3. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu lá chè và tách chiết DNA tổng số
Các lá sau khi đƣợc lựa chọn sẽ đƣợc cắt bằng kéo, rửa sạch bụi, xịt qua cồn ethanol 70% sau đó để khô trong không khí và cho mẫu lá của mỗi giống/dòng vào riêng một túi nilon sạch, buộc kín, ghi tên giống/dòng và cho ngay vào đá lạnh trong quá trình vận chuyển. Các mẫu đƣợc tiến hành tách chiết DNA tổng số ngay. Một số mẫu đƣợc bảo quản ở -300C phục vụ cho những lần tách DNA tổng số sau.
DNA tổng số đƣợc tách chiết từ các mẫu lá chè bánh tẻ bằng cách sử dụng bộ Kit tách chiết DNA tổng số “GeneJET Plant Genomic DNA Puification Mini Kit”, các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Một số mẫu DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số của SAMUEL (1994) và ANWADA và đtg (1997) có cải tiến cụ thể nhƣ sau:
Bước 1: Nghiền 0,5g lá chè với nitro lỏng bằng cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 4ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM, pH8; EDTA 5mM, pH8; NaH2PO4 0,4%; Sobitol 350 mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp dung dịch vào đầy 2 ống eppedorf loại 1,5ml. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch (lặp lại 1 lần nữa thao tác này).
Bước 2: Bổ sung vào 700µl đệm chiết (Tris-HCl 100mM, pH8; EDTA 20mM, pH8; CTAB 4%; NaCl 1,4M; H2O) vào mỗi ống eppendorf chứa mẫu. Ủ mẫu ở 650
C trong vòng 45 phút, khoảng 10 phút đảo ngƣợc ống eppendorf 2 – 3 lần. Ủ xong để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Bước 3: Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
Bước 4: Bổ sung Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lƣợng dung dịch mẫu, đảo ống 2 – 3 lần. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40
C, thu dịch pha trên, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lƣợng dung dịch mẫu, đảo ống 2-3 lần. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch pha trên, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
Bước 5: Bổ sung Isopropanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lƣợng dung dịch mẫu, bảo quản ở -200C trong vòng 2 giờ. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch.
Bước 6: Bổ sung 500 µl ethanol 70%, mix nhẹ bằng tay. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch, để khô. Bổ sung 45 µl nƣớc khử ion, bảo quản mẫu DNA ở -200
C.