một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhuộm giemsa phát hiện helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin

B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI *** DNG TUN CNG Một số yếu tố ảnh hởng đến kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA Khúa 2009 2013 H Ni 2013 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI *** DNG TUN CNG Một số yếu tố ảnh hởng đến kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA Khúa 2009 2013 Ngi hng dn: CN. Nguyn Th Thu Hng. H Ni 2013 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội, bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em học tập, rèn luyện nâng cao kiến thức kĩ năng, tu dưỡng tại trường. Em xin chân thành cảm ơn gv. Nguyễn Thu Hương- người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp đỡ, đóng góp và chỉ dạy tận tình trong quá trình hoàn thành khóa luận này. Em xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị trong Bộ môn Giải phẫu bệnh đã giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Và em cũng xin cảm ơn công lao to lớn của to lớn của các thầy cô giáo trường Đại Học Y Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo, rèn luyện giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tại trường. Xin cảm ơn những người bạn đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cha mẹ, những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ con về cả vật chất và tinh thần, là nguồn động lực lớn lao để con phấn đấu vươn lên. Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2013 Sinh viên Dương Tuấn Cường LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu này là của riêng tôi, những số liệu thu thập được trong nghiên cứu là có thật, được thu thập tại bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội. Tôi xin chịu mọi trách nhiệm liên quan về những thông tin tôi đưa ra. Hà Nội,2013 Sinh viên Dương Tuấn Cường MỤC LỤC Chương 1 International Agency for Research on Cancer 7 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 Chương 2 20 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Chương 3 24 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 Chương 4 36 BÀN LUẬN 36 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT T T Chữ viết tắt Viết đầy đủ 1. + Dương tính 2. - Âm tính 3. HP Helicobacter Pylori 4. IARC Chương 1 Inte rnational Agency for Research on Cancer 5. PCR Polymerase chain reaction 6. MBH Mô bệnh học 7. H&E Hematoxylin và Eosin 8. KN – KT Kháng nguyên - Kháng thể 9. pH Nồng độ ion H + 10. WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) 11. NIM Non - Invasive Methods 12. CLO Campylobacter like organism 13. INN International Nonproprietary Name ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) tuy mới được phát hiện bởi bác sĩ Marshall và Warren (hai người nhận giải thưởng Nobel 2005) nhưng lại được y học thế giới rất quan tâm vì nó được coi là thủ phạm chính gây ra các bệnh viêm loét dạ dày (khoảng 80% các trường hợp), viêm loét tá tràng (hơn 90% các trường hợp), là tác nhân số 1 gây ung thư dạ dày theo phân loại của Cơ quan nghiên cứu ung thư thế giới (IARC). Một số nghiên cứu mới đây cho rằng HP đã trú ẩn trong dạ dày người khoảng 58.000 năm trước, tại vùng Đông Phi, nơi được coi là cái nôi của con người hiện đại và từ đó tỏa đi khắp nơi trên trái đất. Những kẻ đồng hành gây bệnh tật cho con người này đã náu mình rất lâu cho tới khi người thầy thuốc trẻ Barry Marshall phát hiện ra vai trò gây bệnh của chúng vào 1983 đồng thời cũng là người quan sát được loại vi khuẩn này trên các mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày. Lúc đầu loại vi khuẩn này có tên Campylobacter pylori, đến năm 1989, do phát hiện thêm một số tính chất hóa học, vi khuẩn Campylobacter pylori được đổi tên thành Helicobacter pylori. Nhiễm vi khuẩn HP rất phổ biến trên thế giới nhưng có sự khác nhau giữa các quốc gia và giữa các vùng, miền trong cùng một quốc gia, tỷ lệ nhiễm cao hơn ở những nước có điều kiện kinh tế thấp kém. Nhiễm HP thường xuất hiện rất sớm ở trẻ em từ 2-3 tuổi và tăng dần khoảng 1% mỗi năm và có thể tới 50% số trẻ em nhiễm HP ở một số nước đang phát triển. Ở Việt Nam, tỉ lệ nhiễm HP là hơn 60% [1]. Ở dạ dày, HP thường cư trú ở khe giữa các tế bào biểu mô của niêm mạc dạ dày ở phần sâu nhất của lớp chất nhầy, ngoài ra, HP còn cư trú ở niêm mạc tá tràng, niêm mạc thực quản khi có dị sản dạ dày. 1 Do vai trò đặc biệt quan trọng của HP với các bệnh lý dạ dày, tá tràng nên từ lâu người ta đã tìm cách để phát hiện chúng. Các phương pháp phát hiện HP có thể chia thành hai nhóm chính: Phát hiện HP không xâm phạm (Non Invasive Methods) và phát hiện HP có xâm phạm. Trong các phương pháp phát hiện không xâm phạm bao gồm: Miễn dịch học, test thở urease, xét nghiệm phân (bao gồm cấy phân, tìm kháng nguyên HP trong phân hoặc phản ứng PCR của HP ở trong phân). Phương pháp phát hiện HP có xâm phạm, bao gồm: Mẫu thử urease, nuôi cấy và phương pháp khuyếch đại gen (đều sử dụng bệnh phẩm là niêm mạc dạ dày qua sinh thiết) và chẩn đoán mô bệnh học (MBH) trên các mảnh sinh thiết nội soi. Trong những phương pháp trên, chẩn đoán phát hiện HP bằng MBH trên rên các mảnh sinh thiết nội soi là phương pháp được sử dụng nhiều nhất vì bên cạnh việc xác định sự hiện diện của HP, người ta còn chẩn đoán luôn được tình trạng bệnh lý của dạ dày- tá tràng (một mũi tên trúng hai mục tiêu). Để phát hiện HP trên các mảnh cắt niêm mạc dạ dày- tá tràng, nhiều phương pháp đã được sử dụng như nhuộm H&E, Diff Quick, hóa mô miễn dịch, Giemsa… nhằm tìm ra một phương pháp đáp ứng được các yêu cầu về độ nhậy cao, độ chính xác cao song lại đáp ứng được tiêu chí đơn giản, rẻ tiền, nhanh chóng, dễ áp dụng, có thể sử dụng trong nghiên cứu hồi cứu và phương pháp nhuộm Giemsa đã được lựa chọn không chỉ ở Việt nam mà còn ở hầu khắp các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh trên thế giới. Xuất phát từ thực tiễn chẩn đoán HP của phương pháp nhuộm Giemsa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm các mục tiêu: 1. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa tìm Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin. 2. Trình bày quy trình nhuộm Giemsa trên mảnh cắt mô tìm Helicobacter pylori đạt yêu cầu. 2 [...]... quả nhuộm Giemsa với dung dịch cố định là Bouin: - Tiêu bản không đạt: 47%, tiêu bản đạt: 53%, tiêu bản tốt: 0% - Hình ảnh HP khó phát hiện, màu nhợt nhạt, không tương phản, có khi mất hoàn toàn trên vi trường - Nhân và bào tương bắt màu nhạt 3.4 Yếu tố về độ dày mảnh cắt ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa: Bảng 3.4 Kết quả ảnh hưởng của yếu tố độ đày mảnh cắt lên tiêu bản nhuộm Giemsa Độ dày mảnh cắt. .. chuyển, đúc, cắt, nhuộm theo quy trình chuẩn 22  Độ dày mảnh cắt: Bệnh phẩm được cố định bằng dung dịch formol, chuyển, đúc, cắt mảnh theo quy trình Mảnh cắt được khuyến cáo có độ dày tương đối từ 3 đến 5 µm Vì vậy, ta khảo sát với độ dày mảnh cắt thay đổi như sau: Mảnh cắt có độ dày 3µm Mảnh cắt có độ dày 5µm  Nồng độ thuốc nhuộm: Bệnh phẩm được cố định bằng dung dịch formol Chuyển đúc cắt mảnh theo... không thể quan sát một cách rõ ràng - Một số tiêu bản có cặn Giemsa bám lại trên bề mặt - HP khó quan sát do nền chất nhầy bắt màu sẫm 3.2 Yếu tố thời gian ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa: Thời gian nhuộm cũng là một yếu tốt ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa Bảng 3.2 Kết quả nhuộm Giemsa với thời gian tương ứng là 30 và 60 phút Nồng độ Đánh giá Không đạt ¼ 1/3 Số lượng Tỷ tiêu bản lệ Số lượng tiêu bản... để cắt mỗi khối nến 10 tiêu bản  Một số yếu tố ảnh hưởng đến kĩ thuật nhuộm Giemsa trên mảnh cắt paraffin gồm có: - Dung dịch cố định - Độ dày mảnh cắt - Nồng độ thuốc nhuộm - Thời gian nhuộm 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: Bệnh phẩm sinh thiết nội soi phẫu thuật từ nhiều vị trí của bệnh nhân viêm dạ dày tá tràng dương tính với vi khuẩn HP Được chẩn đoán nhiễm hp bằng phương pháp nhuộm H&E Mỗi mảnh. .. bẩn Nồng độ nhuộm giemsa 1/2: - Tiêu bản không đạt 47%, tiêu bản đạt 40%, tiêu bản tốt 13% - Tiêu bản có màu sắc quá đậm, màu sắc nhân và bào tương cũng như vi khuẩn HP không phân biệt được - Trên tiêu bản có bám cặn Giemsa, bọt bôm, bám bẩn và cặn Giemsa 3.3 Yếu tố cố định ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa: Để xem xét ảnh hưởng của việc cố định đến kết quả chẩn đoán HP trên tiêu bản nhuộm Giemsa, hai... cố định ngay sau khi lấy bằng dung dịch cố định Sau đó được chuyển, đúc, vùi và cắt mảnh hàng loạt với độ dày 3-5 µm mảnh cắt được nhuộm bằng phương pháp Giemsa theo quy trình 2.2.4 Quy trình nghiên cứu: Pha phẩm nhuộm: Dung dịch nhuộm Giemsa được pha từ Giemsa của hãng với nồng độ phù hợp mục đích nghiên cứu Một số yếu tố được chọn để đánh giá:  Cố định: các bệnh phẩm được cố định bằng 2 dung dịch... thấy tính thống nhất về độ nhạy của chẩn đoán phát hiện HP rất cao và ổn định của phương pháp phát hiện trên các mảnh cắt mô vùi nến so với các phương pháp khác Một số phương pháp mô bệnh học phổ biến: • Nhuộm HE: là một phương pháp nhuộm phức tạp bao gồm 2 quá trình: nhuộm xanh nhân nhờ sự oxy hóa hematoxylin và nhuộm bào tương bằng dung dịch đỏ eosin để nhuộm màu bạch cầu và các cấu trúc khác tạo màu... Thời gian nhuộm: thời gian nhuộm ảnh hưởng đến khả năng bắt màu của thuốc nhuộm vào mô Thời gian nhuộm theo tiêu chuẩn của phương pháp nhuộm Giemsa trên mô được khuyến cáo là 60 phút Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nhuộm ta lấy 2 mốc thời gian sau: •Thời gian nhuộm ít hơn tiêu chuẩn: 30 phút •Thời gian nhuộm theo tiêu chuẩn: 60 phút 2.2.5 Nhận định kết quả • Các tiêu bản được nhận định trên kính... của Helicobacter pylori gây hiện tượng âm tính giả 23 - Tiêu bản quá xấu do các lỗi như: mảnh cắt rách, nát hoặc nhăn nhúm, tiêu bản bị bẩn không đọc được kết quả - Tiêu bản bị mốc, nhiễm khuẩn gây dương tính giả 2 Đạt yêu cầu: - Có thể nhận định được kết quả sự có mặt của Helicobacter pylori trên tiêu bản nhuộm - Một số lỗi kĩ thuật có thể gặp: tiêu bản gấp, xước 3 Tốt: - Tiêu bản quan sát rõ Helicobacter. .. tưởng(%) nhuộm Pháp Hóa mô 96 Đắt 3.5 h miễn dịch Nhuộm 92 Rẻ 30-60 phút Giemsa H.E 80 Rẻ 20 phút Độ nhạy (%) Độ đặc hiệu (%) 100 100 97 90 97 80 Từ kết quả trên, ta nhận thấy Giemsa là phương pháp nhuộm được lựa chọn để phát hiện HP vì có nhiều ưu điểm như độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian nhuộm trung bình và có giá thành rẻ 1.5 Phương pháp nhuộm Giemsa trên mô bệnh học để phát hiện vi khuẩn Helicobacter . tiêu: 1. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Giemsa tìm Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin. 2. Trình bày quy trình nhuộm Giemsa trên mảnh cắt mô tìm Helicobacter pylori đạt. DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI *** DNG TUN CNG Một số yếu tố ảnh hởng đến kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA Khúa 2009. DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI *** DNG TUN CNG Một số yếu tố ảnh hởng đến kỹ thuật nhuộm Giemsa phát hiện Helicobacter pylori trên mảnh cắt paraffin KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA Khúa 2009