nghiên cứu sự ô nhiễm của một số chỉ tiêu vi khuẩn ở nước uống đóng chai trên địa bàn thành phố thái nguyên

TẠ PHƯƠNG THUỲ NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM CỦA MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI KHUẨN Ở NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN

TẠ PHƯƠNG THUỲ

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM CỦA MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI KHUẨN Ở NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2010

TẠ PHƯƠNG THUỲ

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM CỦA MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI KHUẨN Ở NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ SỐ: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Đặng Xuân Bình

Thái Nguyên, năm 2010

Tôi xin cam đoan đây là luận văn do tôi thực hiện Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Một số kết quả đã được công bố cùng TS Đặng Xuân Bình, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác Các tài liệu tham khảo, trích dẫn đều được ghi tên tác giả và tên tài liệu trích dẫn trong phần tài liệu tham khảo

Tác giả luận văn

Tạ Phương Thùy

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Xuân Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ vi sinh, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sau đại học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên, các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh-KTNN, cùng toàn thể bạn bè đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các cơ quan, trường học

và các gia đình trong địa bàn thành phố Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Tạ Phương Thùy

1 Đặt vấn đề 1

1.3 Tình hình nghiên cứu sự ô nhiễm của một số chỉ tiêu vi khuẩn ở

1.4.2 Ô nhiễm vi khuẩn từ nguồn nước (nước ngầm, nước bề mặt) 16

1.4.4 Ô nhiễm vi khuẩn trong quá trình xử lý, sản xuất lưu thông và bảo

1.5 Ý nghĩa của sự ô nhiễm nước về chỉ tiêu Coliform 18

1.6 Vai trò của vi khuẩn E.coli gây ô nhiễm nước 19

1.7 Một số hiểu biết về ngộ độc thực phẩm do E coli gây ra 22 1.8 Vai trò của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây ô nhiễm nước 23

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp điều tra tình hình sản xuất và phân phối sản phẩm nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên 27 2.3.2 Phương pháp thu mẫu nước để phân tích vi khuẩn 27

2.3.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu Coliform 27

2.3.4 Phương pháp xác định chỉ tiêu E Coli (fecal Coliform) 29

2.3.5 Phương pháp xác định chỉ tiêu P Aeruginosa 29

2.3.6 Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng E

2.3.7 Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng P

2.3.8 Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập

2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 34

3.1 Tình hình sử dụng sản phẩm nước uống đóng chai trên địa bàn TP

3.7 Xác định thành phần các loại vi khuẩn thuộc nhóm Coliform nhiễm

3.8 So sánh đặc tính sinh vật học của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm

3.9 Giám định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn E coli 52

3.10 Giám định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P aeruginosa 53 3.11 Kết quả thử khả năng sản sinh độc tố đường ruột củ a vi khuẩn E

3.12 Giám định yếu tố bám dính của các chủng E coli phân lập được 55

3.13 Xác định độc lực của vi khuẩn E coli phân lập được 56

3.14 Xác định độc lực của vi khuẩn P aeruginosa phân lập được 58 3.15 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược

của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được 59 3.16 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược

Kết luận 62

Trang Bảng 3.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng sản phẩm NUĐC trên

Bảng 3.2 Kết quả điều tra tình hình sản xuất và phân phối sản phẩm

nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên 39 Bảng 3.3 Kết quả xác định chỉ tiêu Coliform trong mẫu nước uống

Bảng 3.6 Kết quả xác định tần xuất nhiễm các loại vi khuẩn

Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Coliform, E coli, P aeruginosa

Bảng 3.8 Kết quả xác định thành phần các loại vi khuẩn thuộc nhóm

Bảng 3.9 Kết quả so sánh đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi

Bảng 3.10 Kết quả giám định đặc tính sinh học của vi khuẩn E coli 52

Bảng 3.11 Kết quả giám định đặc tính sinh học của vi khuẩn P

Bảng 3.12 Kết quả thử khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi

Bảng 3.14 Kết quả thử độc lực của vi khuẩn E coli phân lập được 57

Bảng 3.15 Kết quả thử độc lực của vi khuẩn P aeruginosa phân lập

Bảng 3.16 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của

vi khuẩn E coli phân lập được 60 Bảng 3.17 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của

vi khuẩn Pseudomonas phân lập được 61

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Con người cũng như bất kỳ loài sinh vật nào đều cần có nước mới tồn tại được Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống ngày càng được cải thiện thì nhu cầu về chất lượng nước uống cho con người càng được quan tâm nhiều hơn Nước uống phải đảm bảo giá trị dinh dưỡng, vệ sinh và an toàn Trước những nhu cầu bức thiết đó, từ vài chục năm nay, công nghệ xử lý nước uống

đã không ngừng phát triển mạnh mẽ trên khắp thế giới Bên cạnh các loại nước đóng chai đa dạng, đủ kiểu, đủ cỡ, đồng thời chúng ta cũng thấy xuất hiện các công nghệ phụ thuộc, như máy lọc, máy làm lạnh nước, những dụng

cụ khử trùng và khử chất bẩn trong nước uống Theo Tổ chức nước uống đóng chai quốc tế (IBWA), dân chúng ưa chuộng nước đóng chai vì mùi vị không gắt, không hôi mùi chlorine như nước máy, lại tinh khiết và bổ dưỡng cho sức khỏe Nước được đựng trong các chai thủy tinh hay bằng plastic rất đẹp mắt, tiện lợi Bởi những lý do này, nên nhiều người đã chọn nước đóng chai hoặc nước lọc để uống

Tuy nhiên, ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển (Việt Nam) người sản xuất thường chỉ quan tâm tới lợi nhuận trước mắt mà sẵn sàng bỏ qua các quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) Do vậy, nguồn nước sinh hoạt nói chung và các loại nước uống đóng chai nói riêng bị ô nhiễm sẽ là nguy cơ đe dọa sức khỏe con người Theo đánh giá của

tổ chức Y tế thế giới (WHO) hàng năm có khoảng 1300 triệu lượt người trên thế giới bị tiêu chảy, trong đó nguyên nhân chính là do sử dụng thực phẩm ô nhiễm bởi vi sinh vật Mỗi năm Việt Nam có 8 triệu người (chiếm xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc do liên quan đến ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm

Tại Hội nghị khoa học 2006 kỷ niệm 115 năm thành lập Viện Pasteur TP.HCM ngày 30/11/2006, các chuyên gia đã tỏ ra lo ngại tỷ lệ nhiễm khuẩn cao ở nước sinh hoạt Trong đó, tỷ lệ các mẫu nước ô nhiễm vi khuẩn

Coliform và E coli chiếm tỷ lệ cao nhất, đến 98% (theo TCVN 5502 : 2003

[2] thì chỉ tiêu này là 0) Điều này cho thấy, điều kiện vệ sinh nguồn nước sinh hoạt không đảm bảo Nguyên nhân có thể do nguồn nước đã bị ô nhiễm; hoặc bị nhiễm khuẩn từ dụng cụ, công nhân; cũng có thể do qui trình sản xuất

không đảm bảo các yêu cầu vệ sinh Ngoài vi khuẩn Coliform, E coli, nước uống đóng chai còn bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác như Pseudomonas, Vibrio

Ở Việt Nam, an toàn vệ sinh thực phẩm là một lĩnh vực mới, chưa được quan tâm đầy đủ, nhất là an toàn vệ sinh đối với hoạt động sản xuất, kinh doanh nước uống đóng chai (NUĐC) Bộ y tế cũng đã tiến hành một số biện pháp để bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng nhưng mới chỉ quan tâm chủ yếu đến thực phẩm có nguồn gốc động vật Tuy nhiên, thực tế các vụ ngộ độc thực phẩm cho thấy ô nhiễm thực phẩm xảy ra nhiều khi do nước uống Từ thực trạng và đòi hỏi ngày càng khắt khe của xã hội về chất lượng vệ sinh đối với các loại NUĐC hiện nay, thiết nghĩ cần sớm có những đề tài nghiên cứu

cụ thể về sự ô nhiễm vi sinh vật gây bệnh ở các sản phẩm nước uống trên thị trường, từ đó đưa ra được những giải pháp cho vấn đề ATVSTP Xuất phát từ đòi hỏi cấp thiết đó, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên chúng tôi

đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu sự ô nhiễm của một số chỉ tiêu vi khuẩn ở nước uống đóng chai trên địa bàn Thành phố Thái Nguyên"

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát thực trạng sử dụng nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên

- Xác định tình trạng ô nhiễm về một số chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh như

Coliform, Escherichia coli (E coli), Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) ở nước uống đóng chai khu vực TP Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tình hình sử dụng nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên

- Lấy mẫu, phân lập và xác định các vi khuẩn gây bệnh, bao gồm: Vi khuẩn

Coliform, E coli, Pseudomonas trong nước uống đóng chai thành phẩm

- Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn E coli, Pseudomonas phân lập được

- Xác định khả năng sản sinh độc tố, yếu tố bám dính của các chủng E coli

phân lập được

- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E coli, Pseudomonas phân lập

được

- Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các

chủng vi khuẩn E coli, Pseudomonas phân lập được

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nước khoáng thiên nhiên (natural mineral water): Được lấy từ những mạch ngầm dưới đất, và có một nồng độ chất khoáng rất cao Canada ấn định nồng độ này phải từ 500 ppm/lít trở lên (còn Hoa Kỳ thì trên 250 ppm/lít) Thông thường nồng độ khoáng chất hòa tan trong loại nước này thường ở vào khoảng 700-800 ppm, tuy nhiên cũng có loại có thể chứa trên 3000 ppm chất khoáng Đối với 2 loại nước suối và nước khoáng nói trên, nhà sản xuất không có quyền làm thay đổi thành phần chất khoáng có sẵn trong nước ngầm, ngoại trừ họ có thể cho thêm khí CO2 (cacbon dioxide), hoặc thêm chất fluoride Ngoài ra họ cũng có thể sử dụng phương pháp khử trùng bằng ozone

Nước đã được xử lý (treated water): Đây không phải là những loại nước lấy từ nguồn nước ngầm, nhưng là nước của thành phố, tức được hứng

từ vòi robinet Thông thường là nước sông hoặc nước ao hồ được lắng lọc, làm cho trong và khử trùng bằng nhiều phương pháp khác nhau như dùng tia

cực tím (ultra violet), ozone thẩm thấu ngược (reverse osmosis) hoặc sử dụng cách lọc đặc biệt gọi là absolute micron filtration Nước xử lý có thể là nước cất (distilled water), nước vô khoáng (demineralized water), và nước có gas (carbonated water) Nước cất có được qua phương pháp làm bốc hơi và sau đó làm ngưng tụ lại thành nước Nước cất không có chứa chất khoáng hoặc chỉ chứa một nồng độ chất khoáng thật thấp dưới 10 ppm/lít… Nước vô khoáng

là nước đã được rút bớt chất khoáng ra bằng một phương pháp nào đó ngoại trừ cách cất nước Nồng độ chất khoáng của nó rất thấp và phải dưới 10 ppm/lít

Theo TCVN 6213: 2004 [3], áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

1 Nước khoáng thiên nhiên đóng chai (Bottled/packaged natural mineral water) là loại nước có thể phân biệt được rõ với nước uống thông thường do:

a Được đặc trưng bởi hàm lượng một số muối khoáng nhất định Các

tỷ lệ tương đối của chúng và các nguyên tố vi lượng hoặc các thành phần khác

b Được lấy trực tiếp từ các nguồn thiên nhiên hoặc giếng khoan từ các mạch nước ngầm được bảo vệ thích hợp để không bị ô nhiễm hoặc ảnh hưởng đến chất lượng của nước khoáng thiên nhiên

c Bền vững về thành phần, ổn định về lưu lượng và nhiệt độ cho dù có biến động của thiên nhiên

d Được lấy trong các điều kiện đảm bảo độ sạch ban đầu về vi sinh vật

và thành phần hóa học của các thành phần cơ bản

e Được đóng chai gần nguồn với các hệ thống đường dẫn khép kín đảm bảo các yêu cầu vệ sinh nghiêm ngặt

2 Nước khoáng thiên nhiên chứa cacbon dioxide (CO2) tự nhiên (Naturally carbonated natural mineral water) là nước khoáng thiên nhiên sau khi được xử lý và tái hợp cacbon dioxide của chính nguồn đó và sau khi đóng chai có hàm lượng khí cacbon dioxide (CO2) như tại nguồn nước

3 Nước khoáng thiên nhiên không chứa cacbon dioxide (CO2) (Non - carbonated natural mineral water) là nước khoáng thiên nhiên sau khi xử lý và đóng chai không chứa cacbon dioxide (CO2) tự do vượt quá lượng cần thiết để duy trì sự tồn tại các muối hydrocacbonat hòa tan trong nước

4 Nước khoáng thiên nhiên khử cacbon dioxide (CO2) (Decarbonated natural mineral water) là nước khoáng thiên nhiên sau khi xử lý và đóng chai

có hàm lượng cacbon dioxide nhỏ hơn tại nguồn nước và không đồng thời phát ra cacbon dioxide dưới các điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường

5 Nước khoáng thiên nhiên có bổ sung cacbon dioxide (CO2) (Natural mineral water fortified with carbon dioxide from the source) là nước khoáng thiên nhiên sau khi xử lý và đóng chai có chứa hàm lượng cacbon dioxide (CO2) lớn hơn tại nguồn, lượng CO2 được bổ sung là CO2 từ nguồn

6 Nước khoáng thiên nhiên chứa cacbon dioxide (Carbonated natural mineral water) là nước khoáng thiên nhiên sau khi xử lý và đóng chai có nạp thêm cacbon dioxide (CO2) thực phẩm

1.1.2 Một số yêu cầu kỹ thuật về nước khoáng thiên nhiên đóng chai theo TCVN 6213: 2004 [3]

1.1.2.1 Yêu cầu về nguồn nước

Nguồn nước sử dụng để sản xuất nước khoáng thiên nhiên đóng chai được quy định bởi cơ quan có thẩm quyền

1.1.2.2 Yêu cầu về xử lý

- Các biện pháp xử lý cho phép bao gồm việc tách các thành phần không ổn định như các hợp chất chứa sắt, magan, lưu huỳnh hoặc asen bằng phương pháp gạn và/hoặc lọc, nếu cần được tăng cường bằng quá trình sục khí cacbonic trước

- Nghiêm cấm vận chuyển nước khoáng thiên nhiên trong các vật chứa rời để đóng chai hoặc tiến hành bất cứ quá trình nào khác trước khi đóng chai

- Ngoài các biện pháp xử lý trên, nước khoáng thiên nhiên đóng chai có thể được xử lý theo các quy trình công nghệ đã được quy định bởi cơ quan có thẩm quyền

1.1.2.3 Yêu cầu vi sinh vật đối với nước khoáng thiên nhiên đóng chai trong quá trình tiêu thụ, nước khoáng thiên nhiên:

a Phải đảm bảo chất lượng không gây rủi ro cho sức khoẻ người tiêu dùng (không được có các vi sinh vật gây bệnh);

b Ngoài ra phải tuân thủ các yêu cầu về vi sinh vật sau đây:

E coli hoặc coliform chịu nhiệt 1 x 250ml Không phát hiện trong bất

Kiểm tra lần thứ hai

* Các kết quả của lần kiểm tra thứ nhất và thứ hai

Kiểm tra lần thứ hai được thực hiện sử dụng cùng thể tích như đã dùng

để kiểm tra lần đầu

n: Số đơn vị mẫu lấy từ lô hàng để kiểm tra

c: Số lượng mẫu tối đã có thể chấp nhận hoặc số lượng đơn vị mẫu tối

đa cho phép vượt quá chuẩn m về vi sinh vật Nếu vượt quá số này thì lô hàng được coi là không đạt

m: Là số lượng tối đa hoặc mức tối đa vi khuẩn tương ứng/g; các giá trị trên mức này có thể được chấp nhận hoặc không được chấp nhận

M: Là lượng thực phẩm được chấp nhận trong số thực phẩm không được chấp nhận Giá trị bằng M hoặc lớn hơn M trong bất kỳ mẫu nào đều không được chấp nhận vì ảnh hưởng tới sức khoẻ con người

1.2 Thực trạng ô nhiễm của một số chỉ tiêu vi khuẩn ở nước uống đóng chai (NUĐC)

1.2.1 Thực trạng ô nhiễm trên thế giới

Khi mới ra đời, nước đóng chai rất được ưa chuộng bởi tính tiện lợi và

dễ sử dụng Tại nhiều quốc gia, nước đóng chai được sử dụng nhiều hơn nước máy Tính trên toàn thế giới, Các tiểu vương quốc Arập thống nhất là quốc gia tiêu thụ nhiều nhất với 260 lít/người vào năm 2007, gấp 2 lần lượng sử

dụng nước đóng chai vào năm 2002 Ở châu Âu, Italy và Pháp là hai nước tiêu thụ nước đóng chai nhiều nhất Theo thống kê năm 2007 thì hằng năm mỗi người dân tiêu thụ: Canada 47 lít, Hoa kỳ 99 lít và Châu Âu 112 lít Tuy nhiên qua kết quả thăm dò của Leger Marketing (một hãng sản xuất nước đóng chai ở Canada) năm 2008, thì có tới 30% dân Canada không còn tin tưởng vào việc dùng nước đóng chai để uống nữa Hiện tượng này là do ngày càng xuất hiện nhiều sản phẩm nước đóng chai không đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm

Năm 2008, người Mỹ tiêu thụ 32,5 triệu lít NUĐC (trung bình 108 lít một người), tăng gấp đôi so với 10 năm trước Tại Mỹ, cơ quan kiểm soát thực phẩm và dược phẩm (FDA) chịu trách nhiệm quản lý nước đóng chai Tuy nhiên, FDA thừa nhận, không thể theo sát các công ty sản xuất nước đóng chai, kể cả việc yêu cầu họ báo cáo kết quả xét nghiệm chất độc hại Thêm vào đó, nước đóng chai không chịu các quy định khắt khe như nước uống trực tiếp từ vòi, chứng nhận của phòng thí nghiệm hoặc thông báo cho khách hàng trong vòng 24 giờ khi phát hiện thấy chất độc hại Theo kết quả điều tra cũng của cơ quan này: Nhãn mác của 1/3 sản phẩm nước đóng chai không hề cung cấp thông tin về xuất xứ Chỉ có 2 trong số 188 công ty nước đóng chai thuộc diện khảo sát có cung cấp thông tin về nguồn gốc cũng như cách xử lý

1.2.2 Thực trạng ô nhiễm trong nước

Vài năm trở lại đây, hầu hết người dân đã có thói quen sử dụng nước uống đóng chai, đóng bình thay thế nước mưa, nước máy hay nước giếng khoan nấu chín Việc sử dụng loại nước này không chỉ trong phạm vi gia đình

mà còn lan rộng đến các trường học, bến xe khách, trong các cơ quan, trong các dịp lễ hội , thậm chí còn theo chân người dân ra tận ngoài đồng trong mùa gặt Tuy nhiên thời gian gần đây, dư luận xã hội bàng hoàng, lo ngại với

những thông tin NUĐC của một số cơ sở sản xuất trong nước không đạt tiêu chuẩn ATVSTP đang được bày bán tự do trên thị trường

Sau đợt thanh tra, kiểm tra chất lượng vệ sinh NUĐC tháng 4/2009, Bộ

Y tế đã phát hiện 44/177 số mẫu (24,9%) vi phạm chất lượng như pH cao,

nhiễm vi sinh vật (Coliform, P aeruginosa) đây là những chất nguy hại đe

dọa tới sức khỏe và tính mạng của người tiêu dùng Tại Hà Nội, kiểm tra 134 mẫu có 19/134 mẫu vi phạm chất lượng (14,17%), trong đó có 14 mẫu vi

phạm về pH (10,44%), 5 mẫu vi phạm về Coliform (3,73%).

Theo báo cáo kết quả thanh tra Sở Y tế TP.HCM số 20/BC-T ra ngày 11/8/2008, trong 16 cơ sở sản xuất NUĐC, sản xuất nước đá, đến 66,7% trong mẫu nước đóng bình xét nghiệm vi sinh, hóa lý không đạt tiêu chuẩn cho

phép (bị nhiễm Coliform, không đạt chỉ tiêu pH, Crom) Cục An toàn vệ sinh

thực phẩm (Bộ Y tế) cho biết đợt kiểm tra liên ngành tháng 1 năm 2008 đã phát hiện tới 20% số cơ sở sản xuất thực phẩm và nước đóng chai không đủ điều kiện vệ sinh cơ sở Việc sử dụng nước không rõ nguồn gốc là không an toàn và dễ có nguy cơ ngộ độc mãn tính, suy nhược cơ thể

Ngày 10/4/2009 Thanh tra Sở Y tế Hà Nội và Sở Y tế TP Hồ Chí Minh

đã kiểm tra và đình chỉ thêm nhiều cở sở sản xuất nước đóng bình nhiễm bẩn hoặc không đạt chuẩn công bố Ngoài 9 mẫu nước có độ pH không đạt chuẩn

đã công bố trong số 134 mẫu nước lấy tại 134/243 cơ sở sản xuất, đoàn thanh

tra Sở Y tế Hà Nội phát hiện 5 mẫu nước nhiễm Coliform gây các bệnh tiêu

chảy, viêm đường ruột Sở Y tế Hà Nội đã xử phạt tiền 12,5 triệu đồng, buộc tiêu hủy sản phẩm và tạm đình chỉ sản xuất, lưu thông các sản phẩm trên Thanh tra Sở Y tế Hà Nội còn yêu cầu 3 cơ sở khác tạm đình chỉ sản xuất do không đảm bảo điều kiện an toàn vệ sinh

Trước các thông tin nước tinh khiết không đạt tiêu chuẩn ATVSTP, TP

Hà Nội đang tiếp tục mở cuộc tổng kiểm tra Hiện toàn thành phố có 192 cơ

sở sản xuất nước tinh khiết đã đăng ký, công bố chất lượng sản phẩm (Hà Nội

cũ có 132 cơ sở, Hà Tây cũ có 60 cơ sở) Ngoài các hãng nước giải khát có uy tín, đầu tư nhà xưởng và máy móc theo tiêu chuẩn, còn đại đa số các cơ sở sản xuất tư nhân đều chật hẹp, tạm bợ, nhếch nhác và không đảm bảo vệ sinh môi trường sản xuất, nên chất lượng sản phẩm khó có thể kiểm định

Theo đại diện của Viện Dinh dưỡng – Bộ Y tế: Với nước tinh khiết sản xuất theo dây chuyền hiện đại đảm bảo ATVSTP, phải dùng nước máy đóng chai Trong thành phần của nó có clo gây cứng nước, nên cần thiết bị ion hóa (làm mềm) cùng hệ thống máy móc hiện đại xử lý qua hệ thống thẩm thấu ngược và ozone, thanh trùng bằng tia cực tím Công nghệ này có giá vài trăm triệu đến hàng tỉ đồng, hoặc ít cũng phải vài chục triệu đồng Do đó, rất nhiều

cơ sở tư nhân chọn phương án dùng thẳng nước hút từ giếng khoan lên, thậm chí lọc bằng than hoặc sỏi, rồi xử lý bằng “công nghệ” khử khuẩn qua hệ thống máy dùng tia cực tím tạo ozone khử trùng, sau đó đóng chai, cung cấp

ra thị trường

Một thực trạng đáng lưu tâm là hiện nay rất nhiều cơ sở sản xuất nước đóng chai chưa được chứng nhận đủ điều kiện ATVSTP nhưng vẫn công khai hoạt động Thường là những cơ sở sản xuất nhỏ lẻ, tự phát Khi kiểm tra thì

đa số các dụng cụ sản xuất không đảm bảo vệ sinh: Bồn inox đã ố vàng vì phèn; việc súc rửa vỏ bình được thực hiện trực tiếp dưới đất, không có kệ cao theo quy định; tường nhà ẩm ướt, ố mốc, nước đóng chai hoàn chỉnh không

có khu vực để riêng biệt; nước rửa bình được mua ở chợ, không có nhãn mác; vật dụng để bừa bãi… Một nghịch lý là những cơ sở này khi đi đăng ký chất lượng sản phẩm, vẫn được cấp phép mà các cơ quan chức năng không có sự kiểm tra tại cơ sở sản xuất Điều đó cho thấy ngay cả các cơ quan chức năng vẫn không có biện pháp quản lý chặt chẽ đối với các cơ sở sản xuất nước đóng chai

Một nguyên nhân nữa khiến các sản phẩm nước đóng chai chưa được kiểm định chất lượng ATVSTP vẫn thịnh hành là do tâm lý chuộng hàng rẻ của người tiêu dùng vẫn rất phổ biến; đa số các khách hàng, thậm chí các cơ quan khi đặt mua nước vẫn chưa chú ý đến nhãn mác, tên tuổi cũng như thương hiệu của các hãng sản xuất nước Nắm bắt được yếu tố tâm lý này, các

cơ sở sản xuất nước nhỏ lẻ đã đưa ra những tên gọi na ná với những sản phẩm

có uy tín, gây nhầm lẫn cho người tiêu dùng như: Perfect, Aroma, Adaquata, Aquaso… hoặc tên rất “kêu” như: Việt Nhật, Việt Đức, Việt Pháp… Trên nhãn mác thường được in kèm dòng chữ quảng cáo như: sản xuất trên thiết bị hoàn toàn tự động, siêu lọc, tiệt trùng bằng tia cực tím , cộng thêm chiêu bán hàng với dịch vụ giao hàng tận nơi miễn phí , các NUĐC không đảm bảo ATVSTP này vẫn đang được tiêu thụ với số lượng lớn

Ở Thái Nguyên hiện nay rất nhiều các gia đình và cơ quan cũng đang

sử dụng các loại nước khoáng đóng chai với đủ loại kích cỡ, nhãn mác khác nhau như: Protech, Aura, Thành Phát,…Đa số những loại này có giá thành rất

rẻ chỉ từ 10-30.000 đồng 1 bình 21 lít, thậm chí chỉ 6000-7000 đồng 1 bình, nhưng chất lượng thì vẫn chưa được các cơ quan chức năng kiểm định

1.3 Tình hình nghiên cứu sự ô nhiễm của một số chỉ tiêu vi khuẩn ở nước đóng chai

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay trên thế giới cũng đã có nhiều đề tài nghiên cứu về vi sinh vật trong nước đóng chai

Nazih Daood [37] nghiên cứu đánh giá sự nguy hiểm của các loại vi khuẩn dị dưỡng trong NUĐC được tiêu thụ ở Syria Mục đích của đề tài cung cấp thông tin đầy đủ về chất lượng vi sinh của các sản phẩm nước và đánh giá mức độ nguy hiểm của chúng cho sức khỏe con người thông qua điều tra khả

năng kháng kháng sinh của các chủng Pseudomonas và Aeromonas Nghiên

cứu 430 mẫu nước khoáng đóng chai thuộc 10 hãng khác nhau ở thị trường Syria đã cho thấy 53,49% các chủng được tìm thấy kháng lại 1 hoặc 2 trong

số 20 kháng sinh thử nghiệm Phần lớn các chủng Pseudomonas và Aeromonas được tìm thấy có khả năng kháng axid Nalidixic, ampicillin và

novobiocin

Khan [35] nghiên cứu số vi khuẩn hiếu khí trong 4 thương hiệu nước khoáng đóng chai khác nhau Các mầm bệnh phân lập được bao gồm

Pseudomonas (có trong tất cả các thương hiệu), E coli (có trong 3 thương

hiệu) Cả 4 thương hiệu đều không đạt tiêu chuẩn sức khỏe cho phép

Silva [32] nghiên cứu độc lực của Pseudomonas được phân lập từ nước uống, nước máy, nước khoáng, cho thấy Pseudomonas có khả năng sản xuất

các yếu tố gây bệnh như: hemolysins, hemaglutinins, xytotoxins và khả năng bám dính của chúng vào bề mặt các tế bào biểu mô

Papapetropoulou [39] nghiên cứu sự xuất hiện và tính kháng kháng

sinh của Pseudomonas được phân lập từ nước uống ở Nam Hy Lạp Có 194

mẫu nước bao gồm 88 mẫu nước máy và 106 mẫu nước đóng chai không có

ga đã được tiến hành phân lập Pseudomonas trong 4 tháng 28/194 mẫu nước nhiễm P aeruginosa (chiếm 14,4%) Trong đó 8 mẫu (9%) được phân lập từ

88 mẫu nước máy và 20 mẫu (18,8%) từ 106 mẫu nước khoáng đóng chai

Một nghiên cứu khác về tính chất vi sinh và lý hóa của nước uống được thực hiện bởi Chan [22], nghiên cứu này tiến hành khảo sát 5 loại nước uống lọc (A1,B1,C1,D1,E1) và 5 loại nước máy không lọc (A2,B2,C2,D2,E2) được chọn ngẫu nhiên từ những ngôi nhà ở Klang Valley Mục đích của nghiên cứu

là xác định chất lượng vi sinh của nước uống lọc và phân tích độ đục, độ pH

và tổng số chất rắn lơ lửng (TSS) Các phân tích vi sinh đã được thực hiện để

theo dõi sự hiện diện của vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh như E coli, Streptococcus faecalis và P aeruginosa Tổng số Coliform và E coli được

phát hiện thấp hơn 4cfu/ml và không vượt quá giới hạn tối đa của tiêu chuẩn

ATVSTP Trong khi đó các mẫu nước đều âm tính với S faecalis và P aeruginosa Độ pH là hơi toan so với qui định (pH<6,5) TSS trong các mẫu

là thấp (1,0x10-4 – 2,2x10-3

mg/L) và tuân theo qui định

Nsanze [30] đã tiến hành nghiên cứu về chất lượng vi sinh của nước đóng chai từ các nguồn khác nhau ở các tiểu bang vương quốc Irắc Thí nghiệm được tiến hành trên 80 mẫu nước đóng chai thuộc 4 nhà máy sản xuất khác nhau Kết quả cho thấy 75% các bình 21 lít bị nhiễm 10 loại vi khuẩn khác nhau, trong khi 10-40% các chai 1,5 lít nhiễm bởi 2-4 loại vi sinh vật

S.C.Edberg [42] đã phân tích các đặc điểm độc tính của vi khuẩn phân lập từ 3 nguồn nước: nước đóng chai, nước làm mát và nước máy Các đặc điểm độc tính được xác định bằng phân tích enzyme, thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh (kháng sinh tự nhiên và kháng sinh bán tổng hợp Kết quả cho thấy tất cả các nguồn nước có lượng vi khuẩn bình thường, chỉ có 2%

nguồn nước đóng chai có P aeruginosa

Hernandez Duquino H [29] đã nghiên cứu về khả năng kháng kháng

sinh của Pseudomonas trong NUĐC Tác giả đã thu thập 8 loại nước đóng

chai, tiến hành thử nghiệm hàng tuần trong 8 tháng để xác định sự đa dạng

của Pseudomonas và sự nhạy cảm của chúng với 8 kháng sinh được dùng để điều trị nhiễm khuẩn Pseudomonas Kết quả cho thấy 9 chủng Pseudomonas

đã được phát hiện, với P stutzeri (24%) và P diminuta (18%) được phân lập

phổ biến nhất

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay các công trình nghiên cứu trong nước về sự ô nhiễm NUĐC

do vi khuẩn chưa nhiều Đa số các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở khảo sát tình hình sản xuất và tỷ lệ nhiễm vi khuẩn trong các mẫu nước đóng chai

Theo báo cáo kết quả thanh tra Sở Y tế TP.HCM số 20/BC-T ra ngày 11/8/2008, trong 16 cơ sở sản xuất NUĐC đến 66,7% trong mẫu nước đóng

bình xét nghiệm vi sinh, hóa lý không đạt (bị nhiễm Coliform, không đạt chỉ

tiêu PH, Crom) Đầu năm 2009 Sở Y tế TP HCM tiếp tục điều tra, lấy mẫu ngẫu nhiên xét nghiệm đã phát hiện 3 mẫu NUĐC đang được bán rộng rãi

trên thị trường, nhiễm Pseudomonas Kết quả xét nghiệm, lô nước sản xuất

ngày 3/1 nhãn hiệu Aquarphar của Công ty dược phẩm Tâm Đăng, quận 1; lô nước Aguavida loại 500 ml, sản xuất ngày 15/1 của Cơ sở Thuận Huy, Tân Định; và lô nước sản xuất ngày 2/1, nhãn hiệu Golf của Công ty Tân Tấn

Đức, ngụ tại quận 7, có chứa P aeruginosa

Ngày 10/4/2008, Thanh tra Sở Y tế Hà Nội và Sở Y tế TP Hồ Chí Minh

đã kiểm tra và đình chỉ thêm nhiều cở sở sản xuất nước đóng bình nhiễm bẩn hoặc không đạt chuẩn công bố Ngoài 9 mẫu nước có độ pH không đạt chuẩn

đã công bố, trong số 134 mẫu nước lấy tại 134/243 cơ sở sản xuất, đoàn thanh

tra Sở Y tế Hà Nội phát hiện 5 mẫu nước nhiễm Coliform

Hiện nay, toàn HN có hơn 130 cơ sở sản xuất nước uống tinh khiết đang hoạt động và có công bố chất lượng sản phẩm với Sở Y tế HN Còn về kiểm tra chất lượng thì định kỳ 6 tháng/lần, Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội

và các quận huyện tiến hành kiểm tra đột xuất các cơ sở sản xuất này

Ngày 18/2, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm (Bộ Y tế) cho biết, theo kết quả kiểm tra 464 cơ sở sản xuất nước đá, nước uống đóng chai năm 2008 của Trung tâm Y tế dự phòng TP.HCM, có 22/36 cơ sở sản xuất nước đá (chiếm 61,11%) và 51/77 cơ sở sản xuất NUĐC (chiếm 67,23%) không đạt ATVSTP

Các kết quả kiểm tra chất lượng vi sinh của nước đóng chai trên thị trường trong nước hiện nay, dù mới chỉ là bước đầu nhưng đã cho thấy chất lượng vệ sinh của nhiều loại nước đóng chai chưa đạt tiêu chuẩn cho phép,

việc quản lý và kiểm định không chặt chẽ khiến các loại nước này vẫn đang được tự do tiêu thụ trên thị trường

1.4.2 Ô nhiễm vi khuẩn từ nguồn nước (nước ngầm, nước bề mặt)

Sinh vật có mặt trong môi trường nước ở nhiều dạng khác nhau Bên cạnh các sinh vật có ích có nhiều nhóm sinh vật gây bệnh hoặc truyền bệnh cho người và sinh vật Trong số này, đáng chú ý là các loại vi khuẩn, virus và

ký sinh trùng gây bệnh tả, lỵ, thương hàn, sốt rét, siêu vi khuẩn viêm gan B, siêu vi khuẩn viêm não Nhật Bản Nguồn gây ô nhiễm sinh học cho môi trường nước chủ yếu là phân, rác, nước thải sinh hoạt, xác chết sinh vật, nước thải các bệnh viện Khi nước bị ô nhiễm sẽ làm mất cân bằng sinh thái tự nhiên của sông, suối, ao hồ , làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng dân cư và các hoạt động sản xuất

Nước bị ô nhiễm càng nhiều thì số lượng vi sinh vật càng tăng, ở tầng nước sâu sẽ ít vi sinh vật hơn lớp nước trên bề mặt Nước sinh hoạt ở các thành thị là nước máy được khai thác ở tầng nước ngầm sâu, đã được xử lý bằng hệ thống lắng lọc, khử khuẩn nên số lượng vi sinh vật có ít hơn các loại nước khác

Ðể đánh giá chất lượng nước dưới góc độ ô nhiễm tác nhân sinh học,

người ta thường dùng chỉ số coliform Ðây là chỉ số phản ánh số lượng vi khuẩn coliform trong nước, thường không gây bệnh cho người và sinh vật,

nhưng biểu hiện sự ô nhiễm nước bởi các tác nhân sinh học

1.4.3 Ô nhiễm vi khuẩn từ không khí

Không khí tại chuồng nuôi, sân bãi, nhà xưởng , có thể chứa nhiều vi sinh vật Độ ẩm không khí càng cao thì mật độ vi sinh vật càng lớn Đặc biệt môi trường không khí dễ làm phát tán nhanh chóng vi sinh vật Bên ngoài và bên trong khu vực sản xuất nước đóng chai có thể tìm thấy những vi khuẩn

gây bệnh như: Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, E coli

Ngoài ra, đất chứa một số lượng lớn vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau Những vi sinh vật này sẽ gián tiếp làm ô nhiễm thực phẩm Đầu tiên chúng nhiễm vào động vật sinh sống trên bề mặt, từ đó được phát tán vào không khí, nước và cuối cùng nhiễm vào thực phẩm [10], [12], [14]

1.4.4 Ô nhiễm vi khuẩn trong quá trình xử lý, sản xuất lưu thông và bảo quản

Việc xử lý nguồn nước phục vụ sản xuất NUĐC đúng quy trình kỹ thuật, đảm bảo vệ sinh sẽ hạn chế ô nhiễm Mặt khác khi lựa chọn nguồn nước cũng cần phải quan tâm tới sự ô nhiễm về các chỉ tiêu vi sinh vật, đặc

biệt là các vi khuẩn gây bệnh như Coliform, E coli, Salmonella, Streptococcus, Pseudomonas…

Đại diện Bộ Y tế cho biết: Tình trạng vi phạm quy định của của nhiều

cơ sở sản xuất, kinh doanh và chất lượng, ATVSTP của nước uống tinh khiết đóng chai hiện nay rất phức tạp cả về mức độ và quy mô Nguyên nhân của thực trạng trên là do đa số cơ sở sản xuất, chế biến, kinh doanh nước đóng chai là quy mô nhỏ và vừa, công nghệ còn chưa được đầu tư thoả đáng, địa bàn sản xuất không bảo đảm điều kiện vệ sinh môi trường, cơ sở hạ tầng (hệ

thống cống rãnh, thu gom, xử lý chất thải, diện tích mặt bằng chật hẹp, kết cấu nhà xưởng tạm…) Trách nhiệm của người sản xuất, chủ cơ sở sản xuất, kinh doanh nước đóng chai trong việc bảo đảm ATVSTP còn hạn chế, có tư tưởng đối phó với các quy định của pháp luật

Hơn nữa, hiện chưa có bộ máy quản lý hành chính thống nhất; chưa có

tổ chức hệ thống thanh tra chuyên ngành an toàn thực phẩm; chưa có đủ nguồn nhân lực và ngân sách hoạt động, trang thiết bị kiểm nghiệm thực phẩm Hoạt động thanh tra, kiểm tra, hậu kiểm chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm chưa thường xuyên và có hiệu quả thực sự

1.5 Ý nghĩa của sự ô nhiễm nước về chỉ tiêu Coliform

Coliform là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí

hoặc yếm khí tùy tiện, có khả năng lên men đường lactose sinh acid và sinh hơi ở 37o

C trong 24 - 48 giờ Trong thực tế phân tích, Coliform cũng được

định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant

Green Lactose Bile Salt Nhóm Coliform có mặt rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: Số

lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh

khác Nhiều nghiên cứu cho thấy khi số Coliform của thực phẩm cao thì khả

năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate thường được gọi chung là IMViC [18], [21]

Số lượng Coliform trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp của

nhóm vi khuẩn này có thể xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) [12], [28]

1.6 Vai trò của vi khuẩn E coli gây ô nhiễm nước

Trực khuẩn ruột già E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Escherichae, giống Escherichia, loài Escherichia coli Trong các vi khuẩn đường ruột, E coli phổ biến nhất còn có tên là Bacterium coli commune (vi khuẩn thường trú trong ruột già của động vật máu nóng), Bacillus coli communis do Theodor Escherich phân lập được đầu tiên vào năm 1885 từ phân trẻ em E coli thường xuất hiện rất sớm ở phần ruột sau của người và

động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2h), ít khi ở dạ dày hoặc ruột non Về mặt huyết

thanh học, người ta chia các chủng vi khuẩn E coli thành nhiều serotype khác

nhau Cho đến nay đã phát hiện được 279 serotype, trong đó có 250 serotype

có độc lực và có vai trò quan trọng trong một số bệnh của gia súc

Từ ruột già, vi khuẩn E coli thường xuyên được bài xuất ra ngoài môi trường Do vậy, chỉ số E coli trong nước là một tiêu chuẩn để đánh giá mức

độ ô nhiễm (hay không ô nhiễm) về mặt vi sinh của nguồn nước đó [12]

E coli là nguyên nhân gây ra một số bệnh ở người và động vật

1.6.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Theo Bergey’s Manual (1957)[21], Nguyễn Vĩnh Phước (1970)[14], Nguyễn Như Thanh (1997)[17], đều cho biết: E coli là trực khuẩn hình gậy

ngắn, di động được do có lông, vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp

mô Đường kính ngang tế bào dưới 1m, chiều dài thay đổi, kích thước trung bình từ 0,3-0,6 x 2-3m

Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu Nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày có thể thấy giáp mô, khi soi tươi không nhìn thấy được

1.6.2 Tính chất nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường,

có thể sinh trưởng phát triển được từ 5-45o

C, thích hợp ở 37oC, pH 7,2-7,4

- Môi trường nước thịt: Sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ nuôi

cấy, vi khuẩn E coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro

trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối (phản ứng Indol dương tính)

- Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn phát triển, sau 24h tạo thành những khuẩn lạc dạng S (Smooth), hơi vồng, tròn trơn nhẵn, đường kính 2-3mm, màu xám nhạt

- Môi trường thạch MacConkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 37oC, hình thành khuẩn lạc dạng S, màu đỏ cánh sen (do lên men đường lactoza sản sinh axit), xung quanh có vùng mờ sương (do lên men đường lactoza, sinh hơi)

- Môi trường thạch Brilliant green: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh

- Môi trường thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn E coli

hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1-2

mm Khuẩn lạc dạng S hoặc M (Mucoid) (11-25%), có thể dung huyết hoặc không tuỳ thuộc vào chủng Nếu nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày sẽ thấy giáp mô của vi khuẩn

- Môi trường thạch Deoxycholate citrat: Vi khuẩn E coli không mọc do

không sử dụng được nguồn cabon từ citrat

- Môi trường thạch Triple Sugar Iron (TSI): Vi khuẩn phát triển nhưng không sản sinh H2S, không làm đen môi trường (vi khuẩn Salmonella sinh

H2S nên làm đen môi trường)

E coli lên men đường lactoza, maltoza, mannit, mannoza, sorbitol, xyloza, saccaroza (26-70%) Hầu hết E coli đều lên men sinh hơi đường

lactoza

- H2S âm tính

- Indol dương tính

- VP âm tính

- MR dương tính

- Ureaza âm tính

- Citrat âm tính

- Sữa tươi: Đông tụ sau 24h/37oC

- Nghiệm pháp IMViC xác định vi khuẩn: Indol, MR, VP, Citrat.(Nguyễn Như Thanh, 1997) [17]

1.6.3 Sức đề kháng

Như các vi khuẩn không sinh nha bào khác, E coli không chịu được

nhiệt độ Đun 55o

C/1h, 60oC/30 phút, đun sôi 100oC chết ngay

Các chất sát trùng thông thường axit phenic, formol 0,3% diệt vi khuẩn sau 5 phút Ở ngoài môi trường vi khuẩn có thể tồn tại đến 4 tháng

1.6.4 Tính gây bệnh

E coli có sẵn trong ruột của động vật, bệnh xảy ra do nhiễm trùng kế

phát dưới ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Dinh dưỡng, sự thiếu hụt kháng thể sữa đầu, khí hậu thời tiết, nhiệt độ, ẩm độ, trạng thái stress, loạn khuẩn đường

ruột, sự có mặt của chủng E.coli độc…

E coli có thể gây bệnh cho gia súc non (lợn, bê, dê, cừu, chó) dưới 1 tuần tuổi, gây bệnh cho gia cầm (gà) ở mọi lứa tuổi Thể bệnh do E coli gây

ra ở gia súc, gia cầm mỗi lứa tuổi khác nhau cũng sẽ khác nhau, cả về các yếu

tố gây bệnh của vi khuẩn, mức độ trầm trọng, đặc điểm triệu chứng lâm sàng Chẳng hạn: Gây bệnh cho lợn dưới 1 tuần tuổi, ở 3 thể: Thể bệnh tiêu chảy tỷ

lệ chết 90-100%; thể nhiễm trùng máu; thể viêm màng não Gây bệnh sau cai sữa, thể bệnh phù đầu, triệu chứng thần kinh, chết đột ngột [ 8], [10], [13]

E coli gây bệnh cho người ở các thể bệnh: Tiêu chảy, viêm đường tiết

niệu, sinh dục, nhiễm trùng huyết, nhiễm độc huyết và ngộ độc thực phẩm

Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh hai loại độc tố: Độc tố chịu nhiệt

(Heat Stable Toxin - ST) và độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT)

Sussman (1985) [41]cho biết: Những chủng E coli sản sinh độc tố là nguyên

nhân gây nên bệnh tiêu chảy ở người Trong đó, độc tố chịu nhiệt (ST) chịu được 1200

C trong vòng 1h và bền vững khi ở nhiệt độ thấp (bảo quản ở

200C) Còn độc tố không chịu nhiệt (LT) bị vô hoạt ở 600C trong vòng 15 phút

E coli được coi như là nhân tố chỉ điểm trong ATVSTP Mặc dù E coli có xuất hiện trong nước nhưng lại không liên quan trực tiếp đến sự xuất hiện của vi khuẩn gây bệnh Thực phẩm đã bị nhiễm E coli với số lượng lớn

chứng tỏ mối nguy hiểm về khả năng chứa các loại vi khuẩn gây bệnh Do đó

việc xác định tổng số E coli là việc rất quan trọng và bắt buộc Đây là một

trong những tiêu chuẩn cần thiết để đánh giá tình trạng ATVSTP [9], [10]

1.7 Một số hiểu biết về ngộ độc thực phẩm do E coli gây ra

- Trúng độc E coli xảy ra khi người ta ăn phải thực phẩm có E coli gây

độc còn sống (đây là những vi sinh vật có nội độc tố) Đặc điểm của các bệnh này là thời gian ủ bệnh và bị bệnh ngắn (Hoàng Thu Thuỷ, 1991 [19])

- Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm:

Theo Lê Văn Tạo (1993)[16], Acres S.D (1985)[20]: E coli có thể

sinh trưởng trong thực phẩm, xâm nhập trực tiếp hay gián tiếp vào trong ruột của con người Trong ruột khi có đủ các điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nhân lên với số lượng lớn gây viêm niêm mạc ruột Cũng tại đây vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nước ở ruột làm cho nước và chất điện giải không hấp thu từ ruột vào cơ thể, ngược lại thẩm xuất từ cơ thể vào ruột Nước tập trung vào ruột làm cho ruột

căng lên, cộng với khí do vi khuẩn E coli trong ruột lên men tạo ta cũng làm

cho ruột tăng lên Sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích vào hệ

thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột mạnh đẩy nước và phân ra ngoài gây hiện tượng tiêu chảy Sau khi gây ra tiêu chảy và thay đổi

về tổ chức bệnh lý ở hệ thống tiêu hoá thì tuỳ khả năng gây bệnh của vi khuẩn

và sức đề kháng của vật chủ mà vi khuẩn tiếp tục xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn gây dung huyết hay vào cơ quan nội tạng gây bệnh toàn thân hoặc chỉ cư trú ở ruột gây bệnh đường tiêu hoá

- Triệu chứng ngộ độc do E coli gây ra:

Thời kỳ ủ bệnh 2 - 20 giờ Người ngộ độc thấy đau bụng dữ dội, đi phân lỏng, ít khi nôn mửa, thân nhiệt có thể hơi sốt Trường hợp nặng bệnh nhân có thể sốt cao, người mỏi mệt, chân tay co quắp vã mồ hôi [9], [12]

1.8 Vai trò của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây ô nhiễm nước

Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) là một vi khuẩn phổ biến gây

bệnh ở động vật và con người Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da của người và động vật Vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể sống trong điều kiện thiếu oxy, do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo Vi khuẩn này có nhu cầu dinh dưỡng đa dạng, gây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung thường là gây viêm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào một số cơ quan của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây rối loạn chức năng sinh

lý, gây nhiễm trùng huyết, nhiễm độc huyết và có thể gây chết

P aeruginosa làm yếu hệ thống miễn dịch ở người, nhiễm trùng hệ thống hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng máu P aeruginosa kháng lại được nhiều thuốc kháng sinh làm cho việc chữa trị bệnh bằng thuốc kháng sinh trở lên khó khăn hơn P aeruginosa gây bệnh bởi một

số yếu tố độc lực như ngoại độc tố (endotoxins), độc tố gây dung huyết (hemolysins), độc tố đường ruột (enterotoxins), các yếu tố bám dính (adherence factors) [23], [24], [26], [34]

1.8.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Trực khuẩn thẳng, hơi cong, 2 đầu tròn, kích thước 0,5 – 1µm x 1 - 5

µm Có một lông ở một đầu, di động, ít khi có vỏ, không sinh nha bào Nhuộm bắt màu Gram (-)

1.8.2 Tính chất nuôi cấy

Theo M E Z D Silva (2008) [33]: P aeruginosa mọc dễ dàng trên

các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí Nhiệt độ thích hợp 37o

C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 - 420C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0

- Trên môi trường thạch thường: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, hơi lồi Có xu hướng mọc lan, 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khi có loại khuẩn lạc nhầy Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai

- Trên môi trường thạch MacConkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 37oC, hình thành khuẩn lạc dạng S, màu trắng đục (do không có khả năng lên men đường lactose)

- P aeruginosa lên men đường mannitol, galactose

- Không lên men đường lactose (-)

1.8.4 Khả năng gây bệnh

P aeruginosa thường sống ở trong đất, nước, trên da và niêm mạc

người và động vật, là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện, khi cơ thể bị suy

giảm miễn dịch, bị mắc các bệnh ác tính hoặc mạn tính,… P aeruginosa có ở

nhiều nơi, nhiều dụng cụ máy móc trong bệnh viện như ống thông, máy hô hấp nhân tạo,… Chúng xâm nhập vào cơ thể qua da (nhất là sau khi bị bỏng) hoặc qua vết thương, do phẫu thuật Tại chỗ vi khuẩn gây viêm có mủ điển hình là mủ có màu xanh Nếu cơ thể giảm sức đề kháng, vi khuẩn xâm nhập

và gây viêm các cơ quan như viêm bàng quang, tai giữa, màng não, màng bụng, … Có thể vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc

Nhiễm khuẩn do P aeruginosa ngày càng trở nên trầm trọng do sự kháng

kháng sinh rất mạnh của vi khuẩn Về cơ chế gây bệnh, có giả thiết cho rằng các sản phẩm ngoại tiết như ngoại độc tố, yếu tố tan máu, sắc tố, độc tố ruột

có vai trò chủ yếu

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nước uống đóng chai (đựng trong bình nhựa có thể tích 21 lít) phục vụ tại 1

số cơ quan trên địa bàn TP Thái Nguyên

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu:

- Bộ môn Công nghệ vi sinh, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên

- Một số cơ quan sử dụng nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 4/2009 đến hết tháng 8/2010

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu nước lấy trực tiếp tại một số cơ quan có sử dụng nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên

- Hóa chất, môi trường sử dụng trong phòng thí nghiệm

- Khoanh giấy kháng sinh

- Động vật thí nghiệm: Chuột bạch khỏe khối lượng từ 18 – 20 g/con

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy trong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO):

- Áp dụng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước sinh hoạt QCVN 02: 2009/BYT [2]

- Áp dụng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước ăn uống QCVN 01: 2009/BYT [1]

- Áp dụng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước khoáng thiên nhiên đóng chai TCVN 6213:2004 [3]

2.3.1 Phương pháp điều tra tình hình sản xuất và phân phối sản phẩm nước uống đóng chai trên địa bàn TP Thái Nguyên

Chúng tôi tiến hành điều tra theo phương pháp ngẫu nhiên để xác định

số lượng các thương hiệu nước uống đóng chai, tỷ lệ các cơ quan, trường học

có sử dụng sản phẩm

2.3.2 Phương pháp thu mẫu nước để phân tích vi khuẩn

Mở vòi nước cho chảy khoảng 1 phút Sau đó mở nắp chai (không sờ vào bên trong nắp), cho nước chảy vào chai Lưu ý chai đựng mẫu phải được khử trùng trước Ướp lạnh mẫu trong thùng đá và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 6 tiếng [5]

2.3.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu Coliform

- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 độ pha loãng thập phân được ủ trong ống nghiệm có chứa môi trường Brilliant green bile broth 2% có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện của vi khuẩn trong từng ống thử nghiệm, đây là các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng

và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1ml mẫu ban đầu

- Môi trường và hoá chất:

+ Môi trường Brilliant green Bile 2% Broth được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham

+ Dung dịch nước muối sinh lý 0,9% (NaCl 0,9%)

, 10-2

+ Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu pha loãng 100, 10-1, 10-2, vào 3 ống nghiệm khác nhau, mỗi ống chứa 5ml môi trường Brilliant Green Bile 2% Broth Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3x3 hay 9 ống nghiệm) Chú ý thay đầu pipet sau mỗi khi cấy 1 mẫu và phải ghi lý lịch, đánh số thứ tự cho các ống nghiệm

+ Sau khi cấy, các ống nghiệm được bồi dưỡng ở 370

C/24-48h

- Đọc kết quả: Các ống sinh hơi trong ống Durham và đổi màu môi trường là các ống dương tính

VD: + 3 ống cấy 1ml mẫu nguyên đều dương tính, ghi 3

+ 3 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 10-1

đều dương tính, ghi 3

+ 3 ống cấy 1ml mẫu pha loãng 10-2

chỉ dương tính 1, ghi 1 Chọn 3 3 1 để tra bảng MPN Kết quả tra bảng MPN được 43/100ml có

nghĩa đã xác định 4.300 vi khuẩn nhóm Coliform/1ml mẫu nước [4], [31]

2.3.4 Phương pháp xác định chỉ tiêu E coli (fecal Coliform):

Các bước tiến hành tương tự với Coliform, chỉ khác sau khi cấy chuyển

sang môi trường Brilliant green bile broth 2%, các ống nghiệm sẽ được bồi dưỡng ở 440

C/24-48h, cách tính kết quả tra bảng MPN [27]

2.3.5 Phương pháp xác định chỉ tiêu P aeruginosa

Mẫu nước pha loãng được cấy trên thạch máu, mỗi mẫu cấy 0,1ml (100µl), bồi dưỡng ở 370C/24h, đọc kết quả [6]

2.3.6 Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng E

coli phân lập được [7]

- Pha môi trường Macconkey:

+ Cách pha: Cân 50 gam môi trường vào 1000ml nước cất

Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121o

C trong 15 phút

Đổ nhanh ra các đĩa thạch, để nguội trong phòng vô trùng Bảo quản ở nhiệt độ 4o

C

+ Sau khi nuôi cấy E coli phân lập được trên đĩa thạch Macconkey ở

37oC trong 24h, thấy hình thành khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn, gọn, nhẵn, hơi lồi

- Môi trường Brilliant Green Bile Broth 2%:

+ Cách pha: Cân 40gam môi trường vào 1000ml nước cất lắc cho đến khi tan hoàn toàn

Chia ra các ống nghiệm vô trùng (5ml/1 ống)

- Nhuộm Gram xác định hình thái và tính chất bắt màu thuốc nhuộm

của vi khuẩn E coli:

Ghi tên mẫu hoặc số nhận diện, ngày thử nghiệm lên phiến kính sạch

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nước cất vô trùng đặt vào giữa phiến kính Lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ khuẩn lạc và dàn mỏng với nước cất trên phiến kính Để dịch khuẩn tự khô hoàn toàn Sau đó hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần (không để tiêu bản quá nóng)

+ Nhỏ 1 giọt dung dịch Gentian lên lam kính để lưu lại trong thời gian

1 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất

+ Cố định màu vi khuẩn bằng cách phủ dung dịch lugol lên lam kính trong thời gian 1 phút rồí rửa lại bằng nước cất

+ Tẩy mầu nhanh bằng cồn Axeton trong vòng 15 - 20 giây Sau rửa lại bằng nước cất nhẹ nhàng

+ Nhỏ 1 giọt dung dịch fucsin lên lam kính trong thời gian 2 phút Sau

đó rửa sạch bằng nước cất

+ Để khô tự nhiên

+ Nhỏ 1 giọt dầu bạch dương lên lam kính, quan sát hình thái và tính chất bắt mầu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100)

Dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100, sau khi nhuộm Gram vi khuẩn

E coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, tròn 2 đầu, bắt màu đỏ của thuốc

nhuộm fucsin (gram âm).

- Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar):

+ Cách pha: Cân 65 gam môi trường vào 1000ml nước cất

Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn

Chia ra các ống nghiệm vô trùng

Hấp 121o

C trong 15 phút

Để nghiêng ống thạch đến khi khô

Bảo quản ở nhiệt độ 4o

C

Dùng que cấy vô trùng chọn các khuẩn lạc đặc trưng từ môi trường Macconkey, cấy lên môi trường TSI Đưa que cấy sâu thẳng dưới đáy ống nghiệm, phần thạch nghiêng phía trên cấy theo đường rích rắc, bồi dưỡng ở tủ

ấm 37o

C trong 18 - 24 giờ Sau đó mang ra quan sát và đọc kết quả:

+ Phản ứng lên men đường:

Phần thạch nghiêng: Sau khi cấy 24h môi trường chuyển màu vàng chanh là do lên men đường lactose