một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhuộm giemsa phát hiện helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin

Những kẻ đồng hành gây bệnh tật cho con người này đã náu mình rất lâu cho tới khi người thầy thuốc trẻ Barry Marshall phát hiện ra vai trò gây bệnh của chúng vào 1983 đồng thời cũng là n

DƯƠNG TUẤN CƯỜNG

Một số yếu tố ảnh hởng đến kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện Helicobacter pylori

trên mảnh cắt paraffin

KHểA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

Khúa 2009 – 2013

Hà Nội – 2013

DƯƠNG TUẤN CƯỜNG

Một số yếu tố ảnh hởng đến kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện Helicobacter pylori

Trường Đại học Y Hà Nội, bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em học tập, rèn luyện nâng cao kiến thức

kĩ năng, tu dưỡng tại trường

Em xin chân thành cảm ơn gv Nguyễn Thu Hương- người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp đỡ, đóng góp và chỉ dạy tận tình trong quá trình hoàn thành khóa luận này

Em xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị trong Bộ môn Giải phẫu bệnh đã giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Và em cũng xin cảm ơn công lao to lớn của to lớn của các thầy cô giáo trường Đại Học Y Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo, rèn luyện giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tại trường

Xin cảm ơn những người bạn đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cha mẹ, những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ con về cả vật chất và tinh thần, là nguồn động lực lớn lao để con phấn đấu vươn lên

Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Tôi xin cam đoan nghiên cứu này là của riêng tôi, những số liệu thu thập được trong nghiên cứu là có thật, được thu thập tại bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội.

Tôi xin chịu mọi trách nhiệm liên quan về những thông tin tôi đưa ra

Hà Nội,2013Sinh viên

Dương Tuấn Cường

Chương 1 International Agency for Research on Cancer 7

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

Chương 2 20

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

Chương 3 24

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

Chương 4 36

BÀN LUẬN 36

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

T

Chữ viết tắt Viết đầy đủ

Agency for Research on Cancer

13 INN International Nonproprietary Name

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) tuy mới được phát hiện bởi bác sĩ

Marshall và Warren (hai người nhận giải thưởng Nobel 2005) nhưng lại được

y học thế giới rất quan tâm vì nó được coi là thủ phạm chính gây ra các bệnh viêm loét dạ dày (khoảng 80% các trường hợp), viêm loét tá tràng (hơn 90% các trường hợp), là tác nhân số 1 gây ung thư dạ dày theo phân loại của Cơ quan nghiên cứu ung thư thế giới (IARC) Một số nghiên cứu mới đây cho rằng HP đã trú ẩn trong dạ dày người khoảng 58.000 năm trước, tại vùng Đông Phi, nơi được coi là cái nôi của con người hiện đại và từ đó tỏa đi khắp nơi trên trái đất Những kẻ đồng hành gây bệnh tật cho con người này đã náu mình rất lâu cho tới khi người thầy thuốc trẻ Barry Marshall phát hiện ra vai trò gây bệnh của chúng vào 1983 đồng thời cũng là người quan sát được loại

vi khuẩn này trên các mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày Lúc đầu loại vi khuẩn

này có tên Campylobacter pylori, đến năm 1989, do phát hiện thêm một số tính chất hóa học, vi khuẩn Campylobacter pylori được đổi tên thành

Helicobacter pylori

Nhiễm vi khuẩn HP rất phổ biến trên thế giới nhưng có sự khác nhau giữa các quốc gia và giữa các vùng, miền trong cùng một quốc gia, tỷ lệ nhiễm cao hơn ở những nước có điều kiện kinh tế thấp kém Nhiễm HP thường xuất hiện rất sớm ở trẻ em từ 2-3 tuổi và tăng dần khoảng 1% mỗi năm và có thể tới 50% số trẻ em nhiễm HP ở một số nước đang phát triển Ở Việt Nam, tỉ lệ nhiễm HP là hơn 60% [1] Ở dạ dày, HP thường cư trú ở khe giữa các tế bào biểu mô của niêm mạc dạ dày ở phần sâu nhất của lớp chất nhầy, ngoài ra, HP còn cư trú ở niêm mạc tá tràng, niêm mạc thực quản khi có

