3. Nội dung nghiên cứu
1.2.4.Một số nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans
Cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans của cây chè từ lâu đã là mối quan tâm của các nhà nghiêm cứu nhằm mục tiêu hiểu biết rõ hơn về các phản ứng kháng bệnh phồng lá để phục vụ cho công tác chọn giống chè. Các phản ứng kháng bệnh phồng lá đƣợc đặc trƣng bởi phản ứng phiên mã của cây chè nhiễm
Exobasidium vexans. Sự hiểu biết toàn diện về hệ thống các gen, protein và các phân tử nhỏ và mô tả đặc điểm của các phân tử này làm nền tảng cho việc tìm hiểu cơ chế bảo vệ thực vật khỏi các stress do phản ứng sinh lý căng thẳng hoặc do tác nhân gây bệnh phát triển gây ra [56].
Chitinase trong mẫu thực vật đƣợc tạo ra bởi nhiều yếu tố khác nhau, đặc biệt là do nhiễm nấm [49]. Protein kháng nấm nhƣ chitinases và β-1,3-glucanase ức chế nấm tăng trƣởng bằng cách làm giảm chitin và (1,3)-β-glucan, cả hai thành phần chính cấu trúc thành tế bào polysaccharides trong phát triển sợi nấm [51]. Jeyaramraja và cs (2005) phát hiện ra rằng mức độ biểu hiện chitinase ở các giống chè kháng bệnh phồng lá cao hơn so với các giống nhạy cảm [44]. Các sản phẩm chitinolytic là nguyên liệu để sản xuất các hợp chất phòng thủ nhƣ phytoalexin và SAR [16]. Hơn nữa, cảm ứng của chitinase thƣờng phối hợp với cảm ứng cụ thể của β-1,3-glucanase và protein PR khác [20]. Ngoài ra, vai trò của chitinase có thể đƣợc tăng cƣờng bởi β-1,3-glucanase [58]. Sự giảm xuống của β-1,3-glucan trong thành tế bào góp phần làm thành tế bào của nấm bất ổn cũng nhƣ kích thích phản ứng tự vệ của tế bào miễn dịch elicitors liên quan [51]. Hoạt động kháng nấm của β-1,3- glucanase đã đƣợc nghiên cứu xác định cả in vitro [77] và in vivo [43] qua các nghiên cứu biến đổi di truyền.
Nhƣ vậy, sự gây ra thiếu hụt chitinase và glucanase của vách tế bào nấm là một cơ chế phòng thủ chủ động của hệ miễn dịch chống bệnh phồng lá trong chè.
Gen TLP PdPR5-1, ngoài đặc tính kháng nấm nó còn có vai trò trong việc kích hoạt khác con đƣờng miễn dịch bao gồm cả sản xuất phytoalexin chống lại necrotrophic nấm Monilinia fructicola [25].
Một gen mã hóa protein vết thƣơng WIN2 cũng đã đƣợc nghiên cứu và nhận thấy điều hòa tăng đáng kể trong bài nhiễm P-1258. Điều này cho thấy nó vai trò tiềm năng trong kháng Exobasidium vexans. Protein WIN2 là một họ protein liên quan đến các mầm bệnh trong cấu trúc phân tử có chitin, và đƣợc biết đến có hoạt tính kháng nấm [84].
Các gen khác có vai trò bảo vệ chè kháng lại bệnh phồng lá theo các cơ chế khác cũng đã đƣợc tìm thấy bao gồm gen mã hoá protein Avr9/Cf-9, proteinase aspartic, cystatin, cytochrome P450 và protein P12. Aspartic proteinase (AP) và cystatin là các lớp protein kháng khuẩn phân giải protein trong thực vật và đƣợc biết đến là có liên quan đến bệnh cũng nhƣ cơ chế đề kháng chống lại bệnh [36], [37].
Cystatins thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại căng thẳng sinh học do có khả năng ức chế proteinases từ các kẻ thù khác và tác nhân gây bệnh. Chúng có liên quan đến các tác nhân gây bệnh cũng nhƣ stress phi sinh học gây chết tế bào [12]. Một số phytocystatins đã đƣợc mô tả có hoạt động kháng nấm [19], [57], [83].
Cytochrome P450 cũng đã đƣợc xác định tham gia vào một loạt các phản ứng oxy hóa dẫn đến sự sinh tổng hợp phenylpropanoids, tecpen, và alkaloid. Các thành phần này đóng một vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất để bảo vệ thực vật thông qua hoạt động tổng hợp thành tế bào và các thành phần bảo vệ trung gian [75].
Protein P12 liên quan đến bệnh phồng lá cũng đã đƣợc nghiên cứu theo một hƣớng khác đó là trong cây trồng sau khi nhiễm nấm Exobasidium vexans. Protein 12 kDa (quy định là P12 ), đặc trƣng trong cam quýt, đã đƣợc tìm thấy có tích lũy nhiều trong lá, gỗ và chất lỏng của cây bị nhiễm bệnh phồng lá. Từ đó Protein P12 đƣợc cho rằng đóng một vai trò nào đó trong bộ máy để đáp ứng miễn dịch kháng bệnh [17], [45], [46]. Sự điều hoà tăng lên về hoạt động của một gen mã hoá protein tiền thân cuả protein P12 có liên quan đến bệnh phồng lá cũng đã đƣợc nghiên cứu và
đƣa ra giả thuyết có liên quan đến cơ chế bảo vệ chè. Nó đƣợc tìm thấy có điểm tƣơng tự với protein expansin [17], [45]. Tuy nhiên, để làm sáng tỏ vai trò tiềm năng của nó trong tƣơng tác kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans của chè cần phải điều tra, nghiên cứu thêm các đặc trƣng về truyền tín hiệu.
Các protein thụ thể liên quan đến sự tiếp nhận của các tín hiệu tác nhân gây bệnh bao gồm các thụ thể giàu leucine nhƣ protein kinases và protein serine/threonine kinase (STKs). Các protein này đóng vai trò trung tâm trong việc tiếp nhận các tín hiệu tác nhân gây bệnh và kích hoạt của cơ chế bảo vệ tiếp theo ở thực vật. Các thụ thể giàu leucine đóng vai trò quy định sự phát triển của hàng rào bảo vệ thực vật nhƣ quá trình tăng sinh tế bào, duy trì tế bào gốc, các phản ứng tự vệ không chủ động, phản ứng gây tổn thƣơng và cộng sinh [89].
Quá trình oxi hoá khử tham gia vào tăng cƣờng tín hiệu cho sự nhiễm bệnh và hạn chế sự tăng trƣởng lây lan của mầm bệnh. Sự cảm ứng của phản ứng kháng chống lại bệnh phồng lá trong chè có thể tƣơng quan với sự chết của các tế bào vùng bị nhiễm. Quá trình oxi hoá tăng lên sẽ kéo theo sự kích hoạt các gen mã hoá enzyme chống oxi hoá trong các mô xung quanh vùng bị nhiễm bệnh ban đầu để bảo vệ các tế bào xung quanh chống lại sự oxi hoá [50]. Khi cây chè bị nhiễm Exobasidium vexans
sẽ gây ra sự biểu hiện của một số gen mã hoá protein hoặc enzyme tham gia vào quá trình ngăn cản sự oxi hoá. Chúng bao gồm thioredoxin m, amine oxidase, hypersensitive induced response protein, hydrogen peroxide-induced protein, glutathione S-transferase, catalase, Arabidopsis thaliana Nudix hydrolase protein và gen quinone oxidoreductase. Thioredoxin m đã đƣợc tìm thấy và đƣợc đánh giá gây ra đáp ứng cao với nhiễm Exobasidium vexans. Thioredoxins (TRX) rất phổ biến và có liên quan đến quy định về môi trƣờng oxi hóa khử của tế bào và đóng một vai trò cơ bản trong tín hiệu nội bào chống oxy hóa [40], [96]. Nghiên cứu đầu tiên về Thioredoxin có liên quan đến khả năng kháng bệnh thực vật đƣợc đƣa ra bởi Rivas và cs năm 2004 [73].
Sự nhiễm bệnh thƣờng dẫn đến sự thay đổi trong con đƣờng trao đổi chất khác nhau. Tác nhân gây bệnh đòi hỏi một sự thay đổi lớn trong hoạt động trao đổi chất hơn là thay đổi một vài cơ chế bảo vệ liên quan đến gen [22].
Các protein hoặc enzyme liên quan đến con đƣờng trao đổi chất khác đại diện cho một số con đƣờng sinh hóa nhƣ carbohydrate, chất béo, năng lƣợng, chuyển hóa protein, chuyển hóa axit nucleic để đáp ứng với bệnh phồng lá. Một số trong các enzyme tham gia trong việc duy trì chất chuyển hóa dẫn đến sự điều chỉnh hoặc thay đổi trong quá trình trao đổi chất để vƣợt qua stress do bệnh gây ra. Mặc dù vai trò của gen đƣợc biết đến ít hơn so với vai trò trực tiếp của tất cả các protein trong cơ chế bảo vệ. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu cho thấy sự giảm xuống của các gen liên quan đến sự trao đổi chất thứ cấp. Thay đổi trong chuyển hóa carbohydrate trong phản ứng bệnh cũng đƣợc ghi nhận. Các protein khác nhau hoặc các enzyme liên quan đến sự trao đổi chất carbohydrate đƣợc xác định bao gồm β-D-glucosidase, galactinol synthase, enzyme phân giải tinh bột nhóm II, polygalacturonaza và phospholipase C (PLC5). Enzyme β-glucosidase là một glycosyl hydrolase tham gia vào tổng hợp β-glucan trong lignification, sắc tố sự trao đổi chất. Nó đã đƣợc làm rõ vai trò tham gia vào cơ chế bảo vệ hóa học chống lại tác nhân gây bệnh nhiễm trùng [69], [82].
Có sự điều hòa tăng cƣờng phiên mã của một loạt các gen mã hóa các protein vân chuyển trong tế bào đặc biệt là các protein vận chuyển lipit (lipid transfer proteins – LPTs) khi chè bị nhiễm nấm Exobasiddium vexans. Các protein vận chuyển nhƣ vậy gồm chất ức chế protease, protein và họ protein vận chuyển lipit, glycolipit màng, glycolipit vận chuyển, protein vận chuyển acyl và họ protein yếu tố 14 màng tế bào, họ protein vận chuyển phosphoglyceride… Các protein này đã đƣợc tìm thấy những kiểu khác nhau khi nhiễm Exobasiddium vexans. Đây là các protein vận chuyển nhỏ, phổ biến, protein vận chuyển lipit có khả năng trao đổi lipid giữa màng và tạo điều kiện vận chuyển lipit giúp cho thành tế bào hình thành lớp biểu bì và sinh tổng hợp chất nền bề mặt, qua đó tăng cƣờng cấu trúc rào cản chống lại một loạt các tấn công của các tác nhân gây bệnh. Kader (1996) đã đề xuất rằng các protein vận chuyển lipit của thực vật có vai trò thiết yếu trong việc tăng cƣờng sinh tổng hợp cutin thành tế bào thông qua lắng đọng cutin. Một số báo cáo đã mô tả sự tham gia của LTPs trong tƣơng tác mầm bệnh với thực vật và các phản ứng phòng thủ. Liu và cs (1999) thấy rằng LTP từ lúa mạch và ngô có thể ức chế nhiều loại tác nhân gây bệnh [53].
Các protein vận chuyển lipit đóng vai trò làm dày thêm lớp biểu bì của lá chè bị bệnh phồng lá, do đó bảo vệ lá chè khỏi sự xâm nhập của nấm. Ngoài ra còn nhận thấy sự điều hòa tăng cƣờng biểu hiện của các protein huyết tƣơng bên trong màng tế bào (plasma membrane intrinsic protein - PIP), họ các protein aquaporin MIP đóng một vai trò trung tâm trong mối quan hệ giữa nƣớc và thực vật, biểu hiện thông qua phản ứng của thực vật đối với những điều kiện khắc nghiệt khác nhau, đặc biệt là hạn hán. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen aquaporin đƣợc tăng cƣờng hoạt động trong quá trình tƣơng tác gây bệnh cho thực vật. Mysore và cs (2003) đã báo cáo biểu hiện của bốn aquaporin / tonoplast protein nội tại trong phản ứng kháng của cà chua với Pseudomonas syringae [62]. Werner và cs (2001) đã chỉ ra có sự liên quan giữa aquaporins với các hoạt động của kênh vận chuyển nƣớc trong cà chua khi chịu tƣơng tác của vi khuẩn gây bệnh. Mặc dù vai trò thực tế của quá trình vận chuyển nƣớc trong phản ứng phòng vệ thực vật vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Tuy nhiên, có thể đƣa ra giả thuyết rằng trong chè, các aquaporins hoặc PIPs đóng vai trò quan trọng trong quá trình tƣơng tác với các loại nấm bệnh phồng lá và nƣớc cần thiết cho sự tăng trƣởng và phát triển tác nhân gây bệnh trong mô thực vật.
Một số nghiên cứu còn nhận thấy sự gia tăng đáng kể trong biểu hiện của protein vận chuyển ATP - binding cassette (ABC) trong các mẫu chè bị nhiễm bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans. Đây là một lớp chính của ATP – powered vận chuyển, chúng ít đƣợc mô tả đặc điểm và chƣa đƣợc hiểu nhiều về chức năng sinh lý. Những protein này đƣợc giả thuyết là tham gia vào giải độc của thuốc diệt cỏ và thuốc diệt nấm cũng nhƣ việc vận chuyển hợp chất bảo vệ thực vật [21].
Thành tế bào phát triển dày lên có liên quan đến khả năng tăng cƣờng phản ứng kháng chống lại một loạt các tác nhân gây bệnh. Quá trình sửa đổi trong mạng lƣới tế bào đƣợc xúc tác bởi một số enzyme. Trong đó, enzyme Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases (XTHs) tham gia vào việc tổ chức lại thành tế bào bằng cách xúc tác phân chia và tái nhập trở lại của chuỗi xyloglucan [88]. Các nghiên cứu cho thấy có sự điều hòa tăng đáng kể trong biểu hiện của XTH đối với các cây chè bị nhiễm Exobasidium vexans. Các chức năng của XTHs chủ yếu liên quan đến khả năng phát triển của cây trồng và cây thực phẩm. Cơ chế cảm ứng của gen XTH
để đáp ứng chống lại dịch bệnh và vai trò của chúng đối với tác nhân gây bệnh xâm hại vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Tuy nhiên, rất có thể XTHs tham gia vào duy trì chức năng của các protein tham gia vào phát triển tế bào, góp phần vào việc đề kháng chống nấm thâm nhập và phát triển gây bệnh trong tế bào.
Các biến đổi về thành tế bào khác nhƣ họ protein hydroxyproline-rich glycoprotein (HRGP), họ protein methyltransferase và họ protein galactosyltransferase đã đƣợc tăng cƣờng biểu hiện để đáp ứng với nhiễm
Exobasidium vexans. Nồng độ cao của H2O2 góp phần tăng cƣờng độ vững chắc của cấu trúc thành tế bào bằng cách thúc đẩy sự hình thành liên kết của các protein ngoại bào nhƣ HRGPs [15]. Các mối liên kết chéo làm cho HRGPs không hòa tan, khiến thành tế bào khó bị tấn công bởi các enzyme thủy phân tiết ra bởi tác nhân gây bệnh. Các mối liên kết chéo của HRGPs có vai trò tích cực trong các phản ứng bảo vệ cây trồng. Các protein giữ cả hai chức năng trong việc xác định cấu trúc cụ thể của thành tế bào và tham gia vào sự sinh trƣởng, phát triển của cây trồng. Từ đó, chúng góp phần bảo vệ cây trồng chống lại các tác nhân gây bệnh [28].
Họ các protein Methyltransferase và galactosyltransferase liên quan đến sinh tổng hợp lignin và polysaccharides thành tế bào. Do đó, chúng có khả năng tham gia vào phản ứng kháng để chống lại tác nhân gây bệnh. Nhƣ vậy, sự vững chắc của thành tế bào giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức đề kháng của chè chống lại chủng nấm gây bện phồng lá bằng cách cung cấp một rào cản vật lý để nấm
Exobasidium vexans không xâm nhập và gây bệnh đƣợc.
Kết quả của quá trình quang hợp là cây tổng hợp đƣợc sản phẩm dự trữ saccharides hoặc đƣờng. Đó là một nguồn cung cấp năng lƣợng chính của tế bào thực vật. Quan sát sự điều hòa phiên mã của gen mã hóa tiểu đơn vị Ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) nhận thấy có sự tăng đáng kể sản phẩm phiên mã để đáp ứng lại khi chè bị nhiễm Exobasidium vexans. Đây là gen mã hóa quy định tổng hợp sản phẩm protein liên quan đến quá trình quang hợp và sinh tổng hợp chất diệp lục. Sản phẩm của quá trình phiên mã này là một loại enzyme có vai trò quan trọng với quá trình quang hợp. Ngoài ra, enzyme này còn đƣợc biết đến với khả năng tham gia trong đáp ứng stress nhiệt, muối, mầm bệnh và phản ứng sinh lý khác [100].
Các nghiên cứu gần đây nhất là về tổng hợp flavonoid trong quá trình nhiễm bệnh. Trong các lá bị nhiễm bệnh, nhận thấy sự gia tăng hoạt động của một số enzyme và giảm hàm lƣợng chlorophyll và carotenoid [87]. Nghiên cứu khảo nghiệm sơ bộ đối với hàm lƣợng phytoalexin liên quan đến Exobasidium vexans cũng đã đƣợc nghiên cứu. Đây là các hợp chất có trọng lƣợng phân tử thấp, có tính kháng đối với vi sinh vật, đƣợc tạo ra do sự nhiễm bệnh hoặc stress sinh học [63]. Vai trò của các chất phenolic trong kháng bệnh cũng đƣợc nghiên cứu [95], [65].
Nghiên cứu cho thấy có sự chênh lệch đáng kể hàm lƣợng epicatechin trong các mẫu giống chè kháng tốt bệnh phồng lá so với mẫu giống chè mẫn cảm. Cụ thể có sự cao hơn đáng kể của epicatechin (22mg/g) trong mẫu của giống kháng bệnh so với mẫu của giống mẫn cảm (10mg/g). Điều này cho thấy sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của epicatechin trong cơ chế đề kháng của chè chống lại bệnh phồng lá. Theo Punyasiri và cs (2004) và (2005) thì khả năng tăng sức đề kháng của một số giống chè đối với Exobasidium vexans có thể là do mức độ cao hơn của epicatechin trong chè hoặc thay đổi thành phần proanthocyanidin [70], [71]. Mức tăng của epicatechin đƣợc tìm thấy trong giống chè kháng bệnh phồng lá, trong khi mức độ epigallocatechin gallate cao hơn các giống mẫn cảm [70], [71]. Theo đó, họ cho rằng epicatechin đóng một vai trò quan trọng trong việc đề kháng chống căn bệnh này trong khi methylxanthine có thể đóng một vai trò trong việc khởi đầu sự nhiễm bệnh và tấn công của nấm. Họ cho rằng sự đề kháng cao của giống chè khác nhau có liên