3. Nội dung nghiên cứu
3.1.2.6.Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S
Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR với cặp mồi TMSE-4C08S đƣợc thể hiện trên hình 3.7. Phân tích hình 3.7 cho thấy số lƣợng phân đoạn DNA đa hình là 2. Ở tất cả các giếng chứa sản phẩm PCR-SSR đều có 1 phân đoạn DNA kích thƣớc khoảng 215bp, còn lại ở một số giếng còn thấy xuất hiện 1 phân đoạn DNA DNA kích thƣớc khoảng 240bp. Mẫu cho số lƣợng phân đoạn DNA nhiều nhất là 2 phân đoạn DNA ở các giếng số 2, 4, 6, 8, 9, 10, 15, 17, 18, 19, 21, 24, 25, 26, 27, 29 tƣơng ứng với các giống/dòng: DT1(DT), KT(DT), LDT2(SC), HBB(SC), Shan(SL),
1000
500
300
JBK(SC), PVT(SC), CH(DH), DT1(TC), LDT1(TC), PVT(TC), KT(TC) ,LDT1(DT), KT(DH), LDT(DH), LDT1(LS).
Các giếng còn lại chỉ cho 1 phân đoạn DNA duy nhất là giếng số 1, 3, 5, 7, 11, 12, 13, 14, 16, 20, 22, 23, 28, 30 tƣơng ứng với các giống/dòng: HNK(DT), Tri- 777(DT), Amp(DT), BT(SC), PT95(SC), TD(SC), PH8(SC), Amp(SC), CH(DT), CH(TC), LDT1(TQ), PH1(TQ), Tri-777(DH), Shan(YB). Phân đoạn DNA lớn nhất có kích thƣớc khoảng 240bp, phân đoạn DNA nhỏ nhất có kích thƣớc khoảng 215bp.
Hình 3.7: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S.
Ký hiệu: MK. Marker 0,5kb; 1. HNK(DT); 2. DT1(DT); 3. Tri-777(DT); 4. KT(DT);
5. Amp(DT); 6. LDT2(SC); 7. BT(SC); 8. HBB(SC); 9. Shan(SL); 10. JBK(SC); 11. PT95(SC); 12. TD(SC); 13. PH8(SC); 14. Amp(SC); 15. PVT(SC); 16. CH(DT); 17. CH(DH); 18. DT1(TC); 19. LDT1(TC); 20. CH(TC); 21. PVT(TC); 22. LDT1(TQ); 23. PH1(TQ); 24. KT(TC); 25. LDT1(DT); 26. KT(DH); 27. LDT(DH); 28. Tri-777(DH);
29. LDT1(LS); 30. Shan(YB).
3.1.2.7. Tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA xuất hiện
Với 6 phản ứng PCR-SSR đƣợc thực hiện, điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 4%, gel sau điện di đƣợc nhuôm với Ethydium bromide và soi dƣới máy soi gel tia UV để kiểm tra sản phẩm. Kết quả điện di cho thấy thu đƣợc tất cả 271 phân đoạn DNA trong 21 loại phân đoạn DNA từ 30 giống/dòng chè nghiên cứu. Kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản nằm trong khoảng 120bp đến 350bp. Số lƣợng các phân đoạn tƣơng ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng tử 2 đến 5 phân đoạn DNA.
1000
500
300
Trong đó cặp mồi TMSE-11H07S và TMSE-4C08S nhân bản đƣợc ít nhất (2 phân đoạn). Cặp mồi TMSE-10H08S nhân bản đƣợc 3 phân đoạn. Sau đó đến cặp mồi TMSE-18A10T nhân bản đƣợc số phân đoạn nhiều hơn (4 phân đoạn). Cặp mồi TMSE-11D02T và TMSE-31E06S nhân bản đƣợc số phân đoạn nhiều nhất (5 phân đoạn).
Qua phân tích sản phẩm điện di của phản ứng PCR-SSR với 6 cặp mồi SSR đặc hiệu cho chè với 30 mẫu chè nghiên cứu nhận thấy cả 6 cặp mồi đều cho tính đa hình với các mức độ đa hình khác nhau thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 6 cặp mồi SSR.
Cặp mồi
Số phân đoạn DNA được nhân
bản Số phân đoạn DNA đa hình Tỷ lệ % các phân đoạn đa hình TMSE-11D02T 5 5 100 TMSE-10H08S 3 3 100 TMSE-11H07S 2 1 50 TMSE-31E06S 5 5 100 TMSE-18A10T 4 4 100 TMSE-4C08S 2 1 50
Qua bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ xuất hiện các phân đoạn DNA đa hình khi sử dụng 6 cặp mồi SSR là rất cao. Cả 6 cặp mồi đều cho tỷ lệ đa hình cao của các phân đoạn DNA nhân lên. Trong đó có 4 cặp mồi cho tỷ lệ các phân đoạn DNA đa hình là 100% bao gồm TMSE-11D02T, TMSE-10H08S, TMSE-31E06S và TMSE-18A10T. Hai cặp mồi còn lại cho tỷ lệ các phân đoạn DNA DNA đa hình thấp hơn ở mức 50% là các cặp mồi TMSE-11H07S và TMSE-4C08S.
3.2. PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ KHÁC NHAU
Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.1 phân tích tính đa dạng di truyền giữa 30 giống/dòng chè nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích SSR với 6 cặp mồi chúng tôi đã xác định đƣợc hệ số sai khác giữa từng cặp giống/dòng chè nghiên cứu (Bảng 3.5).
Bảng 3.5 cho thấy, hệ số sai khác di truyền của 30 giống/dòng chè giao động trong khoảng 0% đến 9,639%. Trong đó có 5 cặp giống/dòng có hệ số sai khác di truyền nhỏ nhất là các cặp KT(DT) và KT(TC); LDT1(DT) và LDT1(DH); CH(DT) và CH(TC); Shan(SL) và Shan(YB); Tri-777(DT) và Tri-777(DH) với hệ số sai khác là 0%. Các cặp có hệ số sai khác di truyền lớn nhất là Amp(DT) và LDT2(SC), HBB(SC) và LDT2(SC), JBK(SC) LDT2(SC), PT95 (SC) và LDT2(SC) hệ số sai khác di truyền đều là 9,639%.
Sau khi phân tích kết quả, tôi tiến hành xây dựng sơ đồ hình cây (hình 3.8) để chỉ ra mức độ sai khác di truyền của các giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu. Mức độ khác nhau đƣợc biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các giống/dòng. Các giống/dòng có hệ số tƣơng đồng di truyền cao đƣợc xếp vào một nhóm, giữa các nhóm lại có sự liên kết với nhau thể hiện qua mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các nhóm.
Hình 3.8: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 30 giống/dòng chè có phản ứng khác nhau với bệnh phồng lá dựa trên chỉ thị SSR.
Phân tích sơ đồ hình cây ở hình 3.8 cho thấy 30 giống/dòng chè nghiên cứu đƣợc chia thành hai nhánh lớn, khoảng cách di truyền của hai nhóm này là 42% (1 – 0,58).
Nhánh thứ nhất bao gồm các giống/dòng có tính kháng trung bình với bệnh phồng lá là : Tri-777 (DT); Tri-777 (DH) và LDT2 (SC) với hệ số tƣơng đồng di truyền giao động từ 85,7% đến 100%.
Nhánh thứ hai chia làm hai nhánh phụ với khảng cách di truyền là 35,5%. Trong đó: Nhánh phụ thứ nhất gồm các giống/dòng chè Amp(DT), Amp(SC), Shan(SL), Shan(YB) với hệ số tƣơng đồng di truyền giao động từ 83% - 100%. Nhánh phụ thứ hai lại đƣợc chia thành hai nhóm với khoảng cách di truyền là 30%. Trong đó:
Nhóm 1 bao gồm các giống/dòng chè JBK(SC), PT95(SC), HBB(SC) với hệ số tƣơng đồng di truyền giao động từ 76,5% - 91%. Nhóm 2 lại đƣợc chia làm hai nhóm phụ trong đó: Nhóm phụ 1 gồm các giống/dòng PH1(TQ), CH(TC), CH(DT), PH8(SC), LDT1(DH), LDT1(DT), LDT1(TQ), LDT1(LS), LDT1(TC), CH(DH), PVT(TC), PVT(SC) với hệ số tƣơng đồng di truyền giao động từ 83% - 100%. Nhóm phụ 2 bao gồm các giống/dòng chè KT(DH), KT(TC), KT(DT), DT1(TC), DT1(DT), HNK(DT) với với hệ số tƣơng đồng di truyền giao động từ 92% - 100%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua sơ đồ ở hình 3.8 cho thấy các giống/dòng chè khác nhau về mặt di truyền phân bố theo khả năng kháng bệnh phồng lá. Nhƣ vậy, chỉ thị SSR cho phép xác định nhanh mối quan hệ di truyền giữa các giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu này, điều này rất có ý nghĩa trong chọn tạo giống/dòng chè. Trong 6 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho 30 giống/dòng chè có khả năng phản ứng khác nhau với bệnh phồng lá thì cả 6 cặp mồi SSR đều cho tính đa hình tƣơng đối cao. Có 21 phân đoạn DNA đƣợc nhân bản, số lƣợng các phân đoạn đƣợc nhân bản từ mỗi cặp mồi SSR dao động trong khoảng từ 2 đến 5 phân đoạn. Phân tích đa dạng di truyền trên sơ đồ hình cây cho thấy 4 giống/dòng chè đƣợc đánh giá có khả năng kháng tốt với bệnh phồng lá tập trung thành một nhóm với mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các giống/dòng trong nhóm là từ 83% đến 100%, khoảng cách di truyền giữa các giống/dòng trong nhóm này với nhóm gần nhất là 34,7%. Những thông tin này là cơ sở cho việc chọn giống chè kháng bệnh phồng lá phục vụ sản xuất, đồng thời cũng là cơ sở cho việc lựa chọn các cặp bố mẹ khác nhau về mặt di truyền phục vụ công tác lai tạo giống.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ SSR LIÊN KẾT VỚI TÍNH KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ Ở CHÈ
Trong 30 giống/dòng chè trồng tại một số vùng khác nhau của một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng nghiên cứu có 4 giống/dòng đƣợc đánh giá có khả năng kháng tốt với bệnh phồng lá là: giống/dòng Chè Shan (Sơn La); Chè Shan (Yên Bái); Chè Keo Ampic (Đại Từ) và Chè Keo Ampic (Sông Cầu). Dựa trên kết quả phân tích SSR với 6 cặp mồi PCR-SSR đƣợc sử dụng làm chỉ thị phân tử trong nghiên cứu nhận thấy, cặp mồi TMSE-11D02T cho 1 phân đoạn DNA đặc trƣng, có kích thƣớc khoảng 250bp ở 4 giống/dòng chè đƣợc đánh giá là kháng tốt với bệnh phồng lá, trong khi đó ở các giống/dòng chè khác không thấy xuất hiện phân đoạn DNA này. Từ đó chúng tôi đƣa ra nhận định rất có thể chỉ thị TMSE-11D02T/250bp liên kết gần tính kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans ở chè.
Để khẳng định một cách chắc chắn nhận định trên cần tiến hành một số các nghiên cứu tiếp theo nhƣ lây nhiễm nhân tạo, thực hiện các phép lai các cá thể bố mẹ thuộc các giống/dòng khác nhau và phân tích theo dõi mức độ phân ly của phân đoạn DNA đặc trƣng ở các thế hệ tiếp theo để đánh giá mức độ liên kết của chỉ thị với tính kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidum vexans.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Sử dụng phản ứng SSR với 6 cặp mồi đã nhân bản đƣợc 271 phân đoạn DNA từ hệ gen của 30 giống/dòng chè trồng tại một số địa phƣơng ở miền Bắc Việt Nam.
1.2. Cả 6 chỉ thị phân tử SSR sử dụng trong phân tích tính đa dạng di truyền của 30 giống/dòng chè đều cho tính đa hình cao, trong đó các chỉ thị TMSE-11D02T và TMSE-31E06S cho tính đa hình cao nhất với tổng số 5 phân đoạn DNA và 2 chỉ thị TMSE-11H07S và TMSE-4C08S cho tính đa hình thấp nhất.
1.3. Các giống/dòng chè nghiên cứu phân ra thành hai nhóm lớn với khoảng cách di truyền là 42% (100% - 58%) và 6 nhóm nhỏ với hệ số sai khác di truyền khác nhau.
1.4. Trong 6 chỉ thị SSR nghiên cứu, chỉ thị TMSE-11D02T có khả năng liên kết với đặc tính kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidum vexans ở cây chè.
2. Đề nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu xác định mức độ liên kết giữa chỉ thị TMSE-11D02T với tính kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidum vexans phục vụ chọn giống chè kháng bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T, Bùi Chí Bửu và Bùi Bá Bổng (2001), Chọn giống nhờ Marker và Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr. 44 – 58. 2. Lê Tất Khƣơng, Hoàng Văn Chung, Đỗ Ngọc Oanh (1999), Giáo trình cây chè, Nxb
Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Đỗ Ngọc Quỹ (1980), Trồng chè, Nxb nông nghiệp, Hà Nội, tr 48-50, 93-95, 161-162.
TIẾNG ANH
4. Agnihothrudu V., and Chandramouli B. (1991). “Blister blight of tea, its control and future lines of research”, Proc. Int. Symp. Tea Sci. Shizuoka, Japan, Pp. 655 - 659. 5. Ajay D., Baby U. I. (2010). “Induction of systemic resistance to Exobasidium
vexans in tea through SAR elicitors”, Phytoparasitica 38, pp. 1- 8.
6. Ajay D., Baby U. I. (2010). “Induction of systemic resistance to Exobasidium vexans in tea through SAR elicitors”, Phytoparasitica 38, pp. 53 - 60.
7. Alexandersson E., Fraysse L., Sjovall-Larsen S., Gustavsson S., Fellert M., Karlsson M., Johanson U., and Kjellbom P. (2005), “Whole gene family expression and drought stress regulation of aquaporins”. Plant Mol. Biol 59, pp. 469 - 484.
8. Arulpragasam P.V. (1992), “Tea Cultivation to consumption, Eds. Wilson K.C and Clifford M.N. London”, Chapman & Hall, pp. 353 - 374.
9. Baby U. I., Ravichandran R., Ganesan V., Parthiban R., Sukumar S. (1998), “Effect of blister blight disease on the biochemical and quality constituents of green leaf and CTC tea”. Tropical Agriculture 75(4), pp. 452 - 456.
10. Baby U. I., Balasubramanian S., Ajay D., Premkumar R. (2004), “Effect of ergosterol biosynthesis inhibitors on blister blight disease, the tea plant and quality of made tea”, Crop Protection 23, pp. 795 - 800.
11. Banerjee B. (1988), “Dry matter production and partitioning by tea varieties under differential pruning”, Appl Agric Res 3, pp. 326 - 328.
12. Belenghi B., Acconcia F., Trovato M., Perazzolli M., Bocedi A., Porticelli F., Ascenzi P. and Delledonne M. (2003), “AtCYS1, a cystatin from Arabidopsis thaliana, suppresses hypersensitive cell death”, Eur. J. Biochem 270, pp. 2593 - 2604.
13. Bhorali P., Gohain B., Gupta S., Bharalee R., Bandyopadhyay T., Das S.K., Agar wal N., Singh H.R., Bhagawati P., Bhattacharyya N., Ahmed P., Borchetia S., Sar ma S., Das (2012), “Molecular analysis and expression profiling of blister blight defenserelated genes in tea”, Indian Journal of Genetics and Plant Breeding (The), Vol. 7, pp. 226 - 233.
14. Botstein D. R. L., White M., Skolnick and Davis. R. W. (1980), “Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms” Am. J. Hum. Genet 32, pp. 314 - 331.
15. Brisson L. F., Tenhaken R., and Lamb C. (1994), “Function of oxidative cross- linking of cell wall structural proteins in plant disease resistance”, Plant Cell 6, pp. 1703 - 1712.
16. Brunner F., Stintzi A., Fritig B., and Legrand M. (1998), “Substrate specificities of tobacco chitinases”, Plant J 14(2), pp. 225 - 234. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
17. Ceccardi T. L., Barthe G. A., and Derrick K. S. (2004), “A novel protein associated with citrus blight has sequence similarities to expansin”, Plant Mol. Bio 38(5), pp. 775 - 783.
18. Chakraborty B. N., Dutta S., Chakraborty U. (2002), “Biochemical responses of tea plants induced by foliar infection with Exobasidium vexans", Indian Phytopathology 55, pp. 8 - 13.
19. Christova P. K., Christov N. K. and Imai R. (2006), “A cold inducible multidomain cystatin from winter wheat inhibits growth of the mold fungus”,
Microdochium nivale. Planta 223, pp. 1207 - 1218.
20. Collinge D. B., Kragh K. M., Mikkelsen J. D., Nielsen K. K., Rasmussen U., and Vad K. (1993), “Plant chitinases”, Plant J 3, pp. 31 – 40.
21. Davies T. G. E., and Coleman J. O. D. (2000), “The Arabidopsis thaliana ATP- binding cassette proteins: an emerging superfamily”, Plant Cell Environ 23, pp. 431 - 443.
22. De Gara L., De Pinto M. C., and Tommasi F. (2003), “The antioxidant systems vis-a-vis reactive oxygen species during plant-pathogen interaction”, Plant Physiol. Biochem 41, pp. 863 - 870.
23. De Weille G. A. (1959), “Blister blight control in its connection with climatic and weather conditions”, Archs. Tea Cultiv 20, pp. 1 - 116.
24. Djemukhatze K. M. (1981), Cây chè miền Bắc Việt Nam, Nguyễn Ngọc Kính dịch, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
25. El- kereamy A., El-sharkawy I., Ramamoorthy R., Taheri A., Erampalli D., Kumar P., and Jayasankar S. (2011), “Prunus domestica pathogenesis-related protein-5 activates the defence response pathway and enhances the resistance to fungal infection” PLoS ONE 6(3), pp. 17973.
26. Ezekiel Amri., Florence Mamboya. (2012), “International Journal of Plant Breeding and Genetics” 6(2), pp. 105 – 114.
27. FAO (1993), Slected indicator of food and Agricultural development in Asia – Pacific region (1982 – 1992), Bangkok.
28. Fowler T. J., Bernhardt C. and Tierney M. L. (1999), “Characterization and expression of four proline-rich cell wall protein genes in Arabidopsis encoding two distinct subsets of multiple domain proteins”, Plant Physiol 121, pp. 1081-1091. 29. Freeman S., West J., James C., Lea V., Mayes S. (2004), “Isolation and
characterization of highly polymorphic microsatellites in tea (Camellia sinensis)”, Mol Ecol Notes 4, pp. 324 - 326.
30. Fumiko Kato et al (2008), “Identification of Japanese Tea (Camellia Sinensis) Cultivars Using SSR Marker”, Nipppon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, Vol 55, No.2. pp: 49 - 55.
31. Gadd C. H., and Loos C. A. (1948), Trans. British Mycological Society 33, pp. 229 - 233.
32. Gadd C. H., and Loos C. A. (1949), “The fungus Exobasidium vexans”, Tea Quart 20, pp. 54 - 61.
33. Gadd C. H., and Loos C. A. (1950), “Further observation on the spore growth of Exobasidium vexans” Trans. Brit. Mycol. Soc 33, pp. 19 - 21.
34. Gonzalo M. J., Oliver M., Garcia M. J., Monfort A., Dolcet S. R., Katzir N., Arus P. M. (2005), “A Simple-sequence repeat markers used in merging linkage maps of melon (Cucumis melo L.)”, Theor Appl Genet 110, pp. 802 - 811.
35. Graziana T., and Scott T. (1996), “Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize”, Genome 39, pp. 277 - 287.
36. Guevara M. G., Verissimo P., Pires E., Faro C. and Daleo G. R. (2004), “Potato aspartic proteases: induction, antimicrobial activity and substrate specificity” J. Plant Pathol 86, p. 233 - 238.
37. Guevara M. G., Oliva C. R., Huarte M., and Daleo G. R. (2002), “An aspartic protease with antimicrobial activity is induced after infection and wounding in intercellular fluids of potato tubers” Eur. J. Plant Pathol 108, pp. 131 - 137. 38. Gupta P. K., Varshney R. K. (2000), “The development and use of microsatellite
markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat”,
Euphytica 113, pp. 163 - 185.
39. Hang N., Angeles E. R., Domingo J., Magpantay G., Singgh S., Zhang G., Kumaravadivel N., Bennett J., Khush G. S. (1997), “Pyramiding of bacterial