dị sản dạ dày

Do vai trò đặc biệt quan trọng của HP với các bệnh lý dạ dày, tá tràng nên từ lâu người ta đã tìm cách để phát hiện chúng Các phương pháp phát hiện HP có thể chia thành hai nhóm chính: Phát hiện HP không xâm phạm (Non Invasive Methods) và phát hiện HP có xâm phạm Trong các phương pháp phát hiện không xâm phạm bao gồm: Miễn dịch học, test thở urease, xét nghiệm phân (bao gồm cấy phân, tìm kháng nguyên HP trong phân hoặc phản ứng PCR của HP ở trong phân) Phương pháp phát hiện HP có xâm phạm, bao gồm: Mẫu thử urease, nuôi cấy và phương pháp khuyếch đại gen (đều sử dụng bệnh phẩm là niêm mạc dạ dày qua sinh thiết) và chẩn đoán mô bệnh học (MBH) trên các mảnh sinh thiết nội soi Trong những phương pháp trên, chẩn đoán phát hiện HP bằng MBH trên rên các mảnh sinh thiết nội soi là phương pháp được sử dụng nhiều nhất vì bên cạnh việc xác định sự hiện diện của HP, người ta còn chẩn đoán luôn được tình trạng bệnh lý của dạ dày- tá tràng (một mũi tên trúng hai mục tiêu) Để phát hiện HP trên các mảnh cắt niêm mạc dạ dày- tá tràng, nhiều phương pháp đã được sử dụng như nhuộm H&E, Diff Quick, hóa mô miễn dịch, Giemsa… nhằm tìm ra một phương pháp đáp ứng được các yêu cầu về độ nhậy cao, độ chính xác cao song lại đáp ứng được tiêu chí đơn giản, rẻ tiền, nhanh chóng, dễ áp dụng, có thể sử dụng trong nghiên cứu hồi cứu và phương pháp nhuộm Giemsa đã được lựa chọn không chỉ ở Việt nam mà còn ở hầu khắp các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh trên thế giới.

Xuất phát từ thực tiễn chẩn đoán HP của phương pháp nhuộm Giemsa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm các mục tiêu:

1 Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa tìm

Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin.

2 Trình bày quy trình nhuộm Giemsa trên mảnh cắt mô tìm

Helicobacter pylori đạt yêu cầu.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cấu trúc mô học niêm mạc dạ dày:

Niêm mạc dạ dày gồm 3 lớp: Lớp biểu mô, mô đệm và cơ niêm

 Tầng niêm mạc dạ dày là tầng mô trong cùng của dạ dày Mặt trong của dạ dày có các rãnh nhỏ chia niêm mạc thành các tiểu thùy Tầng niêm mạc còn bao gồm nhiều tuyến tiêu hóa, chia dạ dày thành 3 vùng đặc trưng là vùng tâm vị, vùng môn vị và vùng đáy vị[2]

 Cấu tạo vi thể của tầng niêm mạc gồm các lớp sau[2]:

•Lớp biểu mô: là lớp niêm mạc thuộc loại biểu mô trụ đơn, do một loại

tế bào lợp thành Những tế bào này có khả năng tiết chất nhầy, tạo thành lớp chất nhầy bảo vệ bề mặt biểu mô chống lại sự tác động của HCl có mặt thường xuyên trong dịch dạ dày Lớp chất nhày bảo vệ niêm mạc bằng cách liên kết và dính chắc vào niêm mạc dạ dày, hấp thụ một số chất và làm môi trường đệm Khi tiết nhầy giảm, niêm mạc dễ bị tổn thương, ăn mòn và phá hủy dẫn tới viêm hoặc loét dạ dày

•Lớp đệm: là lớp mô liên kết có chứa một số lượng lớn các tuyến Trong lớp đệm, các mô liên kết thành các dải mỏng xen kẽ giữa các tuyến Các tuyến trong lớp đệm là tuyến dạng ống Các tuyến này tiết dịch vị Thành phần của dịch vị gồm có acid, các yếu tố nội môi và quan trọng là các men tiêu hóa có vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa thức ăn Dạ dày có khoảng

15 triệu tuyến và 3.5 triệu rãnh ở những vùng khác nhau

•Lớp cơ niêm: là ranh giới ngăn cách giữa tầng niêm mạc với tầng dưới niêm mạc Lớp trong gồm những sợi cơ hướng vòng, lớp ngoài là các sợi

cớ hướng dọc

1.2 Dịch tễ học tình trạng nhiễm khuẩn Helicobacter pylori

Nhiễm HP là một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất

ở người Tần suất nhiễm HP thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh tế- xã hội

và chủng tộc Người ta ước tính có hơn 50% dân số thế giới đã bị nhiễm HP, chủ yếu ở các nước đang phát triển với tần số nhiễm rất cao từ 50 -90% ở lứa tuổi lớn hơn 20 và hầu hết trẻ em bị nhiễm ở độ tuổi từ 2 – 8 Đường lây truyền chủ yếu của HP là đường ăn uống hoặc lây trực tiếp qua nước bọt Việt Nam do điều kiện vệ sinh kém, nguồn nước và thức ăn không đảm bảo, tỉ

lệ nhiễm HP cao vào khoảng hơn 70% ở người lớn[3][9]

1.3 Helicobacter pylori và vai trò của Helicobacter pylori trong

viêm dạ dày- tá tràng.

1.3.1 Đặc điểm Helicobacter pylori

1.3.1.1 Lịch sử phát hiện Helicobacter pylori

Ngay từ những năm đầu của thế kỷ XX, thỉnh thoảng đã có những ghi nhận về sự hiện diện của một loài vi khuẩn hình xoắn thường gặp trong bệnh viêm loét dạ dày mạn tính, nhưng mãi đến năm 1982 vi khuẩn này mới được Marshall và Warren phân lập thành công lần đầu tiên tại Labo vi sinh bệnh viện Perth Royal, Autralia[1]

Năm 1983, Marshall và Warren đã đặt tên cho vi khuẩn là Campylobacter pylodis Nhưng sau đó qua quá trình nghiên cứu cấu trúc tế bào vi khuẩn, năm 1989 Goodwill đã đổi tên vi khuẩn thành HP và được dùng cho đến ngày nay Việc phát hiện HP ở các bệnh nhân loét dạ dày, tá tràng có

ý nghĩa rất quan trọng đối với việc điều trị bệnh và chống loét tái phát[1]

Từ đó đã mở ra những thay đổi về quan niệm bệnh sinh và cách điều trị loét dạ dày tá tràng Nhờ công phát hiện ra HP , hai nhà khoa học người Úc này đã được trao giải thưởng Nobel Y học vào năm 2005

1.3.1.2Hình thể vi khuẩn:

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn HP

HP là một vi khuẩn hình xoắn, hơi cong, Gram (-), kích thước dài khoảng 1,5 – 5 µm và rộng khoảng 0,3 – 1 µm Ngoài ra chúng còn có dạng hình chữ S, dấu phẩy hay hình cung[2]

HP là loại vi hiếu khí, chúng thường cư trú trong lớp màng nhầy của niêm mạc dạ dày, ngày sát cực tự do của tế bào tuyến, trong các khoảng kẽ giữa các tế bào tuyến; phân bố ở hang vị nhiều hơn các vùng khác

1.3.1.3Nuôi cấy:

HP là một vi khuẩn khó nuôi cấy, chúng đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng và khí trường vi hiếu khí Ở người, HP có mặt ở niêm mạc dạ dày trong lớp chất nhầy, đặc biệt là ở vùng hang vị[2]

1.3.2 Đặc điểm sinh vật hóa học và cơ chế bệnh sinh của

Helicobacter pylori

1.3.2.1 Đặc điểm sinh vật hóa học

Một đặc tính quan trọng về phương diện sinh học, làm cơ sở để HP gây tác hại lên niêm mạc dạ dày tá tràng là chúng có khả năng sản xuất 2 nhóm men:

+ Urease có tác dụng thủy phân Urea của dịch vị thành Amoniac (NH3)

và Cacbonic (CO2), do đó nâng pH của môi trường lên và tạo điều kiện an toàn cho HP vượt qua hàng rào acid và xâm nhập vào biểu mô Amoniac cũng nâng pH của lớp nhầy dạ dày lên khoảng 6-7 và gây viêm

+ Các men khác (Catalase, Lipase, Proteolyse) và đặc biệt một protein độc gọi là “độc tố tế bào gây hốc” (Vacuolating cytotoxin – viết tắt là Vac) có tác dụng gây nên các hốc nhỏ (Vacuole) trong các tế bào biểu mô Gene liên quan với chất protein độc này được gọi là: Vac A Vac A có trong tất cả các

HP nhưng chỉ có 65% sản sinh ra độc tố Vac[1][2]

Ngoài hai nhóm men trên, HP có phản ứng Nitrat (-) và Hippurat (-)

1.3.2.2Cơ chế bệnh sinh Helicobacter pylori

Hiện nay, HP có thể được coi là tác nhân gây viêm dạ dày, loét dạ dày, loét hoành tá tràng và các ung thư dạ dày (Riêng trong rối loạn dạ dày không loét (Non ulcer dypepsia) vai trò của HP chưa rõ ràng)

Do đặc điểm sinh học cư trú ở vùng hang vị dạ dày, HP làm tổn thương bề mặt niêm mạc vùng hang vị, kích thích tế bào D liên tục phóng thích gastrin vào máu, do đó làm kích thích tế bào viền tiết ra acid làm cho pH giảm đáng kể Sự suy yếu này là do tác động trực tiếp từ các độc tố của HP cùng với tác động của sự đáp ứng miễn dịch Phản ứng gây độc niêm mạc dẫn đến loạn sản, chất tiêu biểu là amoniac và các enzym, làm giảm chất nhầy dẫn đến gây loét và viêm dạng nốt hoặc dạng đậu (Varioliform)[1]

1.4 Các phương pháp phát hiện Helicobacter pylori

Kể từ khi tìm ra sự có mặt của HP vào năm 1982, nhiều phương pháp chẩn đoán đã được sử dụng Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau tùy vào mục đích nghiên cứu và ứng dụng Nhưng quan trọng nhất để đánh

giá được một phương pháp là phải có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để có kết quả chẩn đoán trước điều trị cũng như theo dõi kết quả sau điều trị đạt được hiệu quả tốt nhất[1][6].

Các phương pháp chẩn đoán HP sắp xếp thành 2 nhóm:

 Nhóm phương pháp không xâm hại - không qua nội soi (non –

Invasive method): thử nghiệm huyết thanh, nước bọt hoặc dựa vào thành phần khí thở Nghiệm pháp thở 13C hoặc 14C

 Nhóm phương pháp có xâm hại - qua nội soi (Invasive method): Làm

sinh thiết để thử nghiệm mô học, nuôi cấy vi khuẩn hoặc làm thử nghiệm nhanh: Urease (CLO test (Campylobacter like organism)), PCR- phản ứng chuỗi Polymerase

1.4.1 Test không xâm nhập (Non – Invasive Test)

 Test thở (Urea breath test – UBT)

Thử nghiệm này dựa và hoạt tính urease của HP có khả năng ly giải ure thành amoniac và Cacbonic Nếu bệnh nhân uống urea13C  13CO2 được thải ra trong hơi thở Các mẫu hơi thở được lấy trước và sau khi uống urea13,

số lượng 13C được đo bằng sắc ký khí – khối phổ (Gas Chromato Graphy – Mass Spectrometry) Thử nghiệm này được đề nghị năm 1994 để theo dõi sự loại bỏ HP sau điều trị Độ nhạy của phương pháp là 95% (Test này sử dụng ít nhất 1 tháng sau khi chấm dứt điều trị) Độ đặc hiệu: 98% (vi khuẩn ở miệng

có thể sản xuất urease tạo hoạt tính giả) Nhưng thử nghiệm này đòi hỏi dụng

cụ phức tạp, đắt tiền và chỉ giới hạn ở một số labo đặc biệt[1][6]

 Huyết thanh học

Nhiễm trùng mãn tính với HP kích thích đáp ứng miễn dịch tại chỗ và toàn thân, sản xuất IgG và IgM (tuy nhiên thử nghiệm IgM không có giá trị

cao) Ở người bị nhiễm HP có khoảng 95% sản xuất IgG và 70% sản xuất IgA IgG xuất hiện khoảng 22-23 ngày sau lần nhiễm đầu Độ nhạy của phương pháp là >95% IgA có giá trị cao trong chẩn đoán nhiễm trùng HP, nhất là IgA tiết IgA tiết là một thành phần chính của miễn dịch tại chỗ tại niêm mạc và lớp nhầy IgA tiết xuất hiện sớm trong những ngày đầu khi mới nhiễm vi khuẩn IgA tiết được sản xuất bởi tế bào niêm mạc dạ dày khi dạ dày bị viêm do nhiễm khuẩn Cũng như IgG, hiệu giá IgA giảm dần khi yếu tố nhiễm trùng trên bệnh nhân bị loại trừ Tuy nhiên hiệu giá IgA giảm từ từ, vì vậy chỉ có thể đánh giá được hiệu quả loại bỏ HP ít nhất là 6 tháng sau điều trị.

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, sau điều trị thành công thì kháng thể vẫn tồn tại từ 6 tháng đến hơn 1 năm Vì vậy chẩn đoán huyết thanh học vẫn cho kết quả dương tính Vì vậy, các nhà khoa học khuyến cáo không nên dùng chẩn đoán huyết thanh để làm phương tiện xác định kết quả tiệt trừ HP Chẩn đoán huyết thanh nên được sử dụng cùng với các chẩn đoán khác để tránh âm tính giả

1.4.2 Test có xâm nhập (invasive)

• Đòi hỏi phải có sử dụng nội soi

- Hiện nay, việc sử dụng nuôi cấy trong chẩn đoán và điều trị không thật

sự cần thiết

 Thử nghiệm nhanh Urease hay CLO test:

- Nguyên tắc: HP gần như là loại vi khuẩn duy nhất tiết men urease với

khối lượng lớn ở dạ dày Thử nghiệm này nhằm phát hiện men Urease của HP

- Tiến hành: mẫu sinh thiết được vùi vào mẫu thử gồm: agar gel có

chứa ure, chất chỉ thị đỏ phenol, chất kìm hãm vi khuẩn

- Thử nghiệm nhanh urease dễ thực hiện nhưng phải qua nội soi Tuy nhiên, có thể xảy ra hiện tượng âm tính hay dương tính giả khi mật độ

vi khuẩn thấp hay biến chứng chảy máu dạ dày

 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)

Đây là phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử

- PCR cho phép khuếch đại chọn lọc một mẫu Polymerase đích thành một lượng lớn bản sao để có thể dễ dàng xác định và phát hiện được

HP được xác định bằng cách khuếch đại những chuỗi gen quan trọng đặc trưng Đây là kĩ thuật mới mang đến một bước ngoặt lớn trong lĩnh vực chẩn đoán

- Tuy nhiên kỹ thuật này cần dụng cụ đặc biệt, đắt tiền và không phải phòng xét nghiệm nào cũng thực hiện được PCR không dùng được để theo dõi việc loại bỏ vi khuẩn sau điều trị

 Mô bệnh học:

- Mô bệnh học được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán HP với các phương pháp chủ yếu là: nhuộm Hematoxylin và Eosin(HE), Giemsa, Diff Quick, hóa mô miễn dịch…

- Tiến hành: Lấy các mảnh sinh thiết ở phần hang và thân vị dạ dày, đem nhuộm Hematoxylin- Eosin hay Giemsa, sẽ thấy được hình dạng đặc biệt của vi khuẩn

- Độ đặc hiệu: 90-100% Độ nhạy: 80-95% tùy thuộc kinh nghiệm của người giải phẫu bệnh lý

- Chẩn đoán mô bệnh học có ý nghĩa quan trọng không chỉ nhằm xác định sự hiện diện của HP mà còn để đánh giá những thương tổn kèm theo ở niêm mạc dạ dày như viêm cấp, viêm mãn, viêm teo

- Việc sử dụng phương pháp mô bệnh học để kiểm trả trước và sau điều trị là cần thiết để đánh giá hiệu quả điều trị

Hiện này ở nước ta, việc phát hiện HP bằng phương pháp mô bệnh học được sử dụng phổ biến vì độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Bảng 1.1.Độ nhạy của các thử nghiệm đánh giá tiệt trừ H.pylori (%)[1] Tác giả Số bệnh nhân Nghiệm pháp thở 13 C

Mô bệnh học

Một số phương pháp mô bệnh học phổ biến:

• Nhuộm HE: là một phương pháp nhuộm phức tạp bao gồm 2 quá trình:

nhuộm xanh nhân nhờ sự oxy hóa hematoxylin và nhuộm bào tương bằng dung dịch đỏ eosin để nhuộm màu bạch cầu và các cấu trúc khác tạo màu đỏ, hồng hay cam

• Hóa mô miễn dịch(immunohistochemistry):một phương pháp nhuộm

đặc biệt để xác định kháng nguyên trong mô, mục đích chính của hóa

mô miễn dịch là xác định chính xác hơn bản chất của tế bào các đại phân tử có mặt trong mô so với kĩ thuật hóa mô.Dựa trên nguyên tắc kháng nguyên kháng thể đặc hiệu, để phát hiện các kháng nguyên đặc

hiệu trên bề mặt mô, người ta cho kháng thể đặc hiệu trên bề mặt mô Nếu trong mô có kháng nguyên sẽ có phản ứng kết hợp KN – KT kết hợp với các hóa chất để làm hiện rõ phức hợp KN-KT này dưới kính hiển vi quang học.Vì kháng nguyên không thể quan sát hình thái được nên người ta xác định vị trí của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học bằng phương pháp miễn dịch huynh quang hoặc miễn dịch lên men.

• Diff Quick: là phương pháp nhuộm tạo kết tủa màu đen hình thành từ

việc bổ sung các dung dịch xanh methylen và eosin, hòa tan trong methanol Các cấu trúc khác nhau về mức độ oxy hóa của nhuộm các màu xanh methylene trước khi rửa nước Phương pháp nhuộm ban đầu được thiết kế để kết hợp nhuộm tế bào chất (màu hồng) với nhuộm màu (màu xanh) hạt nhân và định hình như là một bước duy nhất cho dấu ấn

mô học và mảnh cắt mô mỏng Thay đổi nhỏ nồng độ thuốc nhuộm và thời gian nhuộm tùy thuộc vào vị trí mô được cố định nhuộm

• Giemsa: là phương pháp nhuộm đặc hiệu để phát hiện và chẩn đoán

HP trong mô bệnh học Phương pháp này dùng Giemsa để làm nổi bật các tế bào khác nhau trong mô học

Đánh giá các phương pháp mô bệnh học trong xét nghiệm HP: Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra một phương pháp tối ưu giúp chẩn đoán HP một cách nhanh chóng và chính xác

Kết được xem xét ở bảng sau:

Bảng 1.2 So sánh về giá thành, thời gian nhuộm, độ nhạy và độ đặc hiệu

của các phương pháp nhuộm[11].

Thời gian nhuộm

Độ nhạy (%)

Độ đặc hiệu (%)

1.5 Phương pháp nhuộm Giemsa trên mô bệnh học để phát hiện

vi khuẩn Helicobacter pylori

1.5.1 Quy trình chung lấy, cố định,vùi, cắt và dán mảnh

cả vùng tổn thương và vùng xunh quanh để có thể quan sát, so sánh, đánh giá[4][5]

Những yêu cầu này dễ thực hiện đối với tử thiết hoặc bệnh phẩm phẫu thuật hơn là với những sinh thiết bằng dụng cụ, nhất là khi tổn thương ở sâu hoặc trong các tạng

1.5.1.2Cố định bệnh phẩm

Cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất Trừ một số trường hợp cần nhuộm tươi hay cần nghiên cứu về men, nuôi cấy tế bào thì nói chung, mọi bệnh phẩm cần cố định ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể Nếu như ta cố định bệnh phẩm không tốt thì sẽ làm giảm chất lượng xét nghiệm còn cố định hỏng thì không thể sửa chữa được[5]

Một số dung dịch cố định thông dụng:

o Dung dịch formol đệm trung tính 10%:

Formaldehyde 37% - 40% 100mlNước cất 900mlSodium phosphate monobasic (NaH2PO4) 4gSodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4 khan) 6.5g

o Dung dịch formol 10%:

Formandehyde 37% - 40% 100mlNước cất hai lần 900ml

o Dung dịch cố định Bouin:

Dung dịch nước bão hòa acid picic 75mlFormaldehyde 37% - 40% 20mlAcid acetic lạnh, nguyên chất 5ml

1.5.1.3Vùi bệnh phẩm

Cố định mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho các thành phần của chúng được bất động ở trạng thái tĩnh Nếu đem cắt ngay thành các lát cắt mỏng,

mối liên quan giữa các tế bào cũng như cấu trúc mô bị biến đổi, thậm chí bị đảo lộn do tác động cơ học Muốn vậy người ta phải tạo khuôn cho bệnh phẩm, nghĩa là phải làm cho một chất nào đó ngấm sâu vào tế bào hoặc mô

mà khi cắt không làm biến dạng cấu trúc của chúng Có nhiều chất được dùng cho phương pháp này nhưng chất hay được dùng hơn cả là parafin

Quy trình chuyển máy:

 Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ

Thời gian cố định tối thiểu là 3 giờ

1) Rửa nhẹ trong nước chảy

1.5.1.4Kỹ thuật cắt và dán mảnh

Cấu trúc tế bào hoặc mô chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi khi chúng được cắt thành những lát mỏng cỡ micromet để cho ánh sáng đi qua Khi đó ta mới quan sát được chi tiết của tế bào, hình dạng hay cách sắp xếp của chúng

Thông thường các mảnh cắt paraffin được cắt mỏng 3-5µm Ban đầu ta cắt vài lát để cho toàn bộ khối nến và mô trình diện hết (cắt “phá”), sau đó cắt

2 đến 3 lát dán lên lam kính Để lát cắt giãn, căng ra và mềm mại, ta sử dụng

“bàn hơ” nước hoặc khô ( hot place ) Để khô tiêu bản trong tủ ấm 50oC/1h[5][8]

1.5.2 Phương pháp nhuộm Giemsa trên mô bệnh học

Phương pháp này được đặt tên theo nhà khoa học người Đức, Gustav Giemsa, người đầu tiên phát minh ra nó nhằm mục đích nghiên cứu kí sinh trùng gây bệnh sốt rét[10]

1.5.2.1Nguyên tắc

- Phương pháp nhuộm Giemsa là phương pháp nhuộm sử dụng Giemsa

là một hóa chất tiêu chuẩn có tác dụng làm nổi bật các tế bào khác nhau một cách rõ ràng trong xét nghiệm mô bệnh học hoặc tế bào học

- Để đảm bảo có được kết quả chính xác, các bước của quy trình phải được tiêu chuẩn hóa, đồng thời hỗn hợp thuốc nhuộm cũng cần phải được đảm bảo

- Công thức nhuộm Giemsa được điều chỉnh để phù hợp với thời gian nhuộm nhằm đảm bào sự ổn định về màu sắc của kết quả nhuộm

1.5.2.2Công thức hóa học

Giemsa là một hỗn hợp của methylene blue, eosin và azure B dưới

dạng bột hòa tan Thuốc nhuộm được chuẩn bị trước từ bột Giemsa thương mại [10]

 Methylene blue:

Hình 1.2 Methylene blue

- Là một chất hóa học dạng vòng thơm với công thức phân tử là C16H18N3SCl Hợp chất được phát minh vào năm 1876 bởi nhà khoa học người Đức – Heintich Caro(1834-1910)[12]

- Được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực sinh học và hóa học

- Ở nhiệt độ phòng: không mùi, dạng bột xanh đậm, khi hòa tan vào nước

có màu xanh da trời

- Tên quốc tế (INN) của methylene blue là methylthioninium chloride.

