Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans

Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  PHAN VĂN CƢƠNG PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ SSR PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2014 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  PHAN VĂN CƢƠNG PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ SSR PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên, năm 2014 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu đƣợc nguyên bản, không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Phan Văn Cƣơng iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Vũ Thanh Trà đã định hƣớng khoa học, tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Hoàng Phú Hiệp và các thầy, cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thại Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ Khoa Khoa học sự sống, trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. & , khoa Sinh – K – . Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014 Tác giả Phan Văn Cƣơng v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xi 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. CÂY CHÈ (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) 4 1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây chè 4 1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới và ở Việt Nam 5 1.1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới 5 1.1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam 7 1.1.3. Đặc điểm di truyền của cây chè Camellia sinensis (L.) O. Kuntze 8 1.2. BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans HẠI CHÈ 9 1.2.1. Tác nhân gây bệnh, phạm vi phân bố và lịch sử phát triển bệnh 9 1.2.2. Đặc điểm phát sinh và diễn biến của bệnh 10 1.2.3. Thiệt hại do bệnh phồng lá ở cây chè 12 1.2.4. Một số nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans ở chè 14 vi 1.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA 21 1.3.1. Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong phân tích hệ gen và chọn giống 21 1.3.2. Chỉ thị phân tử SSR 22 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 24 2.1.1. Vật liệu 24 2.1.2. Hóa chất 26 2.1.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 26 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu lá chè và tách chiết DNA tổng số 27 2.2.2. Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích chè 28 2.2.3. Phản ứng PCR-SSR 29 2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 29 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR bằng phần mền NTSYS 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 30 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá chè 30 3.1.2. Kết quả của phản ứng PCR-SSR 30 3.1.2.1. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11D02T 34 3.1.2.2. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-10H08S 35 3.1.2.3. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11H07S 36 3.1.2.4. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-31E06S 36 3.1.2.5. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-18A10T 37 3.1.2.6. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S 38 vii 3.1.2.7. Tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA xuất hiện 39 3.2. PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ KHÁC NHAU 41 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ SSR LIÊN KẾT VỚI TÍNH KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ Ở CHÈ 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 viii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABC ATP - binding cassette AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism AP Aspartic proteinase ASM Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7-carboxylic acid S-methyl ester ATP Adenosin triphosphat Bp Base pair CBL Calcineurin B-like CIGR Chitin-inducible gibberellin-responsive CITRX Cf-9-interacting thioredoxin CS Cộng sự CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid EST Expressed Sequence Tag FAO Food and Agriculture Organisation Gbase Giga Base HRGP Hydroxyproline-rich glycoprotein ISSR Inter - Simple Sequence Repeat kb Kilobase LPTs Lipid transfer proteins LRR Leucine Rich Repeat MIP Major intrinsic protein NBS Nucleotit Binding Site OPR 12-oxo-phytodienoic acid reductase ix PLC5 Phospholipase C PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphic Information Content PIP Plasma membrane intrinsic protein PK Protein Kinaza RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RGA Resistance Gene Analog RubisCO Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase SCAR Sequence - Characterized Amplified Region SDS Sodium Đoecyl Sulphat SNP Single nucleotide polymorphism SRFA Selective restriction Fragment Amplication SSR Simple Sequence Repeats STK Serine/threonine kinase STSs Sequence Tagged Site TAE Tris – Acetate – EDTA Tris Trioxymetylaminometan TRX Thioredoxin UPS Ubiquitin-proteasome system XK Xuất khẩu XTHs Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1: Xếp hạng xuất khẩu chè thế giới từ năm 2008 đến 2011 7 Bảng 2.1: Địa điểm thu mẫu và khả năng kháng bệnh phồng lá của một số giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu 24 Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 28 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR-SSR 29 Bảng 3.1: Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 31 Bảng 3.2: Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR-SRR từ 6 cặp mồi 31 Bảng 3.3: Tổng số phân đoạn DNA thu đƣợc khi thực hiện phản ứng PCR-SSR ở 30 giống/dòng chè với 6 cặp mồi nghiên cứu 32 Bảng 3.4: Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 6 cặp mồi SSR 40 Bảng 3.5: Hệ số sai khác di truyền của 30 giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu 42 [...]... lá do nấm Exobasidium vexans [5], [10] Một hƣớng nghiên cứu mới hiện nay là sử dụng chỉ thị phân tử để nghiên cứu và đánh giá mức độ kháng bệnh phồng lá của chè, từ đó xác định chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh phồng lá và ứng dụng nó trong chọn giống [13] Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát triển chỉ thị SSR phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng. .. cứu về cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans ở chè Cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans của cây chè từ lâu đã là mối quan tâm của các nhà nghiêm cứu nhằm mục tiêu hiểu biết rõ hơn về các phản ứng kháng bệnh phồng lá để phục vụ cho công tác chọn giống chè Các phản ứng kháng bệnh phồng lá đƣợc đặc trƣng bởi phản ứng phiên mã của cây chè nhiễm Exobasidium vexans Sự hiểu... phồng lá do nấm Exobasidium vexans 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc mức độ đa dạng di truyền của một số giống chè có khả năng kháng bệnh phồng lá khác nhau đƣợc trồng tại một số tỉnh miền núi phía Bắc Việ Lựa chọn đƣợc chỉ thị SSR liên kết với tính kháng bệnh phồng lá phục vụ 3 chọn giống chè kháng bệnh do nấm Exobasidium vexans 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập mẫu các giống chè có khả năng kháng. .. nhau vỉ bệnh có thể đƣợc nhìn thấy trên cùng một lá (hình 1.2) Hình 1.2: Các giai đoạn khác nhau của bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans trên cùng một lá A Giai đoạn ban đầu của nhiễm bệnh phồng lá B Các vỉ bệnh đang phát triển C Vỉ bệnh phát triển mạnh nhất D Hoại tử của mô bị nhiễm bệnh Các tế bào ở các vùng bị nhiễm bệnh tăng lên về kích thƣớc, các vỉ bệnh bao gồm các bó nhỏ gọn của sợi nấm sắp... trên trên và dưới bề mặt lá B Các vỉ bệnh phát triển đầy đủ gây tổn thương bề mặt lá, nấm sắp sinh bào tử C Một chiếc lá bị nhiễm nấm Exobasidium vexans rất nặng với rất nhiều vỉ bệnh phồng lá D Nhiễm bệnh nặng khiến lá bị cuộn lên E Cái chết của các mô bị nhiễm bệnh F Hoại tử và nhiễm trùng cuống 1.2.3 Thiệt hại do bệnh phồng lá ở cây chè 13 Thiệt hại về năng suất Exobasidium vexans có khả năng gây... các giống hoang dại Trong thực tế rất khó xác định trong tự nhiên có tồn tại hay không một giống chè mang vật chất di truyền nguyên trạng mà không bị pha trộn Vì vậy khái niệm “cây chè bao trùm tất cả các giống/ dòng là con lai của các thứ chè [60] 1.2 BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans HẠI CHÈ 1.2.1 Tác nhân gây bệnh, phạm vi phân bố và lịch sử phát triển bệnh Bệnh phồng lá hại chè gây ra bởi nấm. .. có khả năng kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans khác nhau ở một số địa phƣơng ở miền Bắc Việt Nam 3.2 Thu thập thông tin về chỉ thị SSR sử dụng trong phân tích hệ gen cây chè Nhân bản các phân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi SSR 3.3 Phân tích tính đa dạng di truyền các giống chè có khả năng kháng bệnh phồng lá khác nhau dựa trên dữ liệu SSR 3.4 Xác định chỉ thị SSR đặc trƣng và... liệu Thu thập các mẫu lá bánh tẻ của 30 giống/ dòng chè đƣợc trồng tại một số vùng trồng chè ở miền Bắc Việt Nam để sử dụng cho tách chiết DNA Thông tin về khả năng kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans do các cơ sở trồng chè cung cấp đƣợc thể hiện qua bảng 2.1 Bảng 2.1: Địa điểm thu mẫu và khả năng kháng bệnh phồng lá của một số giống/ dòng chè sử dụng trong nghiên cứu STT Tên giống/ dòng Ký hiệu... thiệt hại do bệnh phồng lá gây ra trên chè dao động từ 20 đến 25% vì chè đƣợc bảo vệ ở mức tƣơng đối [76] Trong đầu những năm 1950, Indonesia bị mất khoảng 10.000 tấn chè vì bệnh phồng lá [23] Nếu bệnh phồng lá không đƣợc kiểm soát sẽ dẫn đến sự mất mát hàng năm là 43% năng suất của cây chè [66] Thiệt hại về chất lượng Ngoài gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất đối với cây chè, bệnh phồng lá cũng... biển bệnh phát sinh gây hại nhiều hơn Những nƣơng chè quản lý không tốt, cỏ dại nhiều, khuất gió và nhiều cây che bóng bệnh phát sinh và gây hại nhiều hơn Bệnh cũng phát sinh gây hại nhiều hơn ở những nƣơng chè bón nhiều phân đạm và nƣơng chè trồng bằng các giống chè có bản lá to 11 Bệnh phồng lá là một bệnh nhiều chu kỳ nghĩa là có nhiều thế hệ các tác nhân gây bệnh đƣợc hoàn tất trong vòng một mùa vụ . giống [13]. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát triển chỉ thị SSR phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans . 2. Mục tiêu. TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  PHAN VĂN CƢƠNG PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ SSR PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số:. TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  PHAN VĂN CƢƠNG PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ SSR PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC