Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans

Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans Phát triển chỉ thị ssr phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Phan Văn Cương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu và TS Vũ Thanh Trà đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Hoàng Phú Hiệp và các thầy, cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thại Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ Khoa Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN - i

LỜI CẢM ƠN - iv

MỤC LỤC - v

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT - viii

DANH MỤC CÁC BẢNG - x

DANH MỤC CÁC HÌNH - xi

1 Đặt vấn đề - 1

2 Mục tiêu nghiên cứu - 2

3 Nội dung nghiên cứu - 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 4

1.1 CÂY CHÈ (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) - 4

1.1.1 Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây chè - 4

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới và ở Việt Nam - 5

1.1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới - 5

1.1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam - 7

1.1.3 Đặc điểm di truyền của cây chè Camellia sinensis (L.) O Kuntze - 8

1.2 BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans HẠI CHÈ - 9

1.2.1 Tác nhân gây bệnh, phạm vi phân bố và lịch sử phát triển bệnh - 9

1.2.2 Đặc điểm phát sinh và diễn biến của bệnh - 10

1.2.3 Thiệt hại do bệnh phồng lá ở cây chè - 12

1.2.4 Một số nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans ở chè - 14

1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA - 21

1.3.1 Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong phân tích hệ gen và chọn giống - 21

1.3.2 Chỉ thị phân tử SSR - 22

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 24

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - 24

2.1.1 Vật liệu - 24

2.1.2 Hóa chất - 26

2.1.3 Thiết bị và địa điểm nghiên cứu - 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 27

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu lá chè và tách chiết DNA tổng số - 27

2.2.2 Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích chè - 28

2.2.3 Phản ứng PCR-SSR - 29

2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose - 29

2.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR bằng phần mền NTSYS 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 30

3.1 NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR - 30

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá chè - 30

3.1.2 Kết quả của phản ứng PCR-SSR - 30

3.1.2.1 Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11D02T - 34

3.1.2.2 Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-10H08S - 35

3.1.2.3 Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11H07S - 36

3.1.2.4 Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-31E06S - 36

3.1.2.5 Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-18A10T - 37

3.1.2.6 Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S - 38

3.1.2.7 Tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA xuất hiện - 393.2 PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ KHÁC NHAU - 413.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ SSR LIÊN KẾT VỚI TÍNH KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ Ở CHÈ - 45KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - 46TÀI LIỆU THAM KHẢO - 47

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ABC ATP - binding cassette

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

CIGR Chitin-inducible gibberellin-responsive

CITRX Cf-9-interacting thioredoxin

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐVT Đơn vị tính

EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid

EST Expressed Sequence Tag

FAO Food and Agriculture Organisation

Gbase Giga Base

HRGP Hydroxyproline-rich glycoprotein

ISSR Inter - Simple Sequence Repeat

LPTs Lipid transfer proteins

LRR Leucine Rich Repeat

MIP Major intrinsic protein

NBS Nucleotit Binding Site

OPR 12-oxo-phytodienoic acid reductase

PLC5 Phospholipase C

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphic Information Content

PIP Plasma membrane intrinsic protein

RAPD Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RGA Resistance Gene Analog

RubisCO Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase SCAR Sequence - Characterized Amplified Region

SDS Sodium Đoecyl Sulphat

SNP Single nucleotide polymorphism

SRFA Selective restriction Fragment Amplication

SSR Simple Sequence Repeats

STK Serine/threonine kinase

STSs Sequence Tagged Site

TAE Tris – Acetate – EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 1.1: Xếp hạng xuất khẩu chè thế giới từ năm 2008 đến 2011 - 7

Bảng 2.1: Địa điểm thu mẫu và khả năng kháng bệnh phồng lá của một số giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu - 24

Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu - 28

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR-SSR - 29

Bảng 3.1: Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu - 31

Bảng 3.2: Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR-SRR từ 6 cặp mồi - 31

Bảng 3.3: Tổng số phân đoạn DNA thu đƣợc khi thực hiện phản ứng PCR-SSR ở 30 giống/dòng chè với 6 cặp mồi nghiên cứu - 32

Bảng 3.4: Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 6 cặp mồi SSR - 40

Bảng 3.5: Hệ số sai khác di truyền của 30 giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu - 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1: Sản xuất chè thế giới trong năm 2010 - 6

Hình 1.2: Các giai đoạn khác nhau của bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans trên cùng một lá - 11

Hình 1.3: Các giai đoạn của bệnh phồng lá - 12

Hình 3.1: Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ lá của các giống/dòng chè nghiên cứu - 30

Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11D02T - 34

Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-10H08S - 35

Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11H07S - 36

Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-31E06S - 37

Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-18A10T - 38

Hình 3.7: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S - 39

Hình 3.8: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 30 giống/dòng chè có phản ứng khác nhau với bệnh phồng lá dựa trên chỉ thị SSR - 43

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là loại cây

trồng lưu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm Tác dụng chữa bệnh và chất dinh dưỡng của nước chè đã được các nhà khoa học khẳng định Cafein

và một số hợp chất alkaloid khác có trong chè là những chất có khả năng kích thích

hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn, tăng cường sự hoạt động của các cơ quan trong cơ thể, nâng cao năng lực làm việc [106]

Hỗn hợp tanin chè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột như tả,

lỵ, thương hàn Nhiều thầy thuốc còn dùng nước chè, đặc biệt là chè xanh để chữa bệnh sỏi thận, sỏi bàng quang và chảy máu dạ dày và hiện nay chưa tìm ra được chất nào lại có tác dụng làm vững chắc các mao mạch tốt như catechin của chè Mgaloblisvili và cs đã xác định ảnh hưởng tích cực của nước chè xanh tới tình trạng chức năng của hệ thống tim mạch, trao đổi muối - nước, tình trạng của chức năng hô hấp ngoại vi, sự trao đổi vitamin C, trạng thái chức năng của hệ thống điều tiết máu… Chè còn chứa nhiều loại vitamin như vitamin A, B1, B2, B6, vitamin PP và nhiều nhất là vitamin C Các nhà khoa học Nhật Bản đã phát hiện một giá trị đặc biệt của chè là tác dụng chống phóng xạ Nghiên cứu này đã chứng minh chè có tác dụng chống được chất stronti (Sr) 90 là một đồng vị phóng xạ rất nguy hiểm [106]

Ngoài ra, chè được dùng làm chất tạo màu thực phẩm vì nó vừa có khả năng thay thế các chất tạp màu nhân tạo độc hại vừa có giá trị dinh dưỡng cao Các sản phẩm phụ của chè như dầu hạt chè có thế sử dụng trong công nghiệp hay làm dầu

ăn như các loại thực phẩm khác

Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩu cao Nước ta có nhiều vùng trồng và chế biến chè nổi tiếng như Mộc Châu, Thái Nguyên, Lâm Đồng, cùng với nhiều giống chè quý như chè Shan ở Hà Giang, Suối Giàng, chè Tân Cương ở Thái Nguyên…[109]

Chọn tạo giống chè bằng phương pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn, tốn kém nhiều thời gian, công sức hơn nữa hiệu quả chọn giống không cao Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử - MAS (Molecular-Assisted Selection) sẽ giúp các nhà khoa học nhanh chóng chọn ra các cá thể mang các tính trạng mong muốn ở giai đoạn sớm

mà không bị ảnh hưởng của yếu tố môi trường và rút ngắn được thời gian chọn giống [39] Những năm gần đây, các chỉ thị phân tử nói chung và chỉ thị phân tử DNA vi vệ tinh (SSR-MS) hay các trình tự lặp lại đơn (simple sequence repeats – SSRs) nói riêng đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu genome và phân tích tính đa dạng di truyền quần thể của nhiều loại cây trồng khác nhau [26] Chỉ thị SSR

đã được khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền và xây dựng bản đồ liên kết [38] Hơn nữa, đặc điểm hình thái không thể phản ánh sự biến đổi di truyền vốn có trong cây trồng [11] Vì vậy việc xác định các công cụ phân tử có độ tin cậy cao như chỉ thị SSR giữ vai trò quan trọng đối với việc nghiên cứu những biến đổi di truyền chưa được khám phá trong chè [29]

Hiện nay, diện tích và sản lượng chè được sản xuất và tiêu thụ trên thế giới không ngừng tăng Tuy nhiên, thách thức lớn nhất hiện nay đối với việc sản xuất chè

đó là vấn đề về sâu bệnh hại chè Một trong số những bệnh gây ra thiệt hại nhiều nhất

đến năng suất chè búp là bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans [5], [10] Một

hướng nghiên cứu mới hiện nay là sử dụng chỉ thị phân tử để nghiên cứu và đánh giá mức độ kháng bệnh phồng lá của chè, từ đó xác định chỉ thị phân tử liên kết với tính

kháng bệnh phồng lá và ứng dụng nó trong chọn giống [13]

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phát triển chỉ thị SSR phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm

Exobasidium vexans”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được mức độ đa dạng di truyền của một số giống chè có khả năng kháng bệnh phồng lá khác nhau được trồng tại một số tỉnh miền núi phía Bắc Việ

Lựa chọn được chỉ thị SSR liên kết với tính kháng bệnh phồng lá phục vụ

chọn giống chè kháng bệnh do nấm Exobasidium vexans

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Thu thập mẫu các giống chè có khả năng kháng bệnh phồng lá do nấm

Exobasidium vexans khác nhau ở một số địa phương ở miền Bắc Việt Nam

3.2 Thu thập thông tin về chỉ thị SSR sử dụng trong phân tích hệ gen cây chè Nhân bản các phân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi SSR

3.3 Phân tích tính đa dạng di truyền các giống chè có khả năng kháng bệnh phồng lá khác nhau dựa trên dữ liệu SSR

3.4 Xác định chỉ thị SSR đặc trưng và sự liên quan giữa chỉ thị SSR với tính kháng

bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY CHÈ (Camellia sinensis (L.) O Kuntze)

1.1.1 Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây chè

Cây chè thuộc ngành hạt kín (Angiospermae), lớp hai lá mầm (Dicotyleonae),

bộ Chè (Theales), họ Chè (Theaceae), chi Chè (Camellia), loài Camellia (Sinensis), tên khoa học là Camillia Sinensis (L) O Kuntze

Có nhiều bảng phân loại chè nhưng bảng phân loại được nhiều người công nhận nhất là bảng phân loại của Cohen Stuart (1919) cây chè được chia làm 4 thứ chè

chính: Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var Bohea), chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var marcophylla ), chè Shan (Camellia sinensis var Chan ), chè

Ấn Độ ( Camellia sinensis var atxamica ) [2]

Hiện nay có rất nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc của cây chè Theo Wight (1959), xuất phát điểm nguyên thủy của cây chè được cho là ở khoảng 29 độ vĩ Bắc và 98 độ kinh Đông, thuộc vùng thượng nguồn sông Irrawaddy – vùng đất giao nhau giữa Asam, bắc Myanmar, tây nam Trung Quốc và Tây Tạng [101] Kingdom

và Ward (1950) lại cho rằng xuất phát điểm của cây chè là ở tỉnh Vân Nam của Trung Quốc [47] Daraselia (1989) dựa trên cơ sở khoa học là học thuyết “Trung tâm khởi nguyên cây trồng” của Vavilop cũng cho rằng cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc [3] Theo một số nguồn tài liệu cổ thì vùng biên giới Tây Bắc nước ta nằm trong vùng nguyên sản của giống chè tự nhiên trên thế giới [59], [60]

Năm 1823, R Bruce phát hiện được những cây chè dại, lá to ở vùng Assam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng nguyên sản của cây chè là ở vùng Assam của Ấn Độ chứ không phải là ở Trung Quốc

Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phức catechin của lá chè từ các giống chè có nguồn gốc khác nhau và so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè và trên cơ sở đó xác minh nguồn

gốc cây chè Từ những biến đổi sinh hóa này của lá các cây chè mọc hoang dại và cây chè được trồng trọt chăm sóc, cho phép đi tới một kết luận mới "Nguồn gốc của cây chè chính là ở Việt Nam" [97]

Quốc gia đầu tiên trên thế giới phát triển sản xuất chè là Trung Quốc, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào những năm 805 sau Công Nguyên, vào Indonexia năm 1654, vào Ấn Độ năm 1780, vào Nga năm 1833, Malaixia năm 1914, những năm

1920 vào Châu Phi: Kenia, Malavi, Ghine Đến nay chè đã được trồng ở 58 quốc gia với quy mô khác nhau phân bố ở khắp năm châu lục như sau [2], [3]

Châu Á có hơn 20 quốc gia trồng chè bao gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanca, Indonexia, Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ, Bangladet, Iran, Myanma, Việt Nam, Thái Lan, Lào, Malaixia, Campuchia, Nepan, Philipin, Triều tiên, Apganistan, Pakistan Châu Phi có 21 nước trồng chè bao gồm: Kenia, Malavi, Uganda, Tanzania, Mozambich, Ruanda, Mali, Ghine, Morico, Nam Phi, Ai cập, Công Gô, Camarun, Đảo Reugniong, Tchat, Roderia, Abitxini, Buraudi, Maroc, Angieri và Zimbabue Châu Mĩ có 12 nước trồng chè bao gồm: Argentina, Braxin, Peru, Colombia, Ecuador, Guatemala, Paraguay, Jamaica, Mexico, Bolivia, Guyana và Mỹ Châu Đại Dương có 3 nước trồng chè bao gồm: Papua Tanghine, Fiji và Australia Châu Âu có 2 nước trồng chè bao gồm: Liên Xô cũ (Grudia) và Bồ Đào Nha [2], [3]

1.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới

Diện tích và sản lượng chè ngày càng tăng trên toàn thế giới Năm 1959 tổng diện tích trồng chè toàn thế giới là 830.200 ha và tổng sản lượng là 740.630 tấn Đến năm 2009 con số này đã lên tới 2.460.100 ha và tổng sản lượng 3.190.690 tấn Tính đến hết năm 2009, Trung Quốc là quốc gia có tổng diện tích chè lớn nhất thế giới chiếm 940.310 ha, tiếp đó là đến Ấn Độ: 440.500 ha, Srilanca: 210.070 ha, Kenia:

140.000 ha, Nhật Bản: 40.700 ha, Việt Nam: 100.200 ha (Nguồn: Theo FAO Strt Citation 2010) [27]

Hình 1.1: Sản xuất chè thế giới trong năm 2010

( Nguồn: ITC Annual Bullentin Suuplement, 2010)

Sản xuất chè đen trên thế giới dự kiến sẽ tăng 1,7% mỗi năm từ năm

2003 đến năm 2014, sản lƣợng này sẽ đạt con số 2,7 triệu tấn vào năm 2014 Kenya dự kiến sẽ tăng 2,4 % sản lƣợng chè sản xuất hàng năm và đạt 379.000 tấn vào năm 2014 Các quốc gia sản xuất chè với số lƣợng lớn khác bao gồm Malawi với sản lƣợng dự kiến đạt 49.000 tấn vào năm 2014, trong khi đó sản lƣợng đầu ra dự kiến năm 2014 của chè ở Uganda và Tanzania lần lƣợt đạt 38.000 tấn và 33.000 tấn [107]

Sản xuất chè xanh trên thế giới dự kiến sẽ tăng với tốc độ nhanh hơn so với chè đen 2,3% mỗi năm, nhƣng số lƣợng nhỏ hơn nhiều với tổng khối lƣợng dự tính của sản xuất chè xanh năm 2014 là 975.000 tấn Trung Quốc sẽ tiếp tục chiếm hơn 75% tổng sản lƣợng chè xanh của thế giới với công suất 740.100 tấn [107]

Xuất khẩu chè đen thế giới dự kiến sẽ đạt 1,3 triệu tấn trong năm 2014, phản ánh sự gia tăng bình quân hàng năm là 1,4% từ con số 1,1 triệu tấn năm 2003 Tổng kim ngạch xuất khẩu chè đen của khu vực Châu Phi dự kiến sẽ lên đến 518.000 tấn vào năm 2014 Viễn Đông sẽ chiếm một nửa còn lại của việc mở rộng xuất khẩu chè đen [107]

Bảng 1.1: Xếp hạng xuất khẩu chè thế giới từ năm 2008 đến 2011 (Đơn vị: tấn)

(Nguồn: FAOSTAT)

Xuất khẩu chè xanh của thế giới dự kiến sẽ tăng trưởng 2,8% mỗi năm đạt 275.000 tấn vào năm 2014 Trung Quốc dự kiến sẽ tiếp tục dẫn đầu với khối lượng 242.000 tấn, tiếp theo là Việt Nam với 28.000 tấn, và Indonesia với 5.800 tấn [107]

1.1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam

Việt Nam có diện tích trồng chè dao động khoảng 126.000 – 133.000 ha và thu hút khoảng 2 triệu lao động Việt Nam là nước xuất khẩu và sản xuất chè lớn thứ 5 thế giới, với kế hoạch sản xuất đạt 1,2 triệu tấn chè thô và xuất khẩu 200.000 tấn chè chế biến vào năm 2015 [104]

Hiện nay, nước ta có năm vùng sản suất chè chính bao gồm:

Vùng chè miền núi Tây Bắc: Gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu là hai tỉnh trồng chè lớn, giống chè trồng chủ yếu là Shan và Trung Du

Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn: Gồm các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Hòa Bình, Lào Cai, giống chè chủ yếu là Shan, Trung du, Assam

Vùng chè Trung du – Bắc Bộ: Gồm các tỉnh Thái Nguyên, Bắc Kạn, Phú

Thọ, Yên Bái, Hà Tây, giống được trồng chủ yếu là Trung Du, Assam và chè lai

Vùng chè Bắc Trung Bộ: Gồm các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, giống được trồng chủ yếu là chè Gay địa phương và chè Assam

Vùng chè Miền Nam: Chủ yếu trồng ở vùng Tây Nguyên như Lâm Đồng, Gia Lai, Kontum và Đắc Lắc, giống được trồng chủ yếu là chè Shan

Theo số liệu thống kê tổng cục hải quan Việt Nam, tổng sản lượng chè xuất khẩu của nước ta trong các năm từ 2010 đến 2014 là rất lớn Cụ thể, năm 2010 tổng sản lượng chè xuất khẩu của Việt Nam đạt 136.515 tấn, với tổng trị giá 199.979.491 USD Năm 2011 tổng sản lượng chè xuất khẩu đạt 133.916 tấn, với tổng trị giá 204.017.965 USD, giảm 1,9% về lượng nhưng tăng 2,02% về trị giá [105] Đến năm

2012 con số này đạt 146.708 tấn, trị giá 224.589.666 USD tăng 9,6% về lượng và tăng 10,1% về trị giá so với cùng kỳ năm trước [111] Trong 10 tháng đầu năm 2013 xuất khẩu chè của cả nước đạt 115.832 tấn, trị giá 186.682.873 USD giảm 5,5% về lượng và giảm 0,2% về trị giá so với cùng kỳ năm trước [110] Đến năm 2014, sản lượng xuất khẩu chè của Việt Nam ra thị trường thế giới vẫn rất lớn, chỉ tính riêng trong 2 tháng đầu năm 2014 đạt 16.435 tấn chè, trị giá 26.269.156 USD, giảm 12,93% về lượng và giảm 8,63% về trị giá so với cùng kỳ năm trước [106] Trong đó Pakistan, Đài Loan, Nga và Trung Quốc vẫn những thị trường mà Việt Nam xuất khẩu sản phẩm chè sang nhiều nhất trong 5 năm trở lại đây

1.1.3 Đặc điểm di truyền của cây chè Camellia sinensis (L.) O Kuntze

Chè là một loại cây công nghiệp được trồng khả phổ biến trên thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu về cây chè ở cấp độ phân tử Tuy nhiên, cho đến nay vẫn

chưa có nhiều thông tin về bộ gen của cây chè [87] Năm 2001, nghiên cứu của

Hanson cho thấy kích thước bộ gen cây chè vào khoảng 15.298 Mbp [60] Tuy nhiên, gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi năm 2006 trên các giống chè Nhật Bản đã cho thấy kích thước bộ gen của cây chè ước tính khoảng 4Gbase [87] Nghiên cứu tế bào học của Kondo năm 1979 đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡng bội (2n=30) [48]

Trong quá trình sống, các loài thuộc chi Camellia đã lai chéo với nhau thông

qua quá trình giao phấn để tạo ra các con lai mang vật chất di truyền hỗn tạp, cây

chè Camellia sinensis cũng không nằm ngoài xu hướng này Cây chè có thể lai tốt

với các giống hoang dại từ đó hình thành nên vốn gen của các giống hoang dại Trong thực tế rất khó xác định trong tự nhiên có tồn tại hay không một giống chè mang vật chất di truyền nguyên trạng mà không bị pha trộn Vì vậy khái niệm “cây chè” bao trùm tất cả các giống/dòng là con lai của các thứ chè [60]

1.2 BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans HẠI CHÈ

1.2.1 Tác nhân gây bệnh, phạm vi phân bố và lịch sử phát triển bệnh

Bệnh phồng lá hại chè gây ra bởi nấm Exobasidium vexans, đây là một loài

nấm sinh bào tử Nó chỉ ảnh hưởng đến lá non phần ngọn và ít ảnh hưởng đến phần thân cây do đó gây mất mùa nặng

Vị trí trong hệ thống phân loại của nấm Exobasidium vexans (Massee, 1898):

7 – 15,5 (mm) x 2,3 – 4,5 (mm) Bào tử đảm có thời gian tồn tại ngắn và khả năng sống sót trong khoảng 2 tuần [32], [33] Vòng đời của nấm được hoàn thành trong một thời gian ngắn của 11 – 28 ngày [4]

Hầu hết các loài chè đặc hữu của các vùng trồng chè của châu Á đều mắc phải bệnh này, ở châu Phi hay châu Mỹ không xác định tình hình nhiễm bệnh này Bệnh phát triển thuận lợi trong thời tiết nhiều mây, ẩm ướt Một số giống chè có chút khả năng kháng được bệnh này như: Chè Shan, giống Ấn Độ Hiện nay, đây là bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến các loài đặc hữu của tất cả các giống chè của khu vực Châu Á và ngày càng có xu hướng tăng lên [8] Bệnh gây hại nghiêm trọng hơn đối với các cây chè mới nảy mầm sau khi đốn tỉa vì khi đó tán cây chủ yếu là lá và cành non mới mọc thuận lợi cho sự nhiễm bệnh [4]

Bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans là một trong những bệnh ở lá được

biết đến sớm nhất của chè Nó được biết là xảy ra ở Ấn Độ kể từ năm 1863 và là một dịch bệnh lớn trên khắp Đông Bắc Ấn Độ, đến năm 1946 bệnh này nổ ra đến miền Nam Ấn Độ [91] và sau đó đến Sri Lanka trong năm sau [90] Sau đó lây lan sang Sumatra vào năm 1949 và Java vào năm 1951 [23] và các quốc gia sản xuất chè khác Hiện nay, bệnh phồng lá được coi là bệnh nghiêm trọng đối với các quốc gia trồng chè [61] Bệnh phát triển mạnh và gây mất mùa nghiêm trọng khi thời tiết mát mẻ, khí hậu ẩm ướt và có gió mùa

1.2.2 Đặc điểm phát sinh và diễn biến của bệnh

Bệnh phát triển thuận lợi ở độ ẩm tương đối cao (hơn 80%), nhiệt độ nằm trong khoảng (10 – 230C) Sự phát triển của các loại nấm trong mô tế bào chủ bằng cách tạo ra các giác mút Quá trình nhiễm bệnh xảy ra chủ yếu thông qua sự thâm nhập trực tiếp của lớp biểu bì [32] Đặc biệt là khi thời tiết có sương mù hoặc mưa phùn kéo dài từ 15 ngày trở lên Vào mùa xuân bệnh thường phát triển từ cuối tháng

2 đến đầu tháng 5, mùa thu vào cuối tháng 9 đến cuối tháng 10 Khi nhiệt độ không khí từ 250C trở lên, nắng nhiều và khô thì nấm gây bện này không phát triển được

Những nương chè trồng ở vùng cao 600 – 700 mét so với mặt biển bệnh phát sinh gây hại nhiều hơn Những nương chè quản lý không tốt, cỏ dại nhiều, khuất gió

và nhiều cây che bóng bệnh phát sinh và gây hại nhiều hơn

Bệnh cũng phát sinh gây hại nhiều hơn ở những nương chè bón nhiều phân đạm và nương chè trồng bằng các giống chè có bản lá to

Bệnh phồng lá là một bệnh nhiều chu kỳ nghĩa là có nhiều thế hệ các tác nhân gây bệnh được hoàn tất trong vòng một mùa vụ duy nhất Kết quả là, các giai đoạn

khác nhau vỉ bệnh có thể được nhìn thấy trên cùng một lá (hình 1.2)

Hình 1.2: Các giai đoạn khác nhau của bệnh phồng lá do nấm

Exobasidium vexans trên cùng một lá

A Giai đoạn ban đầu của nhiễm bệnh phồng lá

B Các vỉ bệnh đang phát triển

C Vỉ bệnh phát triển mạnh nhất

D Hoại tử của mô bị nhiễm bệnh.

Các tế bào ở các vùng bị nhiễm bệnh tăng lên về kích thước, các vỉ bệnh bao gồm các bó nhỏ gọn của sợi nấm sắp xếp theo búi dày đặc, bên dưới là lớp biểu bì lá Người ta ước tính có khoảng 10.000 bào tử đảm có thể tạo ra trên mỗi mm2

của tổn thương [54] Một vỉ tổn thương trưởng thành có thể sản xuất khoảng 2 triệu bào tử trong 24 giờ [41] Trong thời gian kết thúc mùa gây bệnh, nấm tồn tại dai dẳng trong các bụi cây đang phát triển ở những nơi ẩm, râm mát [68] hoặc các vỉ bệnh bị hoại tử [86], và trở thành hoạt động trong điều kiện khí hậu lý tưởng

Bệnh phồng lá là một bệnh đa chu kỳ Một chu kỳ bệnh kéo dài trong khoảng

11 – 28 ngày [31] Mô lá càng già càng ít nhạy cảm với sự nhiễm bệnh Bệnh phát sinh gây hại ở lá non, búp non và vết bệnh phân bố phần lớn ở mép lá Vết bệnh đầu tiên là chấm nhỏ hình giọt dầu, màu vàng nhạt kích thước đường kính dưới 0,5 mm Cùng với sự phát triển của bệnh, các vết bệnh lớn lên màu nhạt dần và mở rộng thành hình tròn với đường kính 3 – 12 mm và bề mặt lá bóng lên tại chỗ bị tổn thương Sau

khi nấm xâm nhập vào lá khoảng 10 – 15 ngày sau, lá phồng lên và mặt trên lá lõm xuống, phía trên mặt có hạt phấn màu trắng Sau một thời gian khoảng 5 – 7 ngày vết phồng vỡ ra giải phóng một lớp phấn trắng hoặc hồng hạt, chính là các bào tử của nấm Các lá bị nhiễm bệnh nặng thường bị gấp hoặc cuộn xoắn lại do sự phát triển mạnh của các vết phồng Cuối cùng các khu vực nhiễm bệnh bị hoại tử và các mô bị chết Sau khi các vết phồng vỡ vết bệnh chuyển thành màu nâu, lá chè bị co rúm Nếu

bị nhiễm bệnh nặng hơn nữa sẽ dẫn đến hiện tượng búp non bị ảnh hưởng và chết mầm Bệnh làm giảm năng suất, chất lượng và làm chậm quá trình tái sinh trưởng các lứa chè sau

Hình 1.3: Các giai đoạn của bệnh phồng lá

A Giai đoạn ban đầu của nhiễm bệnh phồng lá, xuất hiện các điểm mờ nhỏ trên trên và dưới

bề mặt lá

B Các vỉ bệnh phát triển đầy đủ gây tổn thương bề mặt lá, nấm sắp sinh bào tử

C Một chiếc lá bị nhiễm nấm Exobasidium vexans rất nặng với rất nhiều vỉ bệnh phồng lá

D Nhiễm bệnh nặng khiến lá bị cuộn lên

E Cái chết của các mô bị nhiễm bệnh

F Hoại tử và nhiễm trùng cuống.

1.2.3 Thiệt hại do bệnh phồng lá ở cây chè

Thiệt hại về năng suất

Exobasidium vexans có khả năng gây mất mùa nghiêm trọng Vì nấm nhiễm

chủ yếu vào lá non trong thời gian chè được thu hoạch và gây thiệt hại trực tiếp Chè

ở miền nam Ấn Độ bị mất mùa rất lớn trong những năm đầu của bệnh phồng lá [85] Đến giữa những năm 1948 và 1952 thiệt hại hàng năm do bệnh gây ra lên tới 18.000 tấn chè trước khi các biện pháp kiểm soát được thực hiện đầy đủ trên quy mô rộng [93] Lợi ích từ các biện pháp kiểm soát dịch bệnh phồng lá trên cây chè được ghi nhận ở các mức độ khác nhau trong khoảng 57 – 139% tùy thuộc vào cường độ của biện pháp bảo vệ [94]

Bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans gây ra thiệt hại nghiêm trọng ở Sri

Lanka Nghiên cứu trong vòng 42 tháng cho thấy khi chè không được bảo vệ trước bệnh phồng lá thì thiệt hại do bệnh gây ra là 33% tổng sản lượng thu hoạch [55] Ở Indonesia, các vùng trồng chè nằm ở độ cao trung bình, thiệt hại do bệnh phồng lá gây ra trên chè dao động từ 20 đến 25% vì chè được bảo vệ ở mức tương đối [76] Trong đầu những năm 1950, Indonesia bị mất khoảng 10.000 tấn chè vì bệnh phồng

lá [23] Nếu bệnh phồng lá không được kiểm soát sẽ dẫn đến sự mất mát hàng năm là 43% năng suất của cây chè [66]

Thiệt hại về chất lượng

Ngoài gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất đối với cây chè, bệnh phồng lá cũng làm giảm đáng kể chất lượng của chè Lá chè bị bệnh nếu đem chế biến sẽ dẫn đến giảm chất lượng chè do một số đặc điểm sinh hóa đã bị thay đổi khi nhiễm bệnh [9] Phân tích các thông số chất lượng của Chakraborty và cs (2002 ) cho thấy hàm lượng phenol, catechin, nitơ tổng, axit amin và các chất diệp lục, cũng như hoạt động của polyphenol oxidase giảm xuống trong chè tỷ lệ thuận với sự gia tăng mức độ nghiêm trọng bệnh Tương tự như vậy, hàm lượng theaflavins, thearubigins, caffeine, thành phần hương thơm và các chất polyme cao phân tử cũng giảm trong các sản phẩm chè được chế biến từ lá bị nhiễm bệnh [18]

Sharma và cs (2011) cũng đã báo cáo sự giảm hàm lượng catechin, thành phần hương vị 2 - phenylethanol cũng như trong giảm hoạt động của enzyme prephenate

dehydratase trong búp chè bị nhiễm nấm Exobasidium vexans so với hàm lượng các

thành phầm trên ở chồi khỏe mạnh [81] Tuy nhiên, một số tác giả khác cho rằng một

số nhiễm trùng thực sự có thể dẫn đến sự gia tăng chất lượng [72]

1.2.4 Một số nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium

vexans ở chè

Cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans của cây chè từ lâu

đã là mối quan tâm của các nhà nghiêm cứu nhằm mục tiêu hiểu biết rõ hơn về các phản ứng kháng bệnh phồng lá để phục vụ cho công tác chọn giống chè Các phản ứng kháng bệnh phồng lá được đặc trưng bởi phản ứng phiên mã của cây chè nhiễm

Exobasidium vexans Sự hiểu biết toàn diện về hệ thống các gen, protein và các phân

tử nhỏ và mô tả đặc điểm của các phân tử này làm nền tảng cho việc tìm hiểu cơ chế bảo vệ thực vật khỏi các stress do phản ứng sinh lý căng thẳng hoặc do tác nhân gây bệnh phát triển gây ra [56]

Chitinase trong mẫu thực vật được tạo ra bởi nhiều yếu tố khác nhau, đặc biệt

là do nhiễm nấm [49] Protein kháng nấm như chitinases và β-1,3-glucanase ức chế nấm tăng trưởng bằng cách làm giảm chitin và (1,3)-β-glucan, cả hai thành phần chính cấu trúc thành tế bào polysaccharides trong phát triển sợi nấm [51] Jeyaramraja và cs (2005) phát hiện ra rằng mức độ biểu hiện chitinase ở các giống chè kháng bệnh phồng lá cao hơn so với các giống nhạy cảm [44] Các sản phẩm chitinolytic là nguyên liệu để sản xuất các hợp chất phòng thủ như phytoalexin và SAR [16] Hơn nữa, cảm ứng của chitinase thường phối hợp với cảm ứng cụ thể của β-1,3-glucanase và protein PR khác [20] Ngoài ra, vai trò của chitinase có thể được tăng cường bởi β-1,3-glucanase [58] Sự giảm xuống của β-1,3-glucan trong thành tế bào góp phần làm thành tế bào của nấm bất ổn cũng như kích thích phản ứng tự vệ của tế bào miễn dịch elicitors liên quan [51] Hoạt động kháng nấm của β-1,3-

glucanase đã được nghiên cứu xác định cả in vitro [77] và in vivo [43] qua các nghiên

cứu biến đổi di truyền

Như vậy, sự gây ra thiếu hụt chitinase và glucanase của vách tế bào nấm là một cơ chế phòng thủ chủ động của hệ miễn dịch chống bệnh phồng lá trong chè

Gen TLP PdPR5-1, ngoài đặc tính kháng nấm nó còn có vai trò trong việc kích hoạt khác con đường miễn dịch bao gồm cả sản xuất phytoalexin chống lại

necrotrophic nấm Monilinia fructicola [25]

Một gen mã hóa protein vết thương WIN2 cũng đã được nghiên cứu và nhận thấy điều hòa tăng đáng kể trong bài nhiễm P-1258 Điều này cho thấy nó vai trò tiềm

năng trong kháng Exobasidium vexans Protein WIN2 là một họ protein liên quan đến

các mầm bệnh trong cấu trúc phân tử có chitin, và được biết đến có hoạt tính kháng nấm [84]

Các gen khác có vai trò bảo vệ chè kháng lại bệnh phồng lá theo các cơ chế khác cũng đã được tìm thấy bao gồm gen mã hoá protein Avr9/Cf-9, proteinase aspartic, cystatin, cytochrome P450 và protein P12 Aspartic proteinase (AP) và cystatin là các lớp protein kháng khuẩn phân giải protein trong thực vật và được biết đến là có liên quan đến bệnh cũng như cơ chế đề kháng chống lại bệnh [36], [37]

Cystatins thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại căng thẳng sinh học do có khả năng ức chế proteinases từ các kẻ thù khác và tác nhân gây bệnh Chúng có liên quan đến các tác nhân gây bệnh cũng như stress phi sinh học gây chết tế bào [12] Một số phytocystatins đã được mô tả có hoạt động kháng nấm [19], [57], [83]

Cytochrome P450 cũng đã được xác định tham gia vào một loạt các phản ứng oxy hóa dẫn đến sự sinh tổng hợp phenylpropanoids, tecpen, và alkaloid Các thành phần này đóng một vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất để bảo vệ thực vật thông qua hoạt động tổng hợp thành tế bào và các thành phần bảo vệ trung gian [75]

Protein P12 liên quan đến bệnh phồng lá cũng đã được nghiên cứu theo một

hướng khác đó là trong cây trồng sau khi nhiễm nấm Exobasidium vexans Protein 12

kDa (quy định là P12 ), đặc trưng trong cam quýt, đã được tìm thấy có tích lũy nhiều trong lá, gỗ và chất lỏng của cây bị nhiễm bệnh phồng lá Từ đó Protein P12 được cho rằng đóng một vai trò nào đó trong bộ máy để đáp ứng miễn dịch kháng bệnh [17], [45], [46] Sự điều hoà tăng lên về hoạt động của một gen mã hoá protein tiền thân cuả protein P12 có liên quan đến bệnh phồng lá cũng đã được nghiên cứu và

đưa ra giả thuyết có liên quan đến cơ chế bảo vệ chè Nó được tìm thấy có điểm tương tự với protein expansin [17], [45] Tuy nhiên, để làm sáng tỏ vai trò tiềm năng

của nó trong tương tác kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans của chè cần

phải điều tra, nghiên cứu thêm các đặc trưng về truyền tín hiệu

Các protein thụ thể liên quan đến sự tiếp nhận của các tín hiệu tác nhân gây bệnh bao gồm các thụ thể giàu leucine như protein kinases và protein serine/threonine kinase (STKs) Các protein này đóng vai trò trung tâm trong việc tiếp nhận các tín hiệu tác nhân gây bệnh và kích hoạt của cơ chế bảo vệ tiếp theo ở thực vật Các thụ thể giàu leucine đóng vai trò quy định sự phát triển của hàng rào bảo vệ thực vật như quá trình tăng sinh tế bào, duy trì tế bào gốc, các phản ứng tự vệ không chủ động, phản ứng gây tổn thương và cộng sinh [89]

Quá trình oxi hoá khử tham gia vào tăng cường tín hiệu cho sự nhiễm bệnh và hạn chế sự tăng trưởng lây lan của mầm bệnh Sự cảm ứng của phản ứng kháng chống lại bệnh phồng lá trong chè có thể tương quan với sự chết của các tế bào vùng

bị nhiễm Quá trình oxi hoá tăng lên sẽ kéo theo sự kích hoạt các gen mã hoá enzyme chống oxi hoá trong các mô xung quanh vùng bị nhiễm bệnh ban đầu để bảo vệ các tế

bào xung quanh chống lại sự oxi hoá [50] Khi cây chè bị nhiễm Exobasidium vexans

sẽ gây ra sự biểu hiện của một số gen mã hoá protein hoặc enzyme tham gia vào quá trình ngăn cản sự oxi hoá Chúng bao gồm thioredoxin m, amine oxidase, hypersensitive induced response protein, hydrogen peroxide-induced protein, glutathione S-transferase, catalase, Arabidopsis thaliana Nudix hydrolase protein và gen quinone oxidoreductase Thioredoxin m đã được tìm thấy và được đánh giá gây

ra đáp ứng cao với nhiễm Exobasidium vexans Thioredoxins (TRX) rất phổ biến và

có liên quan đến quy định về môi trường oxi hóa khử của tế bào và đóng một vai trò

cơ bản trong tín hiệu nội bào chống oxy hóa [40], [96] Nghiên cứu đầu tiên về Thioredoxin có liên quan đến khả năng kháng bệnh thực vật được đưa ra bởi Rivas và

cs năm 2004 [73]

Sự nhiễm bệnh thường dẫn đến sự thay đổi trong con đường trao đổi chất khác nhau Tác nhân gây bệnh đòi hỏi một sự thay đổi lớn trong hoạt động trao đổi chất hơn là thay đổi một vài cơ chế bảo vệ liên quan đến gen [22]

Các protein hoặc enzyme liên quan đến con đường trao đổi chất khác đại diện cho một số con đường sinh hóa như carbohydrate, chất béo, năng lượng, chuyển hóa protein, chuyển hóa axit nucleic để đáp ứng với bệnh phồng lá Một số trong các enzyme tham gia trong việc duy trì chất chuyển hóa dẫn đến sự điều chỉnh hoặc thay đổi trong quá trình trao đổi chất để vượt qua stress do bệnh gây ra Mặc dù vai trò của gen được biết đến ít hơn so với vai trò trực tiếp của tất cả các protein trong cơ chế bảo vệ Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu cho thấy sự giảm xuống của các gen liên quan đến sự trao đổi chất thứ cấp Thay đổi trong chuyển hóa carbohydrate trong phản ứng bệnh cũng được ghi nhận Các protein khác nhau hoặc các enzyme liên quan đến sự trao đổi chất carbohydrate được xác định bao gồm β-D-glucosidase, galactinol synthase, enzyme phân giải tinh bột nhóm II, polygalacturonaza và phospholipase C (PLC5) Enzyme β-glucosidase là một glycosyl hydrolase tham gia vào tổng hợp β-glucan trong lignification, sắc tố sự trao đổi chất Nó đã được làm rõ vai trò tham gia vào cơ chế bảo vệ hóa học chống lại tác nhân gây bệnh nhiễm trùng [69], [82]

Có sự điều hòa tăng cường phiên mã của một loạt các gen mã hóa các protein vân chuyển trong tế bào đặc biệt là các protein vận chuyển lipit (lipid transfer

proteins – LPTs) khi chè bị nhiễm nấm Exobasiddium vexans Các protein vận

chuyển như vậy gồm chất ức chế protease, protein và họ protein vận chuyển lipit, glycolipit màng, glycolipit vận chuyển, protein vận chuyển acyl và họ protein yếu tố

14 màng tế bào, họ protein vận chuyển phosphoglyceride… Các protein này đã được

tìm thấy những kiểu khác nhau khi nhiễm Exobasiddium vexans Đây là các protein vận

chuyển nhỏ, phổ biến, protein vận chuyển lipit có khả năng trao đổi lipid giữa màng và tạo điều kiện vận chuyển lipit giúp cho thành tế bào hình thành lớp biểu bì và sinh tổng hợp chất nền bề mặt, qua đó tăng cường cấu trúc rào cản chống lại một loạt các tấn công của các tác nhân gây bệnh Kader (1996) đã đề xuất rằng các protein vận chuyển lipit của thực vật có vai trò thiết yếu trong việc tăng cường sinh tổng hợp cutin thành tế bào thông qua lắng đọng cutin Một số báo cáo đã mô tả sự tham gia của LTPs trong tương tác mầm bệnh với thực vật và các phản ứng phòng thủ Liu và cs (1999) thấy rằng LTP từ lúa mạch và ngô có thể ức chế nhiều loại tác nhân gây bệnh [53]

Các protein vận chuyển lipit đóng vai trò làm dày thêm lớp biểu bì của lá chè

bị bệnh phồng lá, do đó bảo vệ lá chè khỏi sự xâm nhập của nấm Ngoài ra còn nhận thấy sự điều hòa tăng cường biểu hiện của các protein huyết tương bên trong màng tế bào (plasma membrane intrinsic protein - PIP), họ các protein aquaporin MIP đóng một vai trò trung tâm trong mối quan hệ giữa nước và thực vật, biểu hiện thông qua phản ứng của thực vật đối với những điều kiện khắc nghiệt khác nhau, đặc biệt là hạn hán Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen aquaporin được tăng cường hoạt động trong quá trình tương tác gây bệnh cho thực vật Mysore và cs (2003) đã báo cáo biểu hiện của bốn aquaporin / tonoplast protein nội tại trong phản ứng kháng của

cà chua với Pseudomonas syringae [62] Werner và cs (2001) đã chỉ ra có sự liên

quan giữa aquaporins với các hoạt động của kênh vận chuyển nước trong cà chua khi chịu tương tác của vi khuẩn gây bệnh Mặc dù vai trò thực tế của quá trình vận chuyển nước trong phản ứng phòng vệ thực vật vẫn chưa được làm sáng tỏ Tuy nhiên, có thể đưa ra giả thuyết rằng trong chè, các aquaporins hoặc PIPs đóng vai trò quan trọng trong quá trình tương tác với các loại nấm bệnh phồng lá và nước cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển tác nhân gây bệnh trong mô thực vật

Một số nghiên cứu còn nhận thấy sự gia tăng đáng kể trong biểu hiện của protein vận chuyển ATP - binding cassette (ABC) trong các mẫu chè bị nhiễm bệnh

phồng lá do nấm Exobasidium vexans Đây là một lớp chính của ATP – powered vận

chuyển, chúng ít được mô tả đặc điểm và chưa được hiểu nhiều về chức năng sinh lý Những protein này được giả thuyết là tham gia vào giải độc của thuốc diệt cỏ và thuốc diệt nấm cũng như việc vận chuyển hợp chất bảo vệ thực vật [21]

Thành tế bào phát triển dày lên có liên quan đến khả năng tăng cường phản ứng kháng chống lại một loạt các tác nhân gây bệnh Quá trình sửa đổi trong mạng lưới tế bào được xúc tác bởi một số enzyme Trong đó, enzyme Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases (XTHs) tham gia vào việc tổ chức lại thành tế bào bằng cách xúc tác phân chia và tái nhập trở lại của chuỗi xyloglucan [88] Các nghiên cứu cho thấy có sự điều hòa tăng đáng kể trong biểu hiện của XTH đối với các cây

chè bị nhiễm Exobasidium vexans Các chức năng của XTHs chủ yếu liên quan đến

khả năng phát triển của cây trồng và cây thực phẩm Cơ chế cảm ứng của gen XTH

để đáp ứng chống lại dịch bệnh và vai trò của chúng đối với tác nhân gây bệnh xâm hại vẫn chưa được làm sáng tỏ Tuy nhiên, rất có thể XTHs tham gia vào duy trì chức năng của các protein tham gia vào phát triển tế bào, góp phần vào việc đề kháng chống nấm thâm nhập và phát triển gây bệnh trong tế bào

Các biến đổi về thành tế bào khác như họ protein hydroxyproline-rich glycoprotein (HRGP), họ protein methyltransferase và họ protein galactosyltransferase đã được tăng cường biểu hiện để đáp ứng với nhiễm

Exobasidium vexans Nồng độ cao của H2O2 góp phần tăng cường độ vững chắc của cấu trúc thành tế bào bằng cách thúc đẩy sự hình thành liên kết của các protein ngoại bào như HRGPs [15] Các mối liên kết chéo làm cho HRGPs không hòa tan, khiến thành tế bào khó bị tấn công bởi các enzyme thủy phân tiết ra bởi tác nhân gây bệnh Các mối liên kết chéo của HRGPs có vai trò tích cực trong các phản ứng bảo vệ cây trồng Các protein giữ cả hai chức năng trong việc xác định cấu trúc cụ thể của thành

tế bào và tham gia vào sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng Từ đó, chúng góp phần bảo vệ cây trồng chống lại các tác nhân gây bệnh [28]

Họ các protein Methyltransferase và galactosyltransferase liên quan đến sinh tổng hợp lignin và polysaccharides thành tế bào Do đó, chúng có khả năng tham gia vào phản ứng kháng để chống lại tác nhân gây bệnh Như vậy, sự vững chắc của thành tế bào giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức đề kháng của chè chống lại chủng nấm gây bện phồng lá bằng cách cung cấp một rào cản vật lý để nấm

Exobasidium vexans không xâm nhập và gây bệnh được

Kết quả của quá trình quang hợp là cây tổng hợp được sản phẩm dự trữ saccharides hoặc đường Đó là một nguồn cung cấp năng lượng chính của tế bào thực vật Quan sát sự điều hòa phiên mã của gen mã hóa tiểu đơn vị Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) nhận thấy có sự tăng đáng kể sản phẩm

phiên mã để đáp ứng lại khi chè bị nhiễm Exobasidium vexans Đây là gen mã hóa quy

định tổng hợp sản phẩm protein liên quan đến quá trình quang hợp và sinh tổng hợp chất diệp lục Sản phẩm của quá trình phiên mã này là một loại enzyme có vai trò quan trọng với quá trình quang hợp Ngoài ra, enzyme này còn được biết đến với khả năng tham gia trong đáp ứng stress nhiệt, muối, mầm bệnh và phản ứng sinh lý khác [100]

Các nghiên cứu gần đây nhất là về tổng hợp flavonoid trong quá trình nhiễm bệnh Trong các lá bị nhiễm bệnh, nhận thấy sự gia tăng hoạt động của một số enzyme và giảm hàm lượng chlorophyll và carotenoid [87] Nghiên cứu khảo nghiệm

sơ bộ đối với hàm lượng phytoalexin liên quan đến Exobasidium vexans cũng đã

được nghiên cứu Đây là các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, có tính kháng đối với vi sinh vật, được tạo ra do sự nhiễm bệnh hoặc stress sinh học [63] Vai trò của các chất phenolic trong kháng bệnh cũng được nghiên cứu [95], [65]

Nghiên cứu cho thấy có sự chênh lệch đáng kể hàm lượng epicatechin trong các mẫu giống chè kháng tốt bệnh phồng lá so với mẫu giống chè mẫn cảm Cụ thể có

sự cao hơn đáng kể của epicatechin (22mg/g) trong mẫu của giống kháng bệnh so với mẫu của giống mẫn cảm (10mg/g) Điều này cho thấy sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của epicatechin trong cơ chế đề kháng của chè chống lại bệnh phồng lá Theo Punyasiri và cs (2004) và (2005) thì khả năng tăng sức đề kháng của một số giống

chè đối với Exobasidium vexans có thể là do mức độ cao hơn của epicatechin trong

chè hoặc thay đổi thành phần proanthocyanidin [70], [71] Mức tăng của epicatechin được tìm thấy trong giống chè kháng bệnh phồng lá, trong khi mức độ epigallocatechin gallate cao hơn các giống mẫn cảm [70], [71] Theo đó, họ cho rằng epicatechin đóng một vai trò quan trọng trong việc đề kháng chống căn bệnh này trong khi methylxanthine có thể đóng một vai trò trong việc khởi đầu sự nhiễm bệnh

và tấn công của nấm Họ cho rằng sự đề kháng cao của giống chè khác nhau có liên quan với mức độ tương tự kháng nguyên giữa tế bào chủ và tác nhân gây bệnh Trong

khi nghiên cứu khả năng gây bệnh của Exobasidium vexans trong 30 giống chè trồng

thương mại, họ quan sát thấy rằng các vỉ bệnh mở rộng nhanh chóng trong ở các giống mẫn cảm, trong khi đó chúng bị hạn chế phát triển ở các giống kháng tốt

Đã có một vài nghiên cứu về đặc tính kháng bệnh phồng lá do nấm

Exobasidium vexans của các giống chè nhưng những hiểu biết về cơ chế phản ứng

phòng vệ của cây chè và các hiện tượng liên quan đang diễn ra ở cấp độ phân tử là rất hạn chế Sự thay đổi về sinh hóa và sinh lý trong chè ở thời điểm trước và sau khi xảy

ra sự nhiễm nấm Exobasidium vexans đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng

đến sức đề kháng với bệnh Jeyaramraja và cs (2005) đã nghiên cứu vai trò của các

rào cản vật lý và PR- protein chitinase đối với khả năng kháng bệnh phồng lá của chè

Họ quan sát thấy rằng các cây kháng bệnh tốt có lớp biểu bì dày hơn và tần số của lỗ khí thấp hơn so với những cây mẫn cảm Họ cũng tìm thấy rằng mức độ biểu hiện chitinase cao hơn ở các cây kháng bệnh khi so sánh với một trong những cây nhạy cảm [44]

Ajay và Baby (2010) cũng đã cố gắng để tạo ra sức đề kháng hệ thống trong

chè đối với Exobasidium vexans thông qua sử dụng các hóa chất elicitors ASM

(acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7-carboxylic acid S-methyl ester) và axit salicylic Điều trị bằng ASM kích hoạt các hoạt động của các enzyme bảo vệ như phenylalanine ammonia lyase, peroxidase và β-1,3-glucanase trong cây chè trẻ, và kết quả là cảm ứng khả năng đề kháng SAR – systemic acquired resistance [5], [6]

1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

1.3.1 Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong phân tích hệ gen và chọn giống

Về nguyên tắc, một chỉ thị DNA lý tưởng là chỉ thị thỏa mãn các yêu cầu: cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, thậm chí phân

bố trên toàn bộ hệ gen, tập tính chọn lọc trung tính (trình tự DNA của cơ thể nào cũng là trung tính với các điều kiện môi trường), dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một chỉ thị phân tử nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện trên [1], [99]

Chỉ thị phân tử DNA gồm chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism – Đa hình độ dài các đoạn được cắt bằng enzyme giới hạn), chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn), chỉ thị SSR (MS) hay còn gọi SSR (Simple Sequence Repeat – Các trình tự lặp lại đơn giản), chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – Đa hình độ dài các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên), chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các đoạn DNA được nhân bản có chọn lọc), và chỉ thị ISSRs (Inter – Simple

Sequence Repeats) [78], chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vùng đã biết trước trình tự), chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)

1.3.2 Chỉ thị phân tử SSR

Chỉ thị SSR hay chỉ thị vi vệ tinh MS, là chỉ thị để nhân những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn [52] Trong quá trình tiến hóa, số lượng các đơn vị lặp lại của vi vệ tinh có thể được thay đổi nhanh chóng Điều này làm cho tạo ra một số lượng lớn các alen của mỗi locus SSR để phân tích đa hình quần thể [64] Số lần lặp lại khác nhau làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau Hiện tượng các SSR trong

cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotit trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi và số lượng đơn

vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn [35] Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể Chúng có vai trò điều hoà hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong điều hoà phân bào có thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật

Bản chất đa hình của SSR là được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen, nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Ưu điểm khi sử dụng kỹ thuật SSR là nó cho đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR Những chuỗi đa hình đơn giản này đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật [79]

SSR là công cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song nhược điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài nhất định [34].Trong thực tế, chỉ thị này đã được

sử dụng trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại Kỹ thuật này được sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức

độ đa hình các alen thuộc cùng một locus

Các DNA vi vệ tinh hay các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeats – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã được nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền, ước tính dòng chảy gen