 Eosin:

Eosin Y Eosin B

Hình 1.3 Eosin Y và Eosin B

- Gồm 2 loại hợp chất có liên quan chặt chẽ là Eosin Y và Eosin B Trong đó Eosin Y thường được sử dụng.

- Eosin là một thuốc nhuộm màu đỏ, dễ tan trong nước

- Nó được dùng để nhuộm tế bào chất, collagen và các sợi cơ Trong mô học, nó là một thuốc nhuộm có tính acid dùng để nhuộm tế bào chất

 Azure B:

Hình 1.4 Azure B

- Còn được gọi là Methylene Azur B clorua trimethylthionine

- Ở nhiệt độ phòng: dạng bột màu xanh đậm, hòa tan trong nước

- Đây là thuốc nhuộm methyl hóa, nhuộm màu xanh lá cây (đối với

nhiễm sắc thể) và xanh (nucleotid và ribosome), màu đỏ (chứa

1 Hòa tan 3.8g của Giemsa bột vào 250ml methanol

2 Đun nóng dung dịch từ bước 1 đến ~ 60 o C

3 Từ từ thêm trong 250ml glycerin với các hóa chất từ bước 2

4 Lọc dung dịch thu được từ bước 3

5 Dung dịch cần được để một khoảng thời gian trước khi sử dụng Thời gian để khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng, tuy nhiên thời gian tối thiểu là hai tháng

- Giemsa theo các nồng độ nghiên cứu: là dung dịch Giemsa được pha từ giemsa mẹ theo các tỉ lệ về nồng độ trong nghiên cứu gồm các dung dịch: Giemsa 1/4, Giemsa 1/3, Giemsa 1/2

- Dung dịch cố định Bouin được pha theo công thức chung

- Dung dịch biệt hóa acid acetic 0.1%(2 giọt acid acetic đặc với 100ml nước cất)

- Nước cất 2 lần được sử dụng để pha Giemsa và rửa bệnh phẩm

- Dung dịch cồn với các nồng độ 80,90,100

- Dung dịch xylen

Quy trình nhuộm Giemsa:

Bệnh phẩm sau khi được cắt mảnh và dán vào lam kính, đươc tẩy paraffin bằng xylen, cồn và rửa nước

- Tiêu bản được cố định trong tủ ấm 30 phút, nhiệt độ 500

- Tiêu bản tẩy paraffin qua 3 lần xylen, mỗi lần 2 phút

- Sau đó được tẩy xylen bằng 3 lần cồn 800, 900, 1000

- Rửa nước chảy 5 phút

- Nhỏ Giemsa 1/4 trong thời gian 60 phút.( lưu ý: có thể lọc Giemsa trước khi nhỏ để tránh cặn Giemsa.)

- Rửa qua nước

- Biệt hóa trong acid acetic 0.1% trong vài giây

- Rửa qua bằng nước cất để loại bỏ acid dư

- Loại nước bằng cồn tuyệt đối, làm trong tiêu bản bằng xylen.

- Gắn lamelle Baume Canada Để khô tiêu bản

Kết quả:

- Vi khuẩn HP bắt màu xanh - xanh xám

- Nhân tế bào màu xanh - xanh đen

- Tế bào chất màu xanh sáng

- Phân biệt rõ nhân và bào tương

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu :

 Bao gồm 30 khối nến tiêu chuẩn, chứa bệnh phẩm niêm mạc dạ dày đã có chẩn đoán xác định là nhiễm HP, đủ để cắt mỗi khối nến 10 tiêu bản

 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kĩ thuật nhuộm Giemsa trên mảnh cắt paraffin gồm có:

- Dung dịch cố định

- Độ dày mảnh cắt

- Nồng độ thuốc nhuộm

- Thời gian nhuộm

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu:

Bệnh phẩm sinh thiết nội soi phẫu thuật từ nhiều vị trí của bệnh nhân viêm dạ dày tá tràng dương tính với vi khuẩn HP

Được chẩn đoán nhiễm hp bằng phương pháp nhuộm H&E

Mỗi mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày có kích thước tối thiểu 1x1x1mm

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

Bệnh nhân có kết quả xét nghiệm âm tính với HP trên tiêu bản nhuộm HE

Các mảnh cắt qua sinh thiết dạ dày nhưng lấy ra ngoài vùng niêm mạc

dạ dày, những mảnh sinh thiết vào ổ loét, vùng trợt không còn biểu mô phủ, các mảnh sinh thiết quá nhỏ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

 Là phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Phương tiện nghiên cứu

− Khối nến chứa bệnh phẩm niêm mạc dạ dày đã được cố định, vùi và chuyển đúc theo thông lệ, đảm bảo các yêu cầu của kỹ thuật nhuộm HE

− Máy chuyển Microm SM 120

− Máy đúc Microm AP 280

− Máy cắt Microm HM 315 – Thermo

− Tủ ấm, tủ lạnh, buồng nhuộm an toàn, bể nhuộm

− Lam kính, lọ đựng hóa chất, giá gỗ, đồng hồ bấm giờ, khăn sạch

2.2.4 Quy trình nghiên cứu:

Pha phẩm nhuộm: Dung dịch nhuộm Giemsa được pha từ Giemsa của hãng với nồng độ phù hợp mục đích nghiên cứu

Một số yếu tố được chọn để đánh giá:

 Độ dày mảnh cắt: Bệnh phẩm được cố định bằng dung dịch

formol, chuyển, đúc, cắt mảnh theo quy trình Mảnh cắt được khuyến cáo có

độ dày tương đối từ 3 đến 5 µm Vì vậy, ta khảo sát với độ dày mảnh cắt thay đổi như sau:

Phương pháp nhuộm Giemsa được khuyến cáo dùng với nồng độ 1:4

Để đánh giá ảnh hường của nồng độ thuốc nhuộm, ta khảo sát trên các nồng

độ sau phương pháp nhuộm Giemsa được khuyến cáo dùng với nồng độ 1:4

Để đánh giá ảnh hường của nồng độ thuốc nhuộm, ta khảo sát trên các nồng

độ sau:

•Giemsa nồng độ 1:4- theo tiêu chuẩn

•Giemsa nồng độ 1:3

•Giemsa nồng độ 1:2

 Thời gian nhuộm: thời gian nhuộm ảnh hưởng đến khả năng bắt

màu của thuốc nhuộm vào mô Thời gian nhuộm theo tiêu chuẩn của phương pháp nhuộm Giemsa trên mô được khuyến cáo là 60 phút Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nhuộm ta lấy 2 mốc thời gian sau:

•Thời gian nhuộm ít hơn tiêu chuẩn: 30 phút

•Thời gian nhuộm theo tiêu chuẩn: 60 phút

2.2.5 Nhận định kết quả

•Các tiêu bản được nhận định trên kính hiển vi quang học ở các

độ phóng đại khác nhau: X100; X400

•Chất lượng tiêu bản được đánh giá theo ba mức độ:

1 Không đạt yêu cầu:

- Không quan sát được hoặc khó quan sát sự có mặt của Helicobacter

pylori gây hiện tượng âm tính giả.

- Tiêu bản quá xấu do các lỗi như: mảnh cắt rách, nát hoặc nhăn nhúm, tiêu bản bị bẩn không đọc được kết quả.

- Tiêu bản bị mốc, nhiễm khuẩn gây dương tính giả

- Tiêu bản quan sát rõ Helicobacter pylori với màu sắc rõ nét, trong sáng.

- Tiêu bản cắt mỏng đều, không gấp, không rách xước, màu của

nhân và bào tương rõ nét, tương phản…

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Yếu tố nồng độ thuốc nhuộm Giemsa:

Bảng 3.1 Kết quả nhuộm Giemsa ở các nồng độ khác nhau trong thời

Tỷ lệ (%)

Số lượng tiêu bản

Tỷ lệ (%)

Số lượng tiêu bản

Tỷ lệ (%)

 Kết quả nhuộm với nồng độ Giemsa là 1/4:

- Tiêu bản không đạt: 0%, tiêu bản đạt: 13%, tiêu bản tốt: 87%.

- Phần lớn tiêu bản (87%) cho kết quả tốt, không có tiêu bản không đạt(0%), hình ảnh HP trên tiêu bản rõ ràng, sáng trong, dễ đánh giá và

chẩn đoán, đạt yêu cầu cần có để kết luận và trả kết quả

- Hầu hết tiêu bản cắt mỏng, đều, màu sắc tương phản tốt, HP dễ dánh giá Tuy nhiên có một số tiêu bản còn đôi chút bị xước

 Kết quả nhuộm Giemsa với nồng độ 1/3:

- Tiêu bản không đạt: 27%, tiêu bản đạt: 40%, tiêu bản tốt: 33%.

- Tiêu bản đậm màu, có khi bắt gặp cặn thuốc nhuộm

- Khả năng quan sát tìm HP giảm