3. Nội dung nghiên cứu
1.3.2. Chỉ thị phân tử SSR
Chỉ thị SSR hay chỉ thị vi vệ tinh MS, là chỉ thị để nhân những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn [52]. Trong quá trình tiến hóa, số lƣợng các đơn vị lặp lại của vi vệ tinh có thể đƣợc thay đổi nhanh chóng. Điều này làm cho tạo ra một số lƣợng lớn các alen của mỗi locus SSR để phân tích đa hình quần thể [64]. Số lần lặp lại khác nhau làm cho các phân đoạn DNA đƣợc nhân có độ dài ngắn khác nhau. Hiện tƣợng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lƣợng các nucleotit trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi và số lƣợng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn [35]. Các trình tự lặp lại thƣờng có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hoà hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong điều hoà phân bào có thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Bản chất đa hình của SSR là đƣợc sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen, nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Ƣu điểm khi sử dụng kỹ thuật SSR là nó cho đa hình từ rất nhiều vùng tƣơng ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tƣợng động vật và thực vật [79].
SSR là công cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Song nhƣợc điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trƣng cho một loài nhất định [34].Trong thực tế, chỉ thị này đã đƣợc sử dụng trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ đa hình các alen thuộc cùng một locus.
Các DNA vi vệ tinh hay các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeats – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực. Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã đƣợc nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền, ƣớc tính dòng chảy gen
và xây dựng bản đồ liên kết [38]. Hơn nữa, đặc điểm hình thái không thể phản ánh sự biến đổi di truyền vốn có trong cây trồng [11]. Vì vậy việc xác định các công cụ phân tử có độ tin cậy cao nhƣ chỉ thị SSR có vai trò vô cùng quan trọng đối với việc nghiên cứu những biến đổi di truyền chƣa đƣợc khám phá trong chè [29], [98]. Mặc dù các chỉ thị SSR có tính ƣu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền và xây dựng bản đồ liên kết… Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có một số lƣợng rất ít các công trình nghiên cứu công bố về một số lƣợng không lớn các chỉ thị SSR trong nghiên cứu genome chè [29], [98]. Trong vài năm qua, các dự án nghiên cứu EST khác nhau đã công bố công khai dữ liệu về trình tự EST trong chè [67], [80]. Các EST chủ yếu thu đƣợc có nguồn gố từ các cơ quan khác nhau nhƣ mô lá non và lá trƣởng thành đƣợc thu nhận từ môi trƣờng tự nhiên.
Chỉ thị SSR đánh giá đa hình về hình thái đã đƣợc phát triển thành công và đặc trƣng trong chè. Freeman và cs (2004) đã phát triển các mồi microsatellite bằng cách sàng lọc một thƣ viện microsatellite phong phú đƣợc xây dựng bởi Edwards và cộng sự năm 1996. Nhiệt độ bắt cặp và kéo dài tối ƣu của phản ứng PCR với đoạn mồi SSR đã đƣợc thử nghiệm nhƣ mô tả của Haddrill và cs (2002). Bằng cách này, Freeman và cs đã sàng lọc và mô tả thành công 13 chỉ thị microsatellite có tỷ lệ đa hình cao ở chè [92].
Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về ứng dụng chỉ thị SSR trong phân tích đa dạng di truyền các giống chè đã đƣợc tiến hành. Võ Thái Dân (2006) đã tiến hành nghiên cứu về đa dạng di truyền các giống chè Việt Nam sử dụng chỉ thị hình thái, chỉ thị Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) và Microsatellite (SSR) tại khoa Khoa học Nông nghiệp, Đại học Georg-August Göttingen (Đức) [102]. Trần Đức Trung (2009) đã nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của 96 giống chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) ở Việt Nam thông qua việc sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR). Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội. Trong nghiên cứu này, 96 giống chè đƣợc đánh giá đa dạng di truyền dựa trên việc sử dụng 21 cặp mồi SSR tại 21 locus khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các giống chè này đều thuộc thứ chè Assam và chia làm 9 nhóm quần thể với hệ số đa dạng khác nhau [103].
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU