (Goldberg, 1978; Gurley và cộng sự, 1979) 90% các mẫu

dò RFLP phát hiện các loci được nhân đôi (Shoemaker và cộng sự, 1996) Ở đậu nành cũng có sự đa hình thấp trong genome, bằng chứng là Zhu và cộng sự (2003) đã tính được tần số SNP (single nucleotide polymorphism) chỉ 0,5 SNP/kb trên vùng DNA mã hóa và 4,7 SNP/kb trên vùng DNA không mã hóa

Hình 1 1: Cây đậu nành [71]

Hình 1 2: Các quốc gia sản xuất đậu nành lớn trên thế giới, thống kê năm 2009 [72]

protein, trong khi con số này cao hơn gấp 10 lần ở bắp (Ching và cộng sự, 2002)

1.1.3 Điều kiện nuôi trồng

Đậu nành sinh trưởng tốt trong mùa hè nóng, nhiệt độ phát triển tối ưu khoảng 20°C – 30°C, nhiệt độ dưới 20°C hoặc trên 40°C sẽ làm chậm quá trình phát triển của cây Chúng có thể phát triển trên một dãi rộng các loại đất, đặc biệt tốt trên đất phù sa ẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao Đậu nành cũng như các cây họ đậu khác cũng có quá trình cố định nitrogen thông qua sự cộng sinh

với vi khuẩn Rhizobium japonicum Các giống đậu nành hiện nay có thể đạt

chiều cao khoảng 1 m, thời gian từ lúc gieo hạt đến thu hoạch khoảng 80 – 120 ngày [74]

1.1.4 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng đậu nành trên thế giới

Đậu nành được gieo trồng lần đầu

tiên ở Trung Quốc cách đây khoảng

6000 năm, đây là một trong số những

cây lương thực đầu tiên được thuần hóa

Cho đến nay, có khoảng 82 quốc gia trên

thế giới trồng và sản xuất các sản phẩm

từ đậu nành theo thống kê của tổ chức

FAO

Năm 2009, tổng sản lượng đậu

nành được sản xuất trên thế giới là 210,9

triệu tấn Mỹ là nước dẫn đầu với sản

lượng 80,7 triệu tấn (chiếm 38% so với

toàn thế giới) Brazil xếp thứ 2 với 57

triệu tấn chiếm 27%, Argentina 15% (32

triệu tấn), Trung Quốc 7% (15,5 triệu

tấn)…(hình 1.2) [11], [40], [59], [72]

1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của hạt đậu nành

Dầu và protein chiếm 60% trọng lượng khô của hạt đậu nành, trong đó protein gồm 18 amino acid thiết yếu chiếm 40% và dầu chiếm 20% Phần còn lại gồm có 35% carbonhydrate và 5% chất xơ

Hầu hết các protein từ đậu nành bền với nhiệt, do đó chúng có thể tồn tại khi chế biến ở nhiệt độ cao như trong quy trình sản xuất đậu hũ, sữa đậu nành hay bột đậu nành Các dạng carbonhydrate chính của đậu nành là sucrose, raffinose và stachyose

Dầu đậu nành là một trong số ít các loại dầu thực vật phổ biến có chứa một lượng lớn acid béo alpha – linolenic và omega – 6 Trong 100 g dầu có chứa 7 g omega – 3 và 51 g omega – 6

Đậu nành cũng có chứa các loại isoflavone là genistein và daidzeon với hàm lượng 3 mg/g trọng lượng khô Đây là các dạng của phytoestrogen được các chuyên gia dinh dưỡng và bác sĩ công nhận là có tác dụng ngăn chặn ung thư và các bệnh rối loạn nội tiết

Ngoài ra, đậu nành còn chứa một lượng lớn phytic acid – một chất chống oxy hóa có tác dụng giảm ung thư, tiểu đường và chứng sưng viêm [38], [42], [67]

1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu nành

[50]

Một trong những điều kiện cần thiết và trước tiên nhất cho mọi quy trình

chuyển gen là khả năng nhân giống cây trong điều kiện in vitro Có hai phương pháp tái sinh cây đậu nành in vitro chính đã được thiết lập là: tạo chồi bất định

và tạo phôi soma

1.1.6.1 Tái sinh in vitro cây đậu nành thông qua sự phát sinh chồi bất định

Phát sinh chồi bất định là quá trình chồi hình thành và phát triển từ các loại mô khác nhau Chồi sẽ được nuôi cấy và tạo rễ để hình thành cây mới Trong quy trình chuyển gen, DNA ngoại lai sẽ được biến nạp vào mô phân sinh chồi hoặc mô có khả năng phát sinh thành chồi

Hình 1 3: Tái sinh in vitro cây đậu nành thông

qua việc tạo phôi soma [61]

Vùng giao nhau giữa lá mầm và trục hạ diệp (vùng nốt lá mầm – cotyledonaty node) là nơi cung cấp nguồn mô phân sinh lí tưởng cho việc tạo chồi Chồi bất định trên cây đậu nành đã được nghiên cứu và công bố lần đầu tiên bởi Wright và cộng sự năm 1986 với vật liệu ban đầu là nốt lá mầm Khi đặt mẫu trên môi trường có BAP, chồi được hình thành từ các vùng mô dưới lớp biểu bì Một trong những ưu điểm chính của phương pháp này là cây con hoàn chỉnh được hình thành trong khoảng thời gian dưới 3 tháng, trong khi với phương pháp thông qua phôi soma cần tới 4 tháng hoặc hơn

1.1.6.2 Tái sinh in vitro cây đậu nành qua việc tạo phôi soma

Phát sinh phôi soma là quá

trình mà qua đó phôi được tạo thành

từ vi bào tử (microspore) hoặc mô

sinh dưỡng Phôi soma có cả cực chồi

và cực rễ, sẽ hình thành cây con hoàn

chỉnh thông qua giai đoạn nảy mầm

Finer (1988) đã công bố quy

trình tạo phôi soma trên cây đậu nành,

trong đó phôi được cảm ứng hình

thành từ vật liệu là lá mầm chưa

trưởng thành trên môi trường có nồng

độ 2,4-D cao (40 mg/l) Phôi có thể

được phân chia trên chính môi trường

cảm ứng hoặc nuôi cấy lỏng tạo dịch

huyền phù trên môi trường có nồng độ

2,4-D thấp hơn (Finer và Nagasawa, 1988) Các phân tích về mô học của quá trình phân chia phôi soma cây đậu nành cho thấy, phôi mới được bắt nguồn tại ngay hoặc gần vị trí mặt ngoài của phôi cũ (Finer và McMullen, 1991) Với hệ thống này, phôi được xem là vật liệu thích hợp cho chuyển gen trên đậu nành

Hình 1 5: Trồng và thu hoạch đậu nành tại Mỹ [69], [70], [73]

Hình 1 4: Một số sản phẩm từ đậu nành [60]

1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành

Đậu nành là cây thực phẩm có hàm

lượng dinh dưỡng cao, dễ trồng và có hiệu

quả kinh tế Sản phẩm từ cây đậu nành được

sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt

thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành

dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo,

sữa đậu nành đáp ứng nhu cầu đạm trong

khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng

như gia súc Ngoài ra, dầu và protein của

đậu nành còn được ứng dụng rất nhiều trong

lĩnh vực công nghiệp và dầu sinh học

(biodiesel)

Năm 2009, sản lượng đậu nành

chiếm 53% hạt có dầu trên toàn thế giới

Mỹ là nước sản xuất đậu nành lớn nhất thế giới với 31,4 triệu hecta doanh thu 31,9 tỉ đô la, trong đó 34,9 triệu tấn đậu nành đã được xuất khẩu thu về 21 tỉ đô

la Trung Quốc là khách hàng tiêu thụ đậu nành lớn nhất của Mỹ với 9,2 tỉ đô

la, Mexico xếp thứ 2 với 1,3 tỉ đô la [63]

Ở Việt Nam và một số quốc gia châu Á khác, đậu nành là một trong những cây lương thực chủ yếu Trong một vài năm gần đây, nông dân vùng đồng bằng sông Cửu Long như ở Lấp Vò, Lai Vung (Đồng Tháp), Chợ Mới (An Giang), Phước Thới (Ô Môn, Cần Thơ) đã trồng đậu nành thay thế cho vụ lúa xuân hè do hiệu quả kinh tế cao hơn so với trồng lúa Giá đậu nành thương

phẩm tại Việt Nam là 15.000 đồng/kg, thu nhập từ 3,5 – 40 triệu đồng/công, trừ chi phí mỗi công còn lãi trên 2 triệu đồng [66]

1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn

Loài: Agrobacterium tumefaciens

1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hình que, di động,

không sinh bào tử, sống tự do trong đất, tăng trưởng tối ưu ở 32oC

A tumefaciens có cấu trúc bộ gen đặc biệt gồm 2 nhiễm sắc thể (1

nhiễm sắc thể vòng và 1 nhiễm sắc thể dạng sợi thẳng) và 2 plasmid dạng vòng, tổng cộng có khoảng 5400 gen Trong đó có Ti plasmid (Tumor inducing) dài hơn 200 kb đóng vai trò then chốt trong sự cảm ứng hình thành khối u bệnh ở thân và rễ của thực vật hai lá mầm, đặc biệt là họ hoa hồng như: đào, lê, táo, hạnh nhân, mâm xôi…

Khi xâm nhiễm vào cây A tumefaciens sẽ di chuyển khắp hệ thống rễ

làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng của rễ, làm giảm sức sống của cây nhưng đối với những cây trưởng thành, tác động của bệnh không nhiều [2], [44], [64]

1.2.3 Ti plasmid

Ti plasmid là DNA vòng riêng biệt của A tumefaciens có khả năng sao

chép độc lập trong tế bào vi khuẩn Plasmid gồm hai thành phần chính là T-DNA

và vùng vir (vùng độc tính), ngoài ra còn có vùng sao chép plasmid, vùng phụ trách chuyển nạp plasmid và vùng dị hóa opine (hình 1.7) [2], [44], [64]

Hình 1 6: Agrobacterium tumefaciens [62]

Hình 1 7: Cấu tạo của Ti plasmid

1.2.3.1 T-DNA

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb chứa các gen mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Nhờ khả năng tổng hợp auxin và cytokinin mà các tế bào khối u của thực vật bị nhiễm

có thể tăng trưởng in vitro mà không cần bổ sung thêm các chất điều hoà tăng

trưởng

Opine là các amino acid bất thường được vi khuẩn sử dụng như nguồn dinh dưỡng (nguồn carbon và nitơ) để sinh sản nhanh chóng Bản chất của opine tùy thuộc vào kiểu plasmid của vi khuẩn và được quy định bởi Ti

plasmid Các chủng A tumefaciens khác nhau sẽ mang các dạng Ti plasmid

khác nhau mã hóa cho việc sản xuất các dạng opine khác nhau Các opine thường gặp là: octopine, nopaline và agropine

Trong Ti plasmid, vị trí T-DNA được giới hạn bằng lề phải (Right Border-RB) và lề trái (Left Border-LB) Đây là những trình tự lặp lại bao gồm

25 cặp nucleotide, đóng vai trò như tín hiệu nhân tố cis cho bộ máy vận chuyển T-DNA từ plasmid của vi khuẩn vào DNA tế bào thực vật [2], [44], [64]

1.2.3.2 Vùng gen vir

Quá trình vận chuyển T-DNA là sự phối hợp nhịp nhàng bởi hoạt động

của các protein được mã hóa trong vùng vir

(vùng gen gây bệnh) của Ti plasmid và một

số gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn

Vùng gen vir dài 30-40 kb bao gồm ít

nhất 6 operon quan trọng (virA, virB, virC,

virD, virE, virG ) và 2 operon không quan

trọng (virF, virH) Chỉ có 2 operon biểu hiện

chính là virA, virG, mã hóa cho một cấu trúc

2 thành phần virA-virG kích hoạt sự sao

chép của các gen vir khác Các vùng virA, virB, virD, virG đóng vai trò thiết yếu trong sự vận chuyển T-DNA, vùng virC, virE góp phần làm tăng tính hiệu

quả của quá trình xâm nhiễm [2]

1.2.4 Quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens

Trong tự nhiên, khi cây bị thương sẽ tiết ra một số hợp chất phenol và

đường, các chất này thu hút A tumefaciens Tế bào A tumefaciens sẽ bám vào

vách tế bào chủ ngay tại vị trí mô bị thương nhờ sự giúp đỡ của các “binding

protein” và “attachment protein” - được mã hóa bởi các gen chA, chB, pscA, và att trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn

Các hợp chất tiết ra từ mô bị thương, quan trọng nhất là các monosaccharid và phenol, được nhận diện bởi hệ thống truyền tín hiệu 2 thành

phần VirA-VirG trên màng tế bào A tumefaciens VirA trực tiếp tương tác với

các hợp chất đó và trải qua quá trình tự phosphoryl hóa, kéo theo sự transphosphoryl hóa của VirG - một nhân tố điều hòa phiên mã có chức năng

hoạt hóa các promotor của các gen vir khác trên Ti plasmid Mạch đơn T-DNA

được tạo ra nhờ sự phối hợp hoạt động của VirD1 và VirD2 (có vai trò như các endonuclease cắt chuyên biệt tại vùng lề phải và lề trái trên Ti plasmid) Ngay sau khi cắt và hình thành bản sao T-DNA mạch đơn, VirD2 được gắn vào mạch T-DNA này bằng nối cộng hóa trị tại đầu 5', hình thành phức hợp T chưa đầy

đủ (gồm mạch đơn T-DNA và VirD2) Chỗ hổng tại vùng T-DNA trên Ti

Hình 1 8: Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens [51]

plasmid sẽ được sửa chữa nhờ quá trình tổng hợp DNA và cơ chế hồi phục của

vi khuẩn

Phức hợp T chưa đầy đủ sẽ được đóng gói bởi các protein VirE2, hình thành cấu trúc cuộn (để bảo vệ khỏi các nuclease nội bào và thuận tiện cho quá trình vận chuyển), đây là phức hợp T đầy đủ VirE2 sau đó sẽ bị tách ra khỏi phức hợp bởi VirE1, ngăn không cho VirE2 gắn vào T-DNA cho đến khi vào tế bào chất của tế bào thực vật Bên cạnh đó, VirD4 kết hợp với 11 protein VirB tạo thành phức hệ vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ VirD4 có tác dụng như cầu nối thúc đẩy sự vận chuyển phức hợp T-DNA/VirE2 do VirB thực hiện

Bên trong tế bào chất của tế bào chủ, VirD2 và VirE2 có mang tín hiệu định vị nhân (nuclear locational signal - NLS) làm vô hiệu hóa các protein nhận biết trên màng nhân Ngoài ra, sự chuyển phức hợp T vào nhân qua lỗ nhân và sát nhập vào bộ gen tế bào chủ được hỗ trợ bởi các tương tác giữa VirD2 và VirE2 với các protein của tế bào chủ như: protein AtKAPα, CypA, RocA, Roc1, PP2C, VIP1, VIP2, và Ran [51], [52]

1.2.5 Ứng dụng Ti plasmid trong công nghệ gen thực vật

Các nghiên cứu về cơ chế phân tử của quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật cho thấy có 3 sự kiện của quá trình có thể ứng dụng trong biến nạp gen thực vật:

- Thứ nhất: sự hình thành khối u ở các tế bào trải qua quá trình biến nạp

là kết quả của sự vận chuyển, sát nhập và biểu hiện các gen trên vùng T-DNA

- Thứ hai: các gen trên vùng T-DNA chỉ được phiên mã trong tế bào thực vật và không đóng vai trò gì trong quá trình vận chuyển

- Thứ ba: bất kỳ DNA nào nằm giữa hai lề của T-DNA cũng đều được chuyển vào tế bào thực vật

Các sự kiện này cho phép các nhà khoa học phát triển các plasmid nhân

tạo, hệ thống các dòng vi khuẩn và biến A tumefaciens trở thành công cụ đắc

lực trong công nghệ gen thực vật [35]

Vì Ti plasmid có nhiều nhược điểm (cồng kềnh, không có vùng

multicloning site, không tự nhân được trong tế bào E coli và gây khối u cho

cây chuyển gen), người ta cải tiến Ti plasmid bằng cách cắt bỏ các gen không cần thiết, chèn thêm gen chọn lọc, gen chỉ thị, gen mục tiêu và các promotor

thích hợp để DNA có thể tự nhân trong tế bào E coli, trong A tumefaciens và

trong tế bào thực vật, thu nhỏ plasmid và có các vị trí thuận lợi cho enzyme cắt giới hạn

Các plasmid nhân tạo sử dụng cho A tumefaciens gồm 2 loại:

- Vector đồng nhập (cointergrated vector): gen ngoại lai được gắn vào Ti

plasmid chung với vùng gen vir (Ruvkin và Ausubel, 1979) Dạng này gen

ngoại lai có thể gắn vào bất kì đâu trên vùng T-DNA (hay các vùng khác trên

Ti plasmid) Tuy nhiên loại vector này lớn và cồng kềnh, gây rất nhiều trở ngại

- Vector hai nguồn (binary vector): gen ngoại lai được gắn vào trong vùng T-DNA trên một ORF (open reading frame) riêng, khác với plasmid chứa

vùng gen vir (Hoekema và cộng sự, 1983; de Frammond và cộng sự, 1983) Theo đó, có hai đơn vị sao chép cùng tồn tại song song trong tế bào A tumefaciens, một mang gen vir và một mang vùng T-DNA Dạng này khắc

phục được sự cồng kềnh của vector đồng nhập nên được sử dụng rất phổ biến [51]

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen bằng A

tumefaciens

Các nhân tố ảnh hưởng lên sự vận chuyển và sát nhập T-DNA vào bộ gen thực vật bao gồm: kiểu gen của cây, loại mô, dòng vi khuẩn, hóa chất cảm

ứng gen vir, thành phần môi trường nuôi cấy, tình trạng hư hại của mô, sự loại

bỏ A tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy Để thiết kế các quy trình tối ưu và gia

tăng hiệu quả biến nạp, người ta đi sâu tìm hiểu các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp

chuyển gen trên cây lúa và bắp (Hiei và cộng sự, 1994; Zhao và cộng sự, 2001; Frame và cộng sự, 2002) Uze và cộng sự (1997) quan sát thấy xử lý với 65 g/l sucrose làm tăng hiệu quả biến nạp ở phôi chưa trưởng thành của lúa Tuy nhiên, xử lý thẩm thấu không có hiệu quả trên lúa mì (Ye và cộng sự, 2000) [35]

- Xử lý tiền nuôi cấy: trước khi ủ chung với A tumefaciens người ta nuôi

cấy mô mục tiêu trên môi trường cảm ứng tạo chồi một thời gian Phương pháp

này được chứng minh là có hiệu quả rất cao trên cây Arabidopsis thaliana (Sangwan và cộng sự, 1991) và Saintpaulia ionantha (Satoshi và cộng sự,

2001) [21]

1.2.6.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A tumefaciens

Thời gian đồng nuôi cấy tối ưu khác nhau trên các loại cây khác nhau, chẳng hạn: 48 giờ đối với cây canola (Cardoza & Stewart, 2003), 72 giờ đối với cây bắp cải Trung Quốc (Zhang và cộng sự, 2000)…

Mật độ vi khuẩn trong chuyển gen trên lúa có thể từ 1 x 106 đến 1 x 1010cfu/l, trong đó tối ưu là 1 x 1010 cfu/l (Hiei và cộng sự, 1997) Nồng độ này

cũng tối ưu đối với lúa Ở bắp, nồng độ vi khuẩn càng cao thì cho biểu hiện gus

càng cao nhưng lại làm giảm sự hình thành mô sẹo và hiệu suất biến nạp tối đa thu được ở nồng độ 0,5 x 1010

cfu/l (Zhao và cộng sự, 2001) Các thí nghiệm với các loại mẫu cấy khác nhau của cây khoai mì cho thấy nồng độ vi khuẩn

cao có thể làm gia tăng sự biểu hiện tạm thời gen gus nhưng lại không tương

quan với hiệu suất biến nạp Nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn nồng độ vi khuẩn tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đó làm giảm khả năng tái sinh của

mô Tuy nhiên, đối với các loại cây "cứng đầu" nồng độ vi khuẩn cao là cần thiết, sau khi ủ xong, người ta rửa lại nhẹ nhàng với môi trường vô trùng hay thêm vào môi trường các tác nhân sát khuẩn (Zhao và cộng sự, 2001; Zhang và cộng sự, 2003) [33], [35]

1.2.6.3 Làm khô mẫu cấy

Một nhân tố quan trọng khác ảnh hưởng lên biến nạp là tình trạng khô

của mẫu cấy trước hoặc ngay khi xâm nhiễm A tumefaciens Arencibia và cộng

sự (1998) cho rằng trải dịch huyền phù cây mía thành lớp mỏng và phơi 15 –

60 phút trước khi ủ với A tumefaciens làm tăng khả năng chuyển T-DNA và

hiệu quả biến nạp Tương tự, phơi mô sẹo từ dịch huyền phù cây lúa trong 10 –

15 phút làm tăng hiệu quả 10 lần so với đối chứng không phơi (Urushibara và cộng sự, 2001) Không rõ nhân tố nào bị tác động bởi việc làm khô mẫu, có thể

đó là sự co nguyên sinh và tình trạng tổn thương của mẫu giống như xử lý thẩm thấu [35]

1.2.6.4 Xử lý với chất chống hoại tử

Sử dụng các chất chống hoại tử như một phương pháp tiền xử lý được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc làm giảm sự oxy hóa của mẫu Trên cây mía, người ta xử lý mô phân sinh với môi trường chứa 15 g/l acid ascorbic, 40 mg/l cystein, 2 mg/l AgNO3 làm tăng hiệu quả biến nạp và mô sẹo mía chuyển gen chỉ thu được khi được xử lý với môi trường này Một quy trình tương tự cũng được áp dụng trên lúa (Enrique-Obregon và cộng sự, 1999)

Thêm cystein trong môi trường đồng nuôi cấy sẽ làm tăng sự biểu hiện gus và

hiệu suất biến nạp ổn định ở bắp Bổ sung các hợp chất thiol: L-cystein, dithiothreitol và sodium thiosulphat làm tăng 16,4% hiệu quả biến nạp ở đậu nành (Olhoft và cộng sự, 2003) Thêm AgNO3 vào môi trường đồng nuôi cấy ở bắp cũng có hiệu quả tương tự AgNO3 ức chế sự phát triển của A tumefaciens

mà không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển và sát nhập T-DNA, rất thuận lợi cho việc tái sinh mẫu sau này [35]

1.2.6.5 Nhiệt độ

Các nghiên cứu về A tumefaciens cho thấy rằng sự phát triển của khối u

đạt tối ưu trên cây khi nhiệt độ xung quanh vi khuẩn xâm nhiễm khoảng 22oC,

và không xuất hiện khi nhiệt độ trên 28oC Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hệ thống điều hòa 2 thành phần VirA-VirG (phức hợp điều khiển sự vận chuyển T-DNA) Ở nhiệt độ lớn hơn 32oC, gen vir sẽ không biểu hiện vì VirA bị đột

biến thành dạng mất hoạt tính Nhiệt độ 22oC được chứng minh là tối ưu cho sự chuyển T-DNA vào mô lá cây thuốc lá (Dillen và cộng sự, 1997), tuy nhiên trong một nghiên cứu khác trên cây thuốc lá, nhiệt độ đồng nuôi cấy 25oC lại cho số cây chuyển gen cao nhất Điều này cho thấy rằng, nhiệt độ tối ưu cho sự

chuyển gen phụ thuộc vào loài, loại mô và chủng A tumefaciens (Salas và cộng

sự, 2001) [13], [33]

1.2.6.6 Chất hoạt động bề mặt

Chất hoạt động bề mặt có tác dụng thúc đẩy sự vận chuyển T-DNA bằng

cách giúp A tumefaciens bám vào mô thực vật và giúp loại bỏ các cơ chất cản

trở lên quá trình bám đó Bổ sung chất hoạt động bề mặt như: Silwet L77 và acid pluronic F68 vào môi trường ủ làm gia tăng sự chuyển T-DNA ở phôi chưa chín của lúa mì (Cheng và cộng sự, 1997) Silwet L77 rất hữu dụng trong

chuyển gen cây Arabidopsis thaliana bằng phương pháp floral-dip (Ye và cộng

sự, 1999; Bechold và cộng sự, 2000; Desfeux và cộng sự, 2000) [33]

1.2.6.7 Môi trường ủ và đồng nuôi cấy

Thành phần môi trường, đường, chất điều hòa tăng trưởng thực vật và

các chất cảm ứng gen vir cũng là các nhân tố quan trọng tác động lên hiệu quả

biến nạp Môi trường N6 bổ sung 2,4-D và acid casamino phù hợp đồng nuôi cấy trên lúa (Chu và cộng sự, 1996), nhưng lại không có khả năng làm tái sinh cây chuyển gen ở bắp Thêm các hợp chất như AgNO3 (Zhao và cộng sự, 2001) hay CaCl2 vào môi trường ủ và đồng nuôi cấy cũng làm tăng hiệu quả biến nạp

Việc giảm nồng độ muối trong môi trường ủ và đồng nuôi cấy cũng đã được chứng minh là có lợi cho chuyển gen trên cây canola (Fry và cộng sự, 1987), lúa mì (Cheng và cộng sự, 1997; Khanna và cộng sự, 2003), bắp (Armstrong & Rout, 2001) Ở phôi chưa trưởng thành của cây lúa mạch, môi

trường MS chỉ chứa 1/10 nồng độ muối thì cho biểu hiện gus cao hơn 10 lần so

với môi trường MS đầy đủ (Ke và cộng sự, 2002)

Các hợp chất hóa học gây cảm ứng gen vir như acetosyringone được đề

nghị sử dụng trong hầu hết các quy trình chuyển gen thực vật Khi thiếu

acetosyringone, biểu hiện gus rất thấp và không thể tái sinh cây chuyển gen ở

lúa, hành tây và lúa mạch (Rashid và cộng sự, 1996; Hiei và cộng sự, 1997; Zheng và cộng sự, 2001; Kumlehn và cộng sự, 2006) Tuy nhiên, một số loại

mô mục tiêu ở cây một lá mầm không cần sự hỗ trợ của các chất cảm ứng gen

vir, ví dụ như: mô phân sinh mía (xử lý với chất chống hoại tử) (Enriquez &

Obregon, 1999), phôi và mô sẹo sinh phôi của lúa mì tiền nuôi cấy (xử lý làm

khô mẫu) (Cheng và cộng sự, 2003) [33], [54]

1.2.6.8 Kháng sinh

Loại bỏ A tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy là một giai đoạn quan

trọng của quá trình chuyển gen vì sự hiện diện của vi khuẩn thường ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tái sinh cây chuyển gen Để diệt vi khuẩn, nhiều loại kháng sinh đã được nghiên cứu sử dụng trong các quy trình chuyển nạp gen

bằng A tumefaciens, thông dụng nhất là cefotaxime, carbenicillin, vancomycin

và timentin (Nauerby và cộng sự, 1997)

Carbenicillin và cefotaxime có phổ hoạt tính rộng chống lại cả vi khuẩn gram âm và gram dương nhờ chức năng ngăn chặn quá trình sinh tổng hợp vách tế bào bằng cách gắn kết và gây bất hoạt enzyme transpeptidase (enzyme cần thiết cho quá trình liên kết chuỗi peptidoglycan trên vách tế bào) Cả hai loại kháng sinh này ít gây độc đối với tế bào eukaryote nên được xem là chất diệt khuẩn hữu hiệu trong chuyển gen thực vật Tuy nhiên, khi sử dụng ở nồng

độ cao 50 – 250 mg/l, cefotaxime và carbenicilin đều làm mô thực vật bị hoại

tử Việc sử dụng các loại kháng sinh mới để loại vi khuẩn và không gây độc mô cho thực vật, tăng cường hiệu quả biến nạp gen đang được quan tâm nghiên cứu (Mayolo và cộng sự, 2003, Ogawa và Mii, 2004, Ogawa và Mii, 2005)

Moxalactam, thuộc họ kháng sinh b-lactam cho thấy có hiệu quả trong việc loại vi khuẩn và tăng cường sự tạo phôi khi chuyển gen trên cây cacao cao hơn so với cefotaxime (Mayolo và cộng sự, 2003) Các nghiên cứu thử nghiệm tính nhạy cảm với 12 loại kháng sinh b-lactam của A tumefaciens LBA4404 và EHA101 cho thấy, chỉ có cefotaxime, cefbuperazon và meropenem có khả năng loại vi khuẩn tốt, trong đó meropenem có hoạt tính mạnh hơn (Ogawa và Mii, 2004) Nghiên cứu sàng lọc tiếp theo dựa trên mô hình biến nạp gen trên cây thuốc lá để khảo sát tính độc đối với tế bào thực vật của 12 kháng sinh b-lactam cho thấy, hai loại b-lactam là meropenem và moxalactam có khả năng diệt vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyển gen (Ogawa và Mii, 2005) Kết quả tương tự cũng được ghi nhận khi dùng meropenem để loại

A tumefaciens chủng LBA4404, EHA101 và GV3101 ra khỏi PLB lan Dendrobium phalaenopsis sau khi đồng nuôi cấy Meropenem hiệu quả hơn

trong việc diệt vi khuẩn và làm tăng trưởng PLB lan nhanh hơn khi so sánh với các kháng sinh khác như ampicilin, carbenicilin, cefotaxime và cefoperazon, với nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn thấp (< 5 mg/l) (Ying và cộng sự, 2006)

Meropenem và moxalactam cũng được dùng để so sánh với hai loại kháng sinh thường dùng là carbenicilin và cefotaxime trong biến nạp gen trên cây thuốc lá, cà chua và lúa Mặc dầu có sự khác nhau ở mỗi hệ thống biến nạp gen nhưng meropenem với nồng độ thấp khoảng (6,25 – 25 mg/l) có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy và qua đó làm gia tăng hiệu quả chuyển gen so với các kháng sinh cũ (Ogawa và Mii, 2007) Các kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên các đối tượng như lan Hồ Điệp

(Sjahril và Mii, 2006), Cymbidium, Vanda và Oncidium (Chin và cộng sự,

2007, Shrestha và cộng sự, 2007, Lee và cộng sự, 2007) [16], [28], [30], [31], [32], [43], [56]

1.2.6.9 Marker chọn lọc

Các marker chọn lọc được sử dụng rộng rãi trong chuyển gen ở thực vật

là gen mã hóa cho hygromycin phosphotransferase (htp), phosphinothricin acetyltransferase (pat hay bar), neomycin phosphotransferase (nptII) Một số

marker khác đang được nghiên cứu và áp dụng: phosphomannose isomerase, enolpyruvylshikimate-5-phosphatesynthases, glyphosate oxidareductase, CP4…Để gia tăng hiệu quả chọn lọc, người ta chèn các đoạn intron vào vùng

3-mã hóa của htp như là một chiến lược làm gia tăng sự biểu hiện của gen ở thực

vật một lá mầm Việc chèn này không chỉ làm gia tăng hiệu quả biến nạp (vì nó

nâng cao sự biểu hiện của htp), làm giảm số bản sao của gen chọn lọc, mà còn điều khiển sự phát triển của A tumefaciens trong quá trình biến nạp [33]

1.3 Một số phương pháp chuyển gen khác

1.3.1 Phương pháp bắn gen

Bắn gen là một phương pháp có vai trò quan trọng để thực hiện chuyển gen trên thực vật, nhất là cây một lá mầm và những cây khó hoặc không đáp

ứng lại với Agrobacterium Phương pháp này do giáo sư John Stanford, đại học

Cornell (Mỹ) phát minh đầu tiên vào năm 1987

Nguyên tắc chung của phương pháp bắn gen là sử dụng các vi đạn có kích thước hiển vi tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào Ngày nay bắn gen trở thành một kỹ thuật duy nhất đáng tin cậy để chuyển gen vào các bào quan như nhân, ty thể, lục lạp Ưu điểm của bắn gen so với các phương pháp khác là đơn giản và nhanh chóng, phù hợp cho các nghiên cứu biểu hiện gen Vùng mô đích để chuyển gen bằng phương pháp này cũng rất đa dạng và thành công trên nhiều đối tượng thực vật như phôi sinh dưỡng, phôi sinh dục còn non (đu đủ, đậu nành), phôi trong dịch treo tế bào (bông vải, thuốc lá, bắp, lúa miến), đỉnh sinh trưởng, lớp mỏng tế bào, mô sẹo (thuốc lá), phôi từ mô sẹo (gỗ vân sam Norway, bắp, đu đủ), lát cắt đỉnh sinh trưởng và lá (thuốc lá, đu đủ)…[35]

1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium-mediated

transformation)

Đây là phương pháp biến đổi dựa trên phương pháp chuyển gen gián

tiếp bằng vi khuẩn A tumefaciens Người ta xử lý mô cấy bằng sóng siêu âm trong một thời gian ngắn với sự hiện diện của A tumefaciens Sóng siêu âm sẽ tạo ra rất nhiều vết thương nhỏ và đồng đều trên mô cấy, cho phép A tumefaciens xâm nhiễm dễ dàng, và do đó làm tăng hiệu quả biến nạp Đây là

phương pháp khá hữu hiệu, đơn giản và rẻ tiền, làm gia tăng hiệu quả biến nạp gen gián tiếp đối với những cây có hiệu suất chuyển gen thấp [41]

Một số công trình chuyển gen sử dụng phương pháp SAAT đã được

công bố: Miller và cộng sự, 1974 (mô rễ cây Vicia faba); Joersbo và Brunstedt,

1990 (protoplast của Nicotiana tabacum và Beta vulgaris); Trick và Finer,

1997 (đậu nành, lúa mì, bắp); Ning Han và cộng sự, 2005 (mô sẹo Agrotis stolonifera var palustris…

1.3.3 Phương pháp lọc chân không

Phương pháp lọc chân không đã được áp dụng trên một số loại cây, đặc

biệt là cây một lá mầm Người ta đặt mô cấy và dịch vi khuẩn A tumefaciens

vào trong một môi trường chân không (nhờ máy hút) nhờ vậy vi khuẩn có thể bám chặt trên toàn bộ bề mặt mô mẫu, hiệu quả biến nạp vì thế cũng tăng lên

Phương pháp này đã được công bố trên cây Medicago truncatula (Trieu và

cộng sự, 2000) [41]

1.3.4 Phương pháp Floral-dip

Ở phương pháp này, cây chuyển gen được tạo ra bằng cách ngâm hoa

trực tiếp vào dịch vi khuẩn A tumefaciens Ưu điểm của phương pháp dip là không cần phải nuôi cấy in vitro, do đó có thể loại trừ nguy cơ biến dị

Floral-soma (Clough và cộng sự, 1998) Sau đó, phương pháp này còn thành công trên

cây Arabidopsis thaliana với mô mục tiêu là hạt và hạt phấn của hoa chưa

trưởng thành (Ye và cộng sự, 1999; Desfeux và cộng sự, 2000) [41]

1.3.5 Phương pháp Agrolistic

Agrolistic là sự kết hợp các tiện ích như: có hiệu quả cao trên rất nhiều

loài cây của phương pháp bắn gen và hệ thống chuyển gen chính xác của A tumefaciens nhờ T-DNA Phương pháp này sẽ khắc phục được giới hạn phạm

vi ký chủ của A tumefaciens đồng thời có thể kiểm soát số bản sao và vùng gen

được chèn vào tế bào thực vật, làm giảm đến mức tối thiểu các trình tự tương đồng có thể làm mất ổn định di truyền về sau Người ta thiết kế một cassette

biểu hiện trong thực vật cho gen virD1 và virD2 sau đó đồng bắn gen với một

vector chứa gen mục tiêu có hai lề là trình tự lề trái và lề phải của T-DNA Sản

phẩm của virD1 và virD2 có thể cắt hai lề của T-DNA trong tế bào thực vật, tạo

ra thể biến nạp có chèn vùng T-DNA chứa gen mục tiêu mong muốn [17], [41]

1.3.6 Vi tiêm DNA

Vi tiêm là phương pháp tiêm trực tiếp DNA vào nhân của tế bào phôi đơn Phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao

tác dưới kính hiển vi và sự khéo léo, chính xác để tiêm một lượng rất nhỏ dung dịch DNA Tế bào đơn được cố định dưới đáy ống thủy tinh bằng áp lực thấp

và DNA được tiêm vào nhân bằng micropipette thủy tinh mỏng Tế bào vi tiêm

sau đó sẽ được nuôi cấy in vitro để tái sinh thành cây (Neuhaus và cộng sự,

1987) [41]

1.3.7 Vi sợi "whiskers"

Phương pháp này liên quan đến việc sử dụng vi sợi "whiskers" (giống như cây kim rất nhỏ với 2 đầu nhọn) Mô cấy, dung dịch DNA gen mục tiêu và whiskers được huyền phù trong một cái ống, sau đó lắc mạnh Các whiskers sẽ đâm vào mô cây (nhưng không làm chết chúng), tạo điều kiện cho việc phóng thích gen mục tiêu vào nhân tế bào thực vật (Wang và cộng sự, 1995) [41]

1.3.8 Phương pháp PEG (Polyethylene glycol)

Trong phương pháp PEG, PEG đóng vai trò là nhân tố kích hoạt sự dung hợp tế bào trần với gen lạ (dưới dạng plasmid DNA) Phương pháp PEG cho hiệu suất biến nạp rất thấp (khoảng 1%) Tuy nhiên, do có thể thực hiện trên một số lượng tế bào cực lớn và nếu có hệ thống chọn lọc hiệu quả, người ta cũng thu được cây chuyển gen (Zhang và Wu, 1998) [2]

1.3.9 Phương pháp xung điện

Phương pháp xung điện được đánh giá là hiệu quả và ít gây hại cho tế bào trần hơn PEG Tế bào trần được trộn với dung dịch DNA và xử lý với xung điện ngắn để tạo ra các lỗ đàn hồi trên màng plasma, nhờ vậy DNA dễ dàng đi vào trong tế bào Một số công trình đã công bố: Akella & Lurquin, 1993 (Đậu

đũa); Songstad và cộng sự, 1993 (Zea mays); Xu & Li, 1994; Rao, 1995 (Oryza sativa); Dillen và cộng sự, 1995 (Phaseolus vulgaris) [2], [41]

1.4 Retrotransposon

1.4.1 Giới thiệu

Nhân tố chuyển vị (hay nhân tố di động – transposable element hay mobile element) là các trình tự DNA có khả năng “nhảy” vào vị trí mới bên trong genome Kể từ phát hiện lần đầu tiên của Barbara McClintock vào năm

1956 trên DNA cây bắp, nhân tố chuyển vị giờ đây đã được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật

Có hai nhóm nhân tố chuyển vị phổ biến, được định nghĩa dựa trên hình thức nhân lên của chúng: Retrotransposon (còn được gọi là nhân tố nhóm I), chuyển vị thông qua trung gian một RNA; và DNA transposon (nhân tố chuyển

vị nhóm II), di động bằng DNA [14]

Retrotransposon là nhóm nhân tố di động phổ biến nhất ở eukaryote, được mô tả đặc điểm lần đầu tiên ở genome động vật và nấm men, với đặc tính chung là sự nhân lên của chúng trong genome phụ thuộc vào quá trình phiên

mã ngược Các nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh sự hiện diện của chúng với số lượng bản sao lớn trong genome thực vật Mặc dù không phải là thành phần di truyền cố định trong genome, nhưng sự thay đổi lớn về số lượng bản sao cũng như hoạt động chuyển vị của retrotransposon có ý nghĩa quan trọng trong quá trình tiến hóa về cấu trúc của genome thực vật, đặc biệt là thực vật bậc cao [14], [46]

1.4.2 Cơ chế chuyển vị của retrotransposon

Hình 1.9 miêu tả cơ chế chuyển vị của DNA transposon và retrotransposon DNA transposon của eukaryote (hình 1.9 a) chuyển vị qua trung gian một DNA được cắt ra từ vị trí cho (donor site) Ở retrotransposon, đầu tiên DNA sẽ được phiên mã thành một phân tử RNA, phân tử RNA này sau

đó được phiên mã ngược thành cDNA mạch đôi (hình 1.9 b) Trong cả hai trường hợp, phân tử DNA sẽ được sát nhập vào vị trí mục tiêu trên DNA tế bào chủ để hoàn tất quá trình chuyển vị Điều này cho thấy DNA transposon di động bằng cơ chế cắt – dán (cut – and – paste), trong khi retrotransposon chuyển vị bằng cơ chế sao chép – dán (copy – and – paste) [24]

Hình 1 10: Sơ đồ cấu trúc các loại retrotransposon [7]

PR: protease, RT: reverse transcriptase, INT: intergrase, EN: endonuclease

1.4.3 Phân loại retrotransposon thực vật

Retrotransposon thực vật được phân chia thành hai phân nhóm dựa vào cấu trúc và chu trình chuyển vị (hình 1.9) [14], [15], [46]

a LTR retrotransposon (gồm 2 loại là Ty1-copia và Ty3-gypsy):

Phân nhóm retrotransposon có các đoạn LTR (long terminal repeats) và mã hóa các sản phẩm tương đồng về cấu trúc với retrovirus (ngoại trừ việc không

có gen mã hóa cho protein vỏ env) Chúng bao gồm gen gag (mã hóa cho một protein cấu trúc có hoạt tính gắn với nucleic acid), pol (mã hóa cho

Hình 1 9: Cơ chế chuyển vị của DNA transposon và retrotransposon [24]

polyprotein có hoạt tính protease), reverse transcriptase (enzyme phiên mã ngược), RNAseH và protein có vai trò sáp nhập (intergrase) Không có sự

khác biệt về cấu trúc giữa Ty1-copia và Ty3-gypsy LTR retrotransposon,

chúng chỉ có sự khác nhau về vị trí của các gen

b Non-LTR retrotransposon: Là retrotransposon không chứa các

trình tự LTR, gồm loại có chứa các nhân tố LINEs (long interspersed repetitive elements) và loại có chứa nhân tố SINEs (short interspersed repetitive elements)

- LINEs Non-LTR retrotransposon có hai đầu là các trình tự lặp lại ngắn và hai đoạn ORF dài ORF1 dài khoảng 1 kb, mã hóa cho protein gắn với RNA (RNA-binding protein) và ORF2 khoảng 4 kb

mã hóa cho protein có chức năng phiên mã ngược

- SINEs Non-LTR retrotransposon có chiều dài ngắn và không mã hóa cho bất kì protein nào, chỉ gồm 1 đầu 3’ giàu A/T Vì vậy, chúng cần enzyme bên ngoài cho sự chuyển vị của chúng

- Kết quả PCR sẽ được dòng hóa và giải trình tự

- Trình tự giả định của retrotransposon được đem so sánh với các LTR retrotransposon thực vật đã tìm thấy trước đây

1.4.4.2 Ứng dụng LTR retrotransposon

- Hệ thống các marker dựa vào retrotransposon: Sự phổ biến, phân

bố khắp nơi trên genome thực vật của retrotransposon đã đem đến một nền tảng quan trọng cho sự phát triển của hệ thống marker Cấu trúc và sự sao chép của chúng đem đến cho chúng ta một số các lợi ích:

+ Chúng có các trình tự dài và bảo tồn có thể sử dụng để dòng hóa các marker chuyên biệt và các trình tự flanking

+ Hoạt động chuyển vị của retrotransposon sẽ tạo các trình tự chèn mới vào genome dẫn đến sự đa hình Các trình tự này sau đó sẽ được phát hiện và được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài và nghiên cứu đa dạng di truyền

+ Hệ thống các marker dựa vào retrotransposon còn được sử dụng trong việc lập bản đồ liên kết di truyền [46]

- Vector chuyển gen trong thực vật dựa vào retrotransposon: Hệ

thống các vector retrotransposon đã được phát triển cho mục đích chuyển gen trên thực vật Một cassette gồm các thành phần của LTR retrotransposon được chèn thêm các gen kháng kháng sinh và được dòng hóa vào plasmid dùng cho biến nạp gen Một đặc điểm quan trọng của vector retrotransposon rất có ý nghĩa trong chuyển gen đó là cơ chế chuyển vị qua sao chép (copy – paste) đã

giúp cho trình tự được chèn một cách ổn định vào genome [18]

- Công cụ trong di truyền ngược: Tạo đột biến chèn là một trong

những công cụ đắc lực trong phân tích di truyền ngược ở thực vật Một trong những phương pháp đầu tiên là người ta chuyển các trình tự chèn nhờ T-DNA

của Agrobacteium, tuy nhiên T-DNA có nhiều hạn chế bởi sự sáp nhập một

cách ngẫu nhiên vào genome Sử dụng các retrotransposon sẽ tạo ra các quần thể đột biến đa dạng và ổn định bởi chúng có thể ảnh hưởng đến chức năng của

bất kì gen nào [46]

1.4.5 Retrotransposon Tnt1

Tnt1 (Transposable element of Nicotiana tabacum cell type 1) thuộc

nhóm nhân tố chuyển vị LTR – Ty1 copia, được tìm thấy ở cây thuốc lá và là

nhân tố chuyển vị đầu tiên được phát hiện ở loại cây này Chúng tồn tại với số lượng bản sao lớn (ít nhất 100 bản sao trên 1 bộ gen đơn bội) Retrotransposon

Tnt1 có 2 vùng LTR dài 610 bp và ORF 3,984 kb, kích thước của đoạn chèn vào genome thực vật là 5,3 kb Đột biến gắn chèn Tnt1 là ngẫu nhiên, không chuyên biệt vị trí, ổn định qua các thế hệ và có thể bị phân li di truyền, có khả

năng gây biến dị lớn bởi khả năng gắn chèn vào các vùng giàu gen Tất cả đặc

tính trên đã giúp Tnt1trở thành một công cụ hữu ích cho việc tạo đột biến chèn

ở nhiều loại cây khác nhau Tnt1 đã được nghiên cứu trên 1 số đối tượng như cây thuốc lá (Grandbastien và cộng sự, 1989), Medicago truncatula (Erfurth và cộng sự, 2003; Tadege và cộng sự, 2005), Lactuca sativa (Marianne Mazier và

cộng sự, 2007)…[19], [26], [29], [45]

1.5 Nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành trên thế giới

1.5.1 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp truyền thống [25]

Phương pháp truyền thống thông qua sử dụng các phép lai và chọn lọc nhân tạo để tạo ra các giống mới đã được thực hiện hàng thập kỷ qua (Liu, 1999) Mục tiêu của nhân giống truyền thống cây đậu nành là phát triển và bảo tồn các giống có năng suất cao, chịu các stress sinh học và phi sinh học, có thành phần dinh dưỡng cao Các nhà chọn giống sử dụng các phép lai giữa các

cá thể cha mẹ để tạo ra các quần thể con lai Cây cha mẹ được chọn lựa dựa trên các tiêu chí: tính trạng mong muốn, tính đa dạng về di truyền, khả năng phối hợp…Thông thường, các cây cha mẹ xuất sắc có khoảng cách di truyền xa được ưu tiên chọn lựa để tạo ra các con lai ưu thế (Burton, 1997)

Ngoài ra, để tạo các biến dị mới, người ta còn sử dụng các phương pháp gây đột biến trên genome như dùng: EMS (ethylmethane sulfonate), tia X…Rahmam và cộng sự (1994) đã thu nhận được một dòng đậu nành đột biến cho hàm lượng oleic acid cao bằng tác động tia X Các hóa chất đột biến cũng được áp dụng thành công khi tạo ra thể đột biến có hàm lượng linolenic acid giảm (Hammond và Fehr, 1983; Bubeck và cộng sự, 1989; Rennie và Tanner, 1991; Ferhr và cộng sự, 1992)

Chọn lọc các tính trạng về số lượng bằng phương pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn do các tính trạng này được quy định bởi nhiều gen và chịu ảnh hưởng của môi trường, tương tác gen x gen, tương tác gen x môi trường Để vượt qua vấn đề trên, kỹ thuật chọn lọc nhờ sự giúp đỡ của các marker phân tử (MAS – marker-assisted selection) (Sax, 1923) và kết hợp giữa marker và QTL (quantitative trait loci) được ứng dụng Bên cạnh đó, việc đưa các kỹ thuật sinh học phân tử như RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD

(random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism), SSR (simple sequence repeats) và SNP (Single Nucleotide Polymorphism) vào áp dụng đã giúp các nhà chọn giống xây dựng các bản đồ

di truyền phân tử với mật độ marker trên nhiễm sắc thể cao Quần thể đậu nành

đã được xây dựng bản đồ di truyền gồm 184 marker, hơn 319 QTL cho các tính trạng về nông học và kháng bệnh

Tuy nhiên, phương pháp truyền thống có những giới hạn như: (1) các trở ngại do sự liên kết (các gen không mong muốn thường được chuyển cùng với các gen mục tiêu trong một phép lai); (2) khả năng phối hợp thấp; (3) các biến

dị di truyền bị giới hạn Với sự gia tăng dân số đồng thời với sự gia tăng về nhu cầu đậu nành, việc phát triển và ứng dụng các kỹ thuật mới là một nhu cầu thiết yếu Phương pháp chuyển gen có tiềm năng biến nạp gen mong muốn vào cây đậu nành với một số ưu điểm sau: (1) vượt qua sự cản trở về khả năng phối hợp; (2) chỉ chuyển gen mục tiêu vào cây mà không có bất cứ rào cản nào về liên kết; (3) tạo ra nhiều biến dị di truyền mới

1.5.2 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp chuyển gen

Kể từ khi nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành đầu tiên được công

bố vào năm 1988 (Hinchee và cộng sự, 1988; McCabe và cộng sự, 1988), đậu nành biến đổi gen đã được nghiên cứu phát triển và nhân giống rộng rãi bởi các nhà sản xuất của Mỹ, Argentina, Canada, Brazil…Đậu nành kháng thuốc diệt

cỏ “Roundup – ready” là sản phẩm độc quyền của công ty Monsanto bắt đầu từ những năm 1990 Ngày nay, họ cung cấp giống cho hơn một nửa diện tích trồng đậu nành tại Mỹ Brazil là nước sản xuất đậu nành lớn thứ hai sau Mỹ, đang trong quá trình tranh luận để công nhận về mặt luật pháp đối với cây trồng biến đổi gen (bao gồm đậu nành), tuy nhiên một số báo cáo cho rằng hơn một nửa lượng đậu nành trồng tại miền bắc Brazil đã là các giống được biến đổi gen [12]

Genome của đậu nành cũng đã được giải trình tự trong thời gian gần đây bởi các nhà nghiên cứu của viện Energy – Joint Genome (DOE - JGI) mở ra nhiều cơ hội mới cho công tác nhân giống và chuyển gen đậu nành Có khoảng

60.000 gen được phân tích trong đó 5.671 là các nhân tố phiên mã sẽ quyết định kiểu hình bao gồm kháng hạn, kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao…[55]

Các tính trạng đã và đang quan tâm được nghiên cứu bao gồm [25], [65]

- Kháng tuyến trùng: Hơn 100 loài tuyến trùng có thể xâm nhiễm vào

cây đậu nành, gây hư hại rễ, làm cây héo và do đó làm năng suất giảm Khi xâm nhiễm vào rễ, tuyến trùng tiết một số các hợp chất làm cho một số tế bào của rễ hình thành nên một cấu trúc đặc biệt gọi là hỗn bào SCN Gen kháng SCN tự nhiên đã được định vị và dòng hóa để chuyển vào cây đậu nành Ngoài

ra, người ta còn tạo ra các cây kháng tuyến trùng bằng cách chuyển vào cây gen

mã hóa cho các peptide ức chế tuyến trùng,ví dụ như Oc-I∆D86 hay CpT1

- Kháng nấm: Có hơn 40 loài nấm gây bệnh đã được xác định là có hại

lên sự phát triển của thực vật, trong đó có các loài xâm nhiễm trên cây đậu

nành mà nghiêm trọng nhất là Phytophthora (gây thối rễ) Các gen kháng với Phytophthora tự nhiên (Rps) cũng đã được nhận diện, phân lập và chuyển vào cây đậu nành (Gao và cộng sự, 2005) Ngoài ra Sclerotina sclerotiorum (một loại mốc trắng) cũng là một tác nhân gây quan trọng trên đậu nành Gen OXO

đã được nghiên cứu biến nạp vào đậu nành để giúp cây kháng với mốc trắng

- Kháng virus: Có khoảng hơn 100 loại virus gây hại trên thực vật,

trong đó virus khảm BPMV và SbDV là hai loại virus quan trọng nhất tác động lên đậu nành (Conner và cộng sự, 2004) Phương pháp biến nạp làm im lặng gen sau phiên mã thông qua RNA đã được sử dụng để tạo ra các cây chuyển gen kháng virus, bằng cách chuyển một cassette gồm mạch sense và mạch antisense của gen mã hóa cho protein vỏ virus (CP – coat protein) vào cây

- Kháng côn trùng: Có rất nhiều loài côn trùng tấn công vào cây đậu

nành (Kogan và Turnipseed, 1987) Bt (phân lập từ Bacillus thuringiensis)

được xem là chiến lược hiệu quả nhất cho việc tạo cây đậu nành chuyển gen

kháng côn trùng Hơn 50 gen độc Bt đã được dòng hóa cho mục đích này (Zhu

và cộng sự, 1999) Bên cạnh gen Bt, protein TcdA (được phân lập từ

Photorhabdus luminescens) cũng được chứng minh là có tiềm năng ứng dụng

trong thực vật chuyển gen kháng côn trùng (Liu và cộng sự, 2003)

- Kháng thuốc diệt cỏ: Ngày nay, kháng thuốc diệt cỏ là tính trạng phổ

biến nhất của cây chuyển gen Hơn 85% đậu nành ở Mỹ và 56% đậu nành trên thế giới là đậu nành kháng thuốc diệt cỏ Các gen mã hóa cho tính trạng kháng

các thành phần trong thuốc diệt cỏ đã được ứng dụng gồm: ALS (acetolactate synthase), aroA (phân lập từ Agrobacterium dòng CP4), GAT (phân lập từ Bacillus lichenformis), PAT (phân lập từ Streptomyces viridochromogenes), BAR (phân lập từ Streptomyces hygroscopicus)

- Kháng các stress phi sinh học: Tạo ra cây chuyển gen kháng với các

stress phi sinh học là một thách thức lớn với công nghệ sinh học thực vật Các stress này bao gồm: hạn hán, lạnh, tính mặn, nhiệt và kim loại nặng Một số

gen tiềm năng cho kháng stress phi sinh học trên cây đậu nành là: CAX1 (mã

hóa cho protein của kênh vận chuyển cation/proton trên màng tế bào, ứng dụng

trong việc tạo cây chuyển gen kháng mặn), P5CR (mã hóa cho một enzyme

chìa khóa trong con đường tổng hợp proline, tích lũy proline có thể dẫn đến sự hình thành tính kháng hạn và kháng nhiệt độ cao)…

- Thay đổi thành phần dầu: Dầu đậu nành cũng tương tự như các loại

dầu thực vật khác, chứa 5 loại acid béo thường gặp là: palmitic acid (16:0,

~11%), stearic acid (18:0, ~4%), oleic acid (18:1, ~22%), linoleic acid (18:2,

~53%) và linolenic acid (18:3, ~8%) (Parrott và Clemente, 2004) Mục tiêu chiến lược để làm gia tăng chất lượng dầu đậu nành là giảm hàm lượng acid béo bão hòa và acid béo chưa bão hòa đa (polyunsaturated), đồng thời tăng hàm lượng các acid béo bão hòa đơn (monounsaturated) Ngoài lợi ích cho sức khỏe con người, việc tạo đậu nành chuyển gen có hàm lượng oleic acid cao (80%) và hàm lượng acid béo bão hòa cũng như acid béo bão hòa đa thấp (lần lượt là 6%

và 5%) bằng cách khóa sự biểu hiện của gen FAD2 đem lại tiềm năng ứng dụng

làm dầu sinh học (biodiesel hay biofuel) Các công trình nghiên cứu về thay đổi thành phần dầu cây đậu nành được liệt kê trong bảng 1.1

- Thay đổi hàm lượng protein: Đậu nành là một trong những thực

phẩm giàu protein nhất (40% trọng lượng là protein) bao gồm chủ yếu là 2S, 7S

và 11S globulin (còn được gọi là conglycinin và glycinin) Gen mã hóa cho conglycinin và glycinin đã được phân lập và dòng hóa vào một vector biểu hiện antisense vào năm 2002 (Kinney và Fader) Việc biến nạp cấu trúc này sẽ tạo ra các cây đậu nành không có protein 7S hoặc 11S

- Thay đổi thành phần amino acid: Động vật hữu nhũ hấp thu các

amino acid từ thực phẩm, một trong số các amino acid quan trọng là lysine Để

bổ sung lysine vào hạt đậu nành, người ta tạo cây chuyển gen với 2 gen mã hóa cho enzyme liên quan đến con đường sinh tổng hợp lysine là AK và DHDPS

Sự biểu hiện của DHDPS và AK đã làm tăng lượng lysine lên 100 lần (Falco và cộng sự, 1995) Ngoài ra còn có các gen mục tiêu khác để làm gia tăng giá trị dinh dưỡng cho hạt đậu nành như gen mã hóa cho methionine và cysteine

- Bổ sung vitamin E: Vitamin E là một nhóm các hợp chất gồm có 8

dạng: α-, β-, γ- và tocopherol và 4 dẫn xuất chưa bão hòa α-, β-, γ- và tocotrienol Hạt đậu nành tổng hợp tocopherol với tỉ lệ: γ-tocopherol 60 – 65%

δ-và δ-tocopherol 20 – 26%, tuy nhiên các tocopherol này có hoạt tính thấp Việc chuyển gen HGGT làm tăng tích lũy vitamin E tổng lên 10 – 15 lần Gen At- VTE3 từ Arabidopsis đã được dòng hóa và chuyển vào đậu nành cho kết quả tăng tích lũy α-tocopherol lên 95%

Bảng 1 1: Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen đậu nành công bố trong và ngoài

nước [22], [23], [25], [27], [37], [47], [48], [49], [53], [58]

Tính trạng Gen chuyển Nguồn gen Phương pháp Tác giả

Tuyến trùng OcI_D86 O sativa Agrobacterium Urwin, 1998

Tuyến trùng MSP dsRNA H glycines Bắn gen Trick, 2004

Tuyến trùng pat-10 dsRNA H glycines Agrobacterium Ren, 2005

Tuyến trùng 16D10 M incognita Floral dip Hussey và Huang, 2006

Tính trạng Gen chuyển Nguồn gen Phương pháp Tác giả

Sclerotinia gf-2.8 T aestivum Agrobacterium Donaldson, 2001

Phytophthora Rps1-k G max Agrobacterium Gao, 2005

Côn trùng cry1Ab B thuringiensis Bắn gen Parrott, 